来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用的制作方法

来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来自冬虫夏草中国被毛孢参与水解大分子蛋白质生成小分子蛋白质的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，编码基因如SEQ?ID?No.1所示。本发明从原理上对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的过程进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的丝氨酸蛋白酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节蛋白水解酶基因的表达，赋予宿主丝氨酸蛋白酶的高表达性，为扩大丝氨酸蛋白酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【专利说明】来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用
(—)

【技术领域】
[0001]本发明涉及来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。
(二)

【背景技术】
[0002]冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。
[0003]冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
[0004]但是，对冬虫夏草中国被毛孢机制机理的研究几乎为空白，尤其在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的机制机理上，以及对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染机制中的作用的研究。
[0005]丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物、植物、细菌、病毒、真菌中，并且参与生命的各种反应，比如蛋白质翻译后后加工、细胞分裂、病原体感染、组织降解、细胞凋亡等，可见丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值。
[0006]丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用，还在胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用。丝氨酸蛋白酶超家族的成员多而广，它们的活性部位都含Ser> His、Asp,并具有相同的催化机制,但是它们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性。
[0007]丝氨酸蛋白酶在结构上为全β蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域(N结构域和C结构域)构成。由于两个结构域在结构上存在着差异，它们在功能和进化上的作用也就不同。
[0008]1986年，Gershenfeld HK等人在《Science》上发表论文,他们通过RNA杂交竞争协议从小鼠的细胞毒性T淋巴细胞互补DNA文库中分离出的克隆可以编码一个新的丝氨酸蛋白酶，并且对它进行了克隆，该基因的碱基序列编码约为25700道尔顿的氨基酸序列，25%至35%属于丝氨酸蛋白酶家族，保守的活性位点残基为His57，Aspl02和Serl95的胰凝乳蛋白酶。Southern杂交分析表明，这个基因在人类，小鼠和鸡种保守。此丝氨酸蛋白酶可能在淋巴细胞的裂解和溶解级联有作用。
[0009]1999年,Kyoko Yamashiroa等人从人结肠腺癌细胞中克隆到了一个新的丝氨酸蛋白酶，该序列包括155bp的5’非编码区和一个位于551bp的3’非编码区后的732bp长的开放阅读框非编码区，预测的蛋白由244个氨基酸组成，和丝氨酸蛋白酶家族的其他成员显示一定的相似性，和发现的其他类似胰蛋白酶一样，这种酶含有作为必要的氨基酸残基的活性的催化三联体。
[0010]2003年，李文辉等人利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法，扩增出5个竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒丝氨酸蛋白酶的cDNAs,将扩增的cDNA片段克隆入pGEM-T载体中，再经末端终止法测定核苷酸序列，推导出5个丝氨酸蛋白酶的全序列。5个丝氨酸蛋白酶分别含有1-6个N-型糖基结合位点，表明它们的计算分子量与纯化蛋白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60% -90%。
[0011]2004年，储卫华等人根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87%，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。
[0012]2005年，李江等人从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株(Streptomyces fradiae var.kll)中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列，设计简并引物，PCR扩增得到部分基因序列，通过构建基因文库，获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2 (EMBL收录号AJ784940)，开放阅读框全长924bp，包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列，其中成熟蛋白编码基因长576bp，编码191个氨基酸，理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达，酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性，证明了克隆基因的生物学功能。
[0013]2008年，雷迎峰等人在大肠杆菌中进行了 HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达并进行纯化。根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求，通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因。合成相应引物，利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因，克隆入原核表达载体pRSET-A，将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL21 (DE3)大肠杆菌，并诱导表达与纯化。成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a，重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后，表达产物经SDS-PAGE和Western_blot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶，并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶。获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础。
[0014]2011年，王俊伟等人根据已经报道的少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株(XJ-XA)丝氨酸蛋白酶(命名为Aozl)基因序列进行了扩增，并与国内外少孢节丛孢菌不同地域分离株相应序列进行了同源性分析，构建该基因系统进化树。结果显示，XJ-XA Aozl基因全长为1344bp，包含2个外显子和I个63bp的内含子(第517~579位核苷酸)，编码426个氨基酸。系统发生分析发现，少孢节丛孢菌不同地域分离株Aozl基因序列具有较高的亲缘性，与其他捕食线虫性真菌Aozl基因亲缘性较远。此项研究为研发家畜线虫病生物防控制剂奠定了前期基础。
[0015]2012年，刘海明等人利用粉纹夜蛾Trichoplusia ni围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑觸金龟Holotrichia oblita中肠cDNA表达文库,首次得到编码华北大黑觸金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列，命名为HoSPl (GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明，该基因长902bp，开放阅读框(ORF)长783bp，编码260个氨基酸，推测分子量和pi值分别为26.7kDa和4.19，不含有N-糖基化位点，但在Thrl57处有一个O-糖基化位点，含有6个保守的半胱氨酸残基，组成3对二硫键，对于维持蛋白质的三级结构起着重要的作用。通过与几种丝氨酸蛋白酶的比对发现，该酶具有组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)催化中心,与褐新西兰肋翅觸金龟Costelytra zealandica的14种丝氨酸蛋白酶有明显的相似性，其中与CzSP3的序列一致性最高，为52.47%。把该基因与pET21b载体重组后，进行体外表达，以BTEE为底物，测得该酶的活力为0.0378 μ mol/mg.min。
[0016]2010年，Xiaoqing Zhang等人从食用菌真姬燕的新鲜子实体中分离到了一个28kDa的丝氨酸蛋白酶。根据N-末端测序序列，结合使用RACE和TAIL-PCR方法，成功克隆到了这个丝氨酸蛋白酶了基因。这个蛋白酶的序列含有19个氨基酸的信号肽序列，一个82个氨基酸的前区序列，诱导后的蛋白酶具有285个氨基酸和28.07kDa的分子量，并且拥有枯草杆菌蛋白酶家族(S8A)的三个活性位点特征。
[0017]2013年,Ying Huang等人从中华绒螯蟹中克隆到了一个域为特征的发夹状丝氨酸蛋白酶，并且对它进行了特性研究。
[0018]但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中丝氨酸蛋白酶的基因相关信息。
(三)


【发明内容】

[0019]本发明目的是针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制的一种丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。
[0020]本发明采用的技术方案是:
[0021]来自冬虫夏草中国被毛孢参与水解大分子蛋白质生成小分子蛋白质的丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(记为serA蛋白)。该酶可催化断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。
[0022]SEQ ID N0.1 序列如下:PDLSPATVKI TNDDSPNKME NSffLLVffKNALADDAIKARRDDFAATLRKR NLGKRDVNGN TIPMEAIHYD IGSLRMTVCNADAKTMNLMV SNAIDAVDYVEANEffIDMFR TENETEAPPA VNATAVADGAEASPGEDGEG TVVYIVDTGI NVNHVAFEDR ATMIANLVRGESEQDLNGHGTHCAGSAAGK EIGVATKALI RGVKVLNAKG SGG⑶SIIGG FRAACNDVKKNGFEGKCVVSMSLGTGRSNA INNAAKQMGQ CGCAIWAAG NDGKDASTVSPASSDDVITV GATDARTNQL AAFSNTGPLVDISTNGVNVI SADANDITGTKELTGTSMSA PQIAGIALVA LNDVDLDCTI DCTDRMRDFLQKKAQQEKPIAISS⑶SDTT PLQIDATDKA PTDPDGPTPI SKKGQQGKQG KKQTGQKGR*
[0023]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0024]本发明还涉及所述的丝氨酸蛋白酶在生物催化水解大分子蛋白质制备小分子蛋白质中的应用，优选所述丝氨酸蛋白酶能够断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。由于昆虫幼虫的表皮主要由蛋白质和几丁质组成，虫生真菌在侵染昆虫幼虫的时候会分泌丝氨酸蛋白酶来降解虫体表皮的蛋白质，从而增加虫生真菌侵染力，可应用于生物防治害虫。所述的应用为:将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)悬浮，超声细胞破碎后，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以10.00mg/mL酪素溶液为底物，40°C下水浴反应，反应结束后,将反应液离心，取上清液即获得含酪氨酸的混合液，将混合液分离纯化，获得酪氨酸，所述分离纯化的方法为本领域公知，通常采用亲和层析的方法；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步骤制备:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入10ml容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度；所述氢氧化钠水溶液的体积用量以酪素质量计为5ml/g。
[0025]所述底物的用量以酪素质量计，所述酪素的初始浓度为5mg/mL (终浓度)，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为20g/L(终浓度)。
[0026]所述催化剂按如下方法制备:将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌接种于含终浓度50 μ g/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养过夜，取ImL培养物，将其转接(体积接种量2% )于50mL含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养至菌体浓度0D600为0.6~0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40%、破Is停Is条件下超声破碎(优选3次，每次5min)，取破碎混合液离心，取上清液即为催化剂。
[0027]本发明还涉及编码所述丝氨酸蛋白酶的基因。具体的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所不(记为serA基因，serA基因编码serA蛋白)。
[0028]由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID N0.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
[0029]所述的丝氨酸蛋白酶编码基因在构建能够生物催化水解大分子蛋白质制备小分子蛋白质的基因工程菌中的应用。所述的基因可用于构建能够生物催化断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质的基因工程菌，以扩大丝氨酸蛋白酶的应用。所述催化水解优选在40°C下进行。具体为:构建含有所述丝氨酸蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coli BL2KDE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有丝氨酸蛋白酶基因的菌体细胞。
[0030]本发明的要点在于提供了 SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
[0031]能够提供本发明所述冬虫夏草丝氨酸蛋白酶及其编码基因的菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis) L0106,该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNo:M2011278,已在先前申请的专利CN102373190A中披露。
[0032]本发明的有益效果主要体现在:本发明从原理上对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的过程进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的丝氨酸蛋白酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节蛋白水解酶基因的表达，赋予宿主丝氨酸蛋白酶的高表达性，为扩大丝氨酸蛋白酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
(四)

【专利附图】

【附图说明】
[0033]图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；
[0034]图2为中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图；
[0035]图3为丝氨酸蛋白酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；
[0036]图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET_28a物理图谱；
[0037]图5为重组克隆质粒pMD18_T/serA物理图谱；
[0038]图6为重组表达质粒pET_28a/serA构建过程示意图；
[0039]图7为重组表达质粒pET_28a/serA物理图谱；
[0040]图8为丝氨酸蛋白酶蛋白的SDS-PAGE图。
(五)

【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0042]实施例1 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养
[0043]菌株来源:首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了 L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis),该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2011278,已在先前申请的专利CN102373190A 中披露。
[0044]将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为:葡萄糖2.0% (w/v，l%表示10mL培养基中含有lg，下同)、玉米粉
1.0%、土豆汁0.5%、糊精0.5%、酵母粉0.5%、麸皮1.0%、蚕蛹粉2.0%、蛋白胨1.0%、硫酸镁0.05%、磷酸二氢钾0.05%、琼脂粉1.0%，余量为水；在12~16°C培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0 %、糖蜜1.0 %、蚕蛹粉0.5 %、黄豆饼粉1.0%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.01 %、磷酸二氢钾0.02%，余量为水；置于摇床上，温度12~16°C培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。
[0045]实施例2 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取
[0046]用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为:
[0047]I)液氮研磨:取Ig新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入ImL TRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。
[0048]2) RNA分离:加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2~3min，4 V、12000rpm离心15min,分层,取上层水相,约600 μ L。
[0049]3) RNA沉淀:加入500 μ L异丙醇，在冰上静置lOmin，4°C、12000rpm离心10min，弃上清。
[0050]4) RNA洗涤:加入lmL75% (v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置lOmin，4°C、7500rpm离心15min ;重复上面洗漆步骤,再洗一遍。
[0051]5)溶解RNA:将离心管置于冰上敞开干燥5~lOmin，加适量DEPC水溶解。
[0052]实施例3 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序
[0053]提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentat1nbuffer将mRNA打断成短片段(200~700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链,然后合成第二条cDNA链,再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GA IIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads,备以后续分析。
[0054]实施例4 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装
[0055]使用短reads 组装软件 SOAPdenovo (Li, Zhu et al.De novo assembly ofhuman genomes with massively parallel short read sequencing[J].GenomeRes, 2010, 20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig,通过paired-endreads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理,最后得到含N最少,两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue〈0.00001),取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，贝丨』按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的 Unigene 用软件 ESTScan (Iseli, Jongeneel et al.ESTScan:aprogram for detecting, evaluating, and reconstructing potential coding reg1ns inEST sequences[J].1n Proceedings of9th Internat1nal Conference on IntelligentSystems for Molecular B1logy.AAAIPress, Menlo Park, CA, pp.1999, 138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5’到3’方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。
[0056]实施例5 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释
[0057]功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和Gene Ontology(GO)功能注释。首先,通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG (evalue〈0.00001),得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对,预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息,使用Blast2G0软件(Conesa, Gotz et al.Blast2G0:auniversal tool for annotat1n, visualizat1n and analysis in funct1nal genomicsresearch [J].B1informatics, 2005, 21 (18): 3674-3676.)得到 Unigene 的 GO 注释信息。得到每个Unigene 的GO注释后，用 WEGO软件(Ye, Fang et al.WEGO: a web tool for plottingGO annotat1ns [J].Nucleic Acids Research, 2006，34:293-297.)对所有 Unigene 做 GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。
[0058]实施例6 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢侵染机制和过程的分析
[0059]图2是中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫机制和过程注释图，每年7-8月冬虫夏草子实体成熟后，子囊孢子弹出随雨水渗入土中，经过发育变化形成分生孢子。此时如附在蝙蝠蛾幼虫表，经2-3天后即开始萌发伸出芽管，通过酶和机械力的协同作用侵入幼虫体内。吸收体液养分生长并断裂成菌丝段，以酵母状出芽发迅速增值不断扩大体积。前期其代谢产物在血液中不断积累，造成血液酸碱度变化，使血液失去原有的透明性而变浑浊。但不产生毒素与寄主幼虫共生。后期，由于菌体增多，弥漫于幼虫血腔，肠道亦受机械封阻，血液梨花性质发生改变造成病理伤害，出现代谢紊乱，幼虫行动痴呆，不取食。这时菌丝体迅速向体表蔓延，在幼虫体表上出现细线稀疏的白色菌丝，菌丝体大量吸收幼虫体内水分，致使幼虫干硬僵死形成僵虫(即菌核)。通常，中国被毛孢会产生一些降解寄主昆虫的细胞壁、细胞膜和细胞内物质的酶，如几丁质酶、丝氨酸蛋白酶、脂酶等，以降解体壁含有的几丁质、蛋白质、类脂等成份，从而有利于侵袭。从中国被毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了丝氨酸蛋白酶的Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框(SEQ ID N0.2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID N0.1)。
[0060]实施例7 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢丝氨酸蛋白酶基因引物设计
[0061]运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢合成代谢侵染机制的丝氨酸蛋白酶基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列:
[0062]serA 基因:正向引物 5’ AGAGAATTCCCGGACCTGTCGCCGGCCAC3’
[0063]反向引物 5 ’ ATAGCGGCCGCTTACCGTCCTTTTTGCCC3，
[0064]serA 基因长度为 l290bp。
[0065]实施例8 百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备
[0066]先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。
[0067]米用PrimeScriptlstStrand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下:
[0068]I)在Microtube管中配制下列混合液。
[0069]

【权利要求】
1.一种来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1 所示。
2.如权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶在生物催化酪素制备酪氨酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为:将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以10.00mg/mL酪素溶液为底物，40°C下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含酪氨酸的混合液；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步骤制备:取1.0OOg酪素用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入10ml容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度；所述氢氧化钠水溶液的体积用量以酪素质量计为5ml/g。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述底物的用量以酪素质量计，所述酪素的初始浓度为5mg/mL，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计，终浓度为20g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备:将含丝氨酸蛋白酶的重组工程菌接种于含终浓度50μ g/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2 %接种量转接于含有50 μ g/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37°C、250r/min培养至菌体浓度0D600为0.6~0.8，向培养物中加入终浓度.0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40%、破Is停Is条件下超声破碎，取破碎混合液即为催化剂。
6.一种编码权利要求1所述丝氨酸蛋白酶的基因。
7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化酪素制备酪氨酸的基因工程菌中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为:构建含有所述丝氨酸蛋白酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有丝氨酸蛋白酶基因的菌体细胞。
【文档编号】C12N1/21GK104130994SQ201410308921
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】柳志强, 郑裕国, 林善, 薛亚平, 吴晖, 李邦良, 许静, 许峰, 王鸿艳 申请人:浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司