鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明属于水产动物病原的检测与诊断【技术领域】，本发明公开了鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法，本发明所述的鳜鱼弹状病毒逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒，包括：5×逆转录缓冲液；逆转录酶；随机引物；2×反应混合缓冲液1.0mL；优选设计的上、下游引物；Taq?DNA聚合酶；阳性对照液；阴性对照液；ddH2O；本发明克服了现有鳜鱼弹状病毒检测方法的不足，提供一种新型逆转录-聚合酶链式反应快速检测试剂盒及检测方法，本发明对鳜鱼弹状病毒临床诊断不仅切实可行，且具有快速、准确、特异的优点，满足了临床诊断的要求，为检测鳜鱼弹状病毒提供了便利条件。
【专利说明】鳜鱼弹状病毒的检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产动物病原的检测与诊断【技术领域】，涉及一种鳜鱼弹状病毒的检测方法，特别是一种采用逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鳜鱼弹状病毒的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，广东省的佛山、中山，山东的济宁以及湖北等地的乌鳢、鳜鱼、加州鲈鱼养殖场爆发大规模的流行性疾病，造成巨大的经济损失。实验室从细菌学和病毒学两方面对患病鱼进行检测分析，确认引起这些养殖鱼类暴发性死亡的疾病为弹状病毒病，其病原为績鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV)。
[0003]弹状病毒(Rhabdovirus)是一种单股不分节段的负链RNA病毒,病毒粒子大小为(100-430) nmX (45-100) nm，形态似棒状或子弹状。弹状病毒种类较多，包括175种以上的成员，可感染脊椎动物、无脊椎动物及植物。鱼类弹状病毒因感染宿主广、毒株种类多、毒力强，严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有二十多种，其中危害较大的有鲤春病毒血症病毒(SVCV)。病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、牙鲆弹状病毒(HRV)和鳜鱼弹状病毒(SCRV)等。通过调查了解发现，自然感染鳜鱼弹状病毒的乌鳢、鳜鱼、加州鲈鱼死亡率高达90%。为了及早发现养殖鱼类是否被SCRV感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。
[0004]传统病毒病的诊断需要进行病毒分离，细胞培养，电镜观察以及免疫检测等方法，缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。PCR方法具有操作简单、特异、快速、敏感等优点，正逐步应用于病原微生物的检测与研究中。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，能快速、高效地用于鳜鱼弹状病毒的检测。
[0006]鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，所述试剂盒包括:
[0007](1) 5 X逆转录缓冲液100 μ L ;
[0008](2)逆转录酶 25 μ L ;
[0009](3)随机引物 25yL;
[0010](4) 2X聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分:
[0011]
【权利要求】
1.鳜鱼弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (1)5X逆转录缓冲液10yL； (2)逆转录酶25yL； (3)随机引物25yL; (4)2 X聚合酶链式反应混合缓冲液1.0mL，包含以下成分:
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒检测鳜鱼弹状病毒的方法为: (1)待测样品RNA的提取:解剖待检测的鱼样品，取肝、脾、肾等组织进行匀浆，采用传统的Trizol法或者商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，用ddH20溶解，即为试验用RNA模板； (2)逆转录合成cDNA:取待测样品的RNA模板7μ L，加入PCR反应管中，再加入5 X逆转录缓冲液2 μ L、逆转录酶0.5 μ L、随机引物0.5 μ L，反应总体积10 μ L，充分混匀后，置于PCR仪上，37°C 15min逆转录反应，85°C 5sec灭活逆转录，得到cDNA产物； (3)PCR扩增:采用25μ L的PCR反应体系，在0.2mL PCR反应管内分别加入2X反应混合缓冲液12.5 μ L，上游引物Ρ1、下游引物Ρ2各0.5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0.5 μ L,cDNA模板3.0 μ L，用灭菌超纯水加至总体积，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混合均匀后离心数秒进行PCR反应，反应程序为:94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共循环35次；72°C延伸10分钟，最后4 C保存； (4)PCR扩增产物的检测:PCR反应结束后，取1y L产物在1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 μ g/mL)上，使用TAE缓冲液进行电泳，在紫外透射仪下观察PCR产物，检查PCR产物的预期大小； (5)结果与判定:在紫外灯下观察并与标准分子量相对照，若检测样品在372bp处出现明亮的条带，而阴性对照没有目的条带，则为鳜鱼弹状病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无目 的条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的鳜鱼弹状病毒。
【文档编号】C12Q1/70GK104032038SQ201410315460
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】雷燕, 张会军, 刘婉, 王惠儒, 张文文 申请人:广州金水动物保健品有限公司