烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6及其干扰表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6及其干扰表达载体和应用，烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示或SEQ?ID?NO.4所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸，其编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示或SEQ?ID?NO.3所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸，该蛋白具有抑制侧枝，腋芽或侧芽增生的作用，干扰表达后烟草的侧枝生长明显活跃，且腋芽或侧芽增生明显，对烟草株型的调控和提高烟叶产量有着重要的意义。
【专利说明】烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6及其干扰表达载体和应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及烟草独脚金内酯转运蛋白NtroR6,还涉及编 码烟草独脚金内酯转运蛋白NtroR6的基因及干扰该基因表达的载体和应用。
【背景技术】
[0002] 植物激素是受特定环境信号诱导产生的一类可调节植物生理反应的次生代谢 物质，它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发 等生长发育过程中起着重要的调控作用。常见的植物激素有生长素（auxin)、赤霉素 ((gibberellin，GA)、细胞分裂素（cytokinin，CTK)、脱落酸（abscisic acid, ΑΒΑ)、乙烯 (ethyne，ΕΤΗ)、水杨酸（salicylic acid, SA)、茉莉酸（jasmonic acid, JA)和油菜素甾醇 (brassinosteroid，BR)。其中，生长素和细胞分裂素是两种传统上认为控制植物分枝发育 的激素。然而近期研究发现，还有另外一种能够调控植物分枝发育的激素，即独脚金内酯 (strigolactone, SL)，属于倍半廠类次生代谢物质。独脚金内酯能够抑制植物的分支和侧 芽生长，并同生长素和细胞分裂素一起调控植物地上和底下部分的生长来维持株型。
[0003] 天然的独脚金内酯类化合物主要有5种：独脚金醇（strig〇l)、5-脱氧独脚 金醇（5-deoxystrigol)、列当醇（orobanchol)、高梁内酯（sorgolactone)和黑蒴醇 (alectrol)。最早发现的独脚金内酯是独脚金醇，从非寄生植物棉花根系中分泌，以刺激恶 性的寄生杂草独脚金、列当种子的萌发。随后在玉米、高粱、烟草以及番茄中都分离到独脚 金内酯化合物。研究还表明，独脚金内酯也可以作为刺激因子促进AM真菌菌丝分枝，与植 物建立共生的关系。
[0004] 独脚金内酯具有抑制植物分枝的功能，最早发现于对分枝增加的突变体的研究， 导致突变植株分枝增加原因在于天然独脚金内酯的合成受阻。目前，关于独脚金内酯合成 途径调控植物分枝的研究已经在水稻、拟南芥、豌豆、矮牵牛中进行了较为深入的研究。独 脚金内酯作为一种新型的激素，其对植物分枝发育的调控是与生长素和细胞分裂素相互作 用的过程。独脚金内酯在根部能够受低磷、生长素等信号的诱导合成，除了在根毛下表区 域分泌后参与促进AM菌丝分枝外，其余则要经木质部自下而上运输，参与地上部侧枝的抑 制。而生长素在植物的顶端合成之后，要极性下输送参与抑制分枝。而细胞分裂素是极性 向上运输，促进细胞分裂和参与组织分生，是生长素调控的第二激素。生长素可以通过促进 独脚金内酯的合成或抑制细胞分裂素的水平来发挥对分枝的抑制。独脚金内酯也可以通过 反馈作用影响生长素的激素水平。
[0005] 独脚金内酯在根部或者地上部发挥其作用，要涉及从根部到地上部的一系列转运 过程，这就需要转运蛋白的参与。最近，在矮牵牛中发现了植物中第一个独脚金内酯转运蛋 白PhTORl，为ABC转运蛋白ABCG亚家族成员。烟草作为重要的农作物，烟叶生长至后期，为 保证烟叶中的营养不向生殖器官转移，要采取"打顶"的操作。但这一操作将破坏植株的顶 端优势，导致侧枝分生明显，若不及时抹掉侧芽，同样会消耗叶片内营养，影响烟叶产量。研 究烟草独脚金内酯的转运分子机理将有助于通过分子手段控制植株的分枝，对烟草株型的 调控研究有着重要的理论和现实意义。然而，在现有的烟草研究报道中，有关烟草独脚金内 酯的转运相关基因未见报道。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6,本 发明的目的之二在于提供编码烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6的基因；本发明的目的之 三在于提供干扰烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6表达的转基因干扰表达载体；本发明的 目的之四在于提供上述干扰表达载体的构建方法；本发明的目的之五在于提供烟草独脚金 内酯转运蛋白NtH)R6的应用；本发明的目的之六在于提供烟草独脚金内酯转运蛋白基因 NtH)R6的应用；本发明的目的之七在于提供转基因干扰表达载体的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 1、烟草独脚金内酯转运蛋白NtroR6,其氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示或SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸且来源于烟草的具有独脚金内酯 转运蛋白功能的氨基酸序列。
[0009] 2、编码权利要求1所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID N0. 3所示或SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核苷酸且来 源于烟草的具有独脚金内酯转运蛋白功能的核苷酸序列。
[0010] 3、干扰所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtroR6表达的转基因干扰表达载体。
[0011] 优选的，所述干扰表达载体为含有干扰SEQ ID N0. 3所示序列表达的发夹结构经 Not I酶切位点连入pART27植物表达载体而得。
[0012] 更优选的，所述发夹结构含有如SEQ ID N0. 9所示的正向序列和反向序列。
[0013] 4、所述干扰表达载体的构建方法，包括如下步骤：以SEQ ID N0. 10和SEQ ID NO. 11所示序列为引物，烟草的根组织cDNA为模板进行PCR扩增获得正向序列，将正向序列 通过Xhol和ΚρηΙ酶切位点连入pHANNIBAL载体，获得含有正向序列的pHANNIBAL载体；然 后以SEQ ID N0. 12和SEQ ID N0. 13所示序列为引物，烟草的根组织cDNA为模板进行PCR扩 增获得反向序列，将获得的反向序列通过Xbal和Hindlll连入含有正向序列的pHANNIBAL 载体，获得含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL载体，再利用Not I酶切位点从含有正 向序列和反向序列的pHANNIBAL载体切下发夹结构序列并连入经Not I酶切、去磷酸化的 PART27植物表达载体中，即得干扰表达载体。
[0014] 5、所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6在抑制烟草侧枝、腋芽或侧芽增长中的 应用。
[0015] 6、所述编码烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6的基因在抑制烟草侧枝、腋芽或侧 芽增长中的应用。
[0016] 7、所述干扰表达载体在促进烟草侧枝、腋芽或侧芽增长中的应用。
[0017] 本发明的有益效果在于：本发明利用矮牵牛独脚金内酯转运蛋白PhroRi的序列 设计引物序列，经扩增获得烟草独脚金内酯转运蛋白基因的核苷酸序列，从而获得了该基 因编码的氨基酸序列，该基因在缺磷、Me JA和NAA诱导下能够提高NtroR6基因的表达量，但 受NaCl和ΑΒΑ的影响较小；本发明还公开了干扰NtH)R6基因表达的干扰表达载体，利用干 扰表达载体转化烟草后获得的转基因阳性株系NtroR6基因表达量降低，从株型来看转基 因阳性株系分枝明显增多，侧枝生长活跃，茎部腋芽和侧芽增生明显，因此可以利用该基因 来抑制烟草分枝，抑制腋芽和侧芽增生，相反也可以通过干扰该基因的表达促进烟草分枝， 促进腋芽和侧芽增生，对烟草株型的调控具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0019] 图1为NtroR6基因在诱导表达特征（"+P"表示植株添加磷元素营养液中培养， "-P"表示缺磷营养液中培养，"H 20"、"ΑΒΑ"、"MeJA"、"NAA"和"NaCl "分别表示在营养液中 添加 H20、ABA、MeJA、NAA和NaCl诱导处理下培养）。
[0020] 图2为NtroR6(RNAi)-pART27转基因干扰载体示意图（35Sp表示为35S启动子， NtH)R6S为NtH)R6正向片段，NtH)R6R为NtH)R6反向片段，intron为内含子片段，0CS terminator为0CS终止信号；NPT II新霉素磷酸转移酶基因，L和R分别表示T-DNA转基因 载体的左右边界）。
[0021] 图3为?；代转基因株系的鉴定结果（"WT"表示野生型烟草，1，2, 3,4, 5为叶盘转 化后获得的?；代转基因株系；A图为Nptll基因在植株基因组中的PCR扩增结果；B图为 CaMV35S启动子在植株基因组中的PCR扩增结果）。
[0022] 图4为转基因阳性苗NtH)R6的基因表达结果（"WT"表示野生型烟草，L2和L5表 示转基因干扰阳性植株）。
[0023] 图5为转基因阳性苗的表型特征（A :左为野生型烟草，右为转基因阳性烟草；B图 显示转基因阳性植株分生的侧枝，C表示近地面处茎部腋芽和侧芽增生表型明显，箭头指示 增生的侧枝）。
【具体实施方式】
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例1、克隆烟草NtH)R6基因
[0026] 根据矮牵牛独脚金内酯转运蛋白PhroRl的序列，设计扩增烟草独脚金内酯转运 蛋白基因（NtPDR6)编码区的引物，具体引物如下：
[0027] NtPDR6_fw :5'-atggagggtggtgaagacag-3'（SEQ ID NO. 1);
[0028] NtPDR6_rev :5'-atggagggtggtgaagacag-3'（SEQ ID NO. 2);
[0029] 然后以烟草红花大金元的根组织cDNA为模板，分别以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2,所示的引物对进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94°C预变性4min。94°C变性30s，56°C 退火30s，72°C延伸240s，共30个循环。再72°C终延伸10min，4°C保存。将扩增获得的序 列测序后获得如SEQ ID N0.3所示序列，含有4482bp个核苷酸，为一个完整的开放式阅读 框，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。
[0030] 实施例2、NtroR6在激素及低磷处理下的诱导表达分析
[0031] 将生长至"大十字"期的烟草幼苗从营养土中转移至去离子水中，恢复生长3天后 进行缺磷、激素及高盐诱导处理。
[0032] 缺磷处理：将恢复生长的烟草幼苗转入不含磷元素的MS培养基中培养，对照组则 放入正常的MS培养基中培养，两周后取幼苗于1. 5mL离心管中，液氮速冻，-80°C保存备用。
[0033] 激素处理：将恢复生长的烟草幼苗分别放入添加了 50μΜ ΑΒΑ、100μΜ MeJA、 30 μ Μ NAA的营养液中培养，同时以添加等量水的营养液作为对照，处理24h后取幼苗于 1. 5mL离心管中，液氮速冻，-80°C保存备用。
[0034] 高盐诱导处理：将恢复生长的烟草幼苗放入添加了 20mM NaCl的营养液中培养， 处理24h后取幼苗于1. 5mL离心管中，液氮速冻，-80°C保存备用。
[0035] 设计检测Ν?Η)Κ6基因的突光定量引物，具体为：NtPDR6_q_fw :5' -tggaatgaaggac aggaggctaa-3'（SEQ ID NO. 5), NtPDR6_q_rev :5'-gtccaaccatcatctcccctgtag-3'（SEQ ID NO. 6);同时以烟草GAPDH (NtGAPDH)基因为内参，具体引物为NtGAPDH-q-fw: 5' -tgggtgt caacgagaaggaa-3' （SEQ ID N0.7) ;NtGAPDH-q-rev:5'-tctgggtggcagtaaggga_3' （SEQ ID NO. 8)。然后将保存的材料用于提取RNA，进行反转录成cDNA，然后上述荧光定量进行荧光 定量检测，荧光定量PCR条件为95°C预变性10s，95°C变性5s，60°C退火30s，39个循环，然 后统计C t值。将Ct值通过2_ΛΛα计算NtH)R6基因表达量，结果如图1所示。由图1可知， 在缺磷、MeJA和NAA诱导处理后NtH)R6表达量大幅度提高，而在NaCl和ΑΒΑ诱导处理后 NtH)R6表达量变化不大。表明在缺磷、MeJA和ΝΑΑ诱导下能够提高NtH)R6基因的表达量。
[0036] 实施例3、NtH)R6基因干扰载体构建
[0037] 根据获得的NtH)R6基因序列在N端设计一对扩增长度为315bp截断片段（SEQ ID N0.9)的引物（包括正向片段引物和反向片段引物），并根据pHANNIBAL中间载体的酶切位 点在引物的上游和下游分别设计酶切位点，并以酶切位点控制序列的插入方向，从而获得 RNAi干扰载体的干扰序列。
[0038] 具体引物序列如下：
[0039] 正向片段引物：
[0040] NtPDR6-if-fw ：5' -ccgctcgagtaactaaacttgatttggtggaaag-3' (SEQ ID NO. 10), 下划线表示Xhol酶切位点；
[0041] NtPDR6_if-rew :5'-cggggtaccctggtttgatgattccactgactt-3' (SEQ ID NO. 11), 下划线表示Kpnl酶切位点；
[0042] 反向片段引物：
[0043] NtPDR6-ir-fw ：5' -tgctctagataactaaacttgatttggtggaaag-3' (SEQ ID NO. 12), 下划线表示Xbal酶切位点；
[0044] NtPDR6-ir~rew ：5'-cccaagcttctggtttgatgattccactgactt_3' (SEQ ID NO. 13), 下划线表示Hindlll酶切位点；
[0045] 然后分别以 SEQ ID Ν0· 10 和 SEQ ID Ν0· 11，SEQ ID Ν0· 12 和 SEQ ID Ν0· 13 的 序列为引物，实施例1中合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94°C预变性 4min。94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 240s，共 30 个循环。再 72°C终延伸 10min， 4°C保存，扩增产物经琼脂糖凝胶纯化后分别连入克隆载体pEASY-Tl，分别获得含有正向片 段的pEASY-T 1载体和含有反向片段的pEASY-T 1载体。将含有正向片段的pEASY-T 1载体通 过Xhol和Kpnl酶切后连入经同样酶切的pHANNIBAL载体中，得含有正向片段的pHANNIBAL 载体；再将含有反向片段的PEASY-T1载体通过Xbal和Hindlll双酶切，并连入经同样酶切 的含有正向片段的PHANNIBAL载体中，形成中间载体，命名为NtH)R6 (RNAi) -pKANNIBAL。将 构建的中间载体NtroR6(RNAi)-pKANNIBAL用Not I酶切之后连入经Not I酶切的、去磷酸 化的PART27植物表达载体中，获得转基因干扰表达载体，命名为NtH)R6 (RNAi)-pART27,其 结果如图2所示。
[0046] 实施例4、基因干扰载体的农杆菌转化及转基因烟草植株的获得
[0047] (1) NtH)R6 (RNAi) -pART27干扰表达载体转化农杆菌
[0048] 从_80°C冰箱中取出农杆菌LBA4404感受态细胞，在冰上冻融，待即将解冻时加 入NtroR6(RNAi)-pART27干扰表达载体，轻弹混匀；将混合物加入到预冷的2mm电转杯中， 置于冰上5分钟；将电转仪参数调至：电压2. 5kV ;电容：25yF ;电阻200Ω ;用纸吸取电 转杯外壁上的水滴，把电转杯放入电击槽中，电击5ms，然后迅速加入800 μ L28°C预热的 YEB液体培养基，并于220rpm，28°C振荡复苏3小时；复苏后将菌液在4500rpm条件下离 心lmin，弃一半体积的上清，重新悬浮后均勻涂与含有Rif(100y g/mL)、Str(50y g/mL)和 Kan (50 μ g/mL)的YEB固体培养基上，28°C倒置培养约2-3天，直至单菌落形成；挑取单菌 落，扩培后菌液通过PCR鉴定阳性克隆，获得工程菌。
[0049] (2)转基因烟草的获得
[0050] 取烟草无菌苗叶片，用打孔器将叶片处理成直径0.5cm大小的叶盘，叶背朝下， 在MS固体培养基上预培养3天；同时活化工程菌，具体方法为：挑取阳性单菌落，在2mL含 有 Rif(100 μ g/mL)、Str (50 μ g/mL)和 Kan(50 μ g/mL)的 YEB 培养基过夜培养；取 lmL 菌 液，加入到50mL含相同抗性的YEB培养基中，28°C，200rmp培养至0D达到0. 6左右，然后 在4000rpm条件下离心5min，用20mL的MS液体培养基悬浮菌体30分钟；然后将预培养的 叶片放入悬浮菌液中，侵染10分钟，用无菌的滤纸吸干叶片多余的菌液，在MS+6-BA(2mg/ L)+NAA(0. 5mg/L)的固体培养基上暗培养3天；然后用含有400mg/L头孢霉素（Cef)的无 菌水清洗叶盘，无菌滤纸吸去多余的液体，再将叶盘转到含有6-BA(2mg/L)、NAA(0. 5mg/ L)、Cef (200mg/L)和Kan(50mg/L)的MS固体筛选培养基上，28°C光照培养；待不定芽长到 0. 5cm时，转移到含Cef (200mg/L)和Kan (50mg/L)的MS固体培养基上生根，得到TQ代转基 因株系。
[0051] 待幼苗在含有卡那霉素的抗性培养基上生根之后，剪取叶片，在DNA水平鉴定阳 性转基因株。具体方法为，设计转基因干扰载体上CaMV35S启动子序列和Npt II基因的扩 增引物，具体为：
[0052] 35S_fw :5,-gaagggtcttgcgaaggata-3，（SEQ ID N0. 14);
[0053] 35S_rev :5'-ttgtaaaacgacggccagtg-3'（SEQ ID NO. 15);
[0054] Npt Il-fw:5,-ataccgtaaagcacgaggaag-3，（SEQ ID NO. 16);
[0055] Npt II-rev:5'-ctgaagcgggaagggact-3' (SEQ ID NO. 17)；
[0056] ，然后以?；代转基因株系DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94°C预变性 4min。94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 45s，共 25 个循环；再 72°C终延伸 10min，4°C 保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。结果显示，2号和5号转基因株系有 目的基因扩增，表明2号和5号转基因株系为阳性株系，分别命名为L2和L5。
[0057] 取L2和L5转基因阳性株系提取烟草根部的RNA，反转合成cDNA后通过qRT-PCR 分析NtroR6基因表达量，同时提取野生型烟草作为对照，检测方法与实施例2相同，其检测 结果如图4所示。结果显示，L2和L5转基因阳性株系中NtH)R6基因表达量明显低于野生 型烟草的NtH)R6基因表达量，表明转基因阳性株系中NtH)R6基因表达量明显下调。
[0058] 观察L2和L5转基因阳性苗的表型特征：分别将野生型和转基因阳性株系移栽至 盆中，温室培养5周左右，然后观察转基因阳性株系和野生型烟草的表型特征，结果如图5 所示。结果显示，转基因阳性苗与野生型烟草相比，L5株呈明显的多分枝表型，叶片数目增 多。表明干扰NtH)R6基因表达后植株分生的侧枝生长活跃，近地面处茎部腋芽和侧芽增生 表型明显。相反，NtH)R6基因的表达具有具有抑制植株腋芽和侧芽的增生，因此可以通过 控制NtH)R6基因表达控制植株腋芽和侧芽的增生。
[0059] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
[0001] _序歹丨j表_ <110>西南大学 <120>烟草独脚金内酯转运蛋白NtPDR6及其干扰表达载体和应用 <160 17 <210 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>扩增烟草独脚金内酯转运蛋A基因引物NtPDR6- % <400> 1 啤gagggtg glga嗯1cag 20 <210> 2 <211> 20 <2I2> DNA <213>人丄序列 <220> <223>扩增烟草独脚金内酯转运蛋白基因引物NtPDR6- rev <400> 2 atggagggig gtgaagacag 20 <2i0> 3 <211> 4482 <212> DNA <2)3> 佩草（Nicotiana tabacim Linn,) <220> <223>烟草独脚金内酯转运蛋白基因 <400> 3
[0002] atggagggtg gtgaagacag ttttagggta agtagtgcac gtttgagtag Gtcaaatgta 60 tggaggaata gtgcaatgga tgtgttttca agatcttcaa gagaagcaga tgatgaagag 120 gcattaaaat gggctgctct tgagaaatta ccaacttatc ttcgtataag gagaggtatt 180 ctcactgaag aagaaggcca atctagagaa gttgatataa ctaaacttga tttggtggaa 240 aggaggaatt tattagaaag gcttgtcaag attgctgatg aagai:aa1:ga gaagttcttg 300 ttgaaactca aaa,agcgca,t tgctagagtt ggtcttgatc ttcctacaat tgaagtccgg 360 tttgagcatg tgagtgtaga tgcagaagct agagttggta gtagagctct acctacaata 420 ttcaacttca cagttaacat cttagaggat ttcttgaact atcttcatat tcttccaagt 480 agaaagaaac cattgccaat ccttcacgaa gtcagtggaa tcatcaaacc aggaagaatg 540 acactgcttt taggaccacc aagttctgga aaaaccacat tgttattagc tttggctggg 600 aaactagata aagatctcaa agtttcaggg agagttacat ataatggcca tggaatggat 660 gagtttgtac cacaaagatc atctgcttat ataagccaaa atgatcttca tattggagaa 720 atgacagtta gggaaacact ggcattttct gctagatgtc aaggagttgg agccaaatat 780 gaaattttgg cagagctgtc tagaagagag aagggagcaa atattaaacc agatcctgat 840 gtcgatatct ttatgaagtc agcatggaat gaaggacagg aggctaatgt ggtaacggat 900 tatactctca agatattggg acttgaaatt tgtgctgata ccctcgttgg agatgaaatg 960 attcgaggaa tttcaggagg gcagagaaag agactaacta caggggagat gatggttgga 1020 ccagcaagag cactttttat ggatgagata tcaactggtt tagatagttc aacaacttat 1080 cagattgtga attcaattag gcaatcaatc cacattcttc aaggaactgc tgtaatctca 1140 cttcttcagc ctgcaccaga aacttatgac ttgttcgacg atatcattct tctatcagat 1200 gggcaaattg tgtaccaagg tccccgggaa aatgtacttg agttcttcga gtacatgggc 1260 ttcatgtgtc ctgagaggaa aggcgtcgct ga,ttt,cttac aagaagtgac atcaaggaag 1320 gatcaagagc aatactgggc acgtcgtgat gaaccttata agtatattac agtgcgcgaa 1380 ttttctgaat catttcaatc atttcacatt ggaaggaagc ttggtgatga gcttgctgtt 1440 ccttttgata aatcaaagag ccaccctgcc gctctaacca caaagaagta tggtattagc 1500 aagaaagaac tcttaaaagc ctgcacagct agagaatacc ttcttatgaa gaggaattca 1560 ttcgtctata tattcaagat gatacaacta acattgatgg cttctataac aatgacgctg 1620 ttcctacgaa ctgagatgca cagaaataca acaacagatg gtgctgtttt cttgggtgca 1680 ctgttctatg cagttatcat gattatgttc aatggattct cagagcttgc cctcagtatt 1740 atgaagcttc cttcctttta caaacaacgc gatcttcttt tctttcctgc ttgggcatat 1800 gctcttccta cttggatcct caagataccg gtcacacttg tagaagttgc catttgggtg 1860 tgtatgactt attatgttat tggattcgag gcggatgttg ggaggttctt caaacagtta 1920 tttctgctca tatgtgttaa ccaaatggcc tcggggctgt ttcgattcat aggagctctt 1980 ggaaggaatg tcattgttgc aaatacattt ggatcatgtg cactaGtcac agttcttgta 2040 atgggtggat tcattctgtc aagagatgac gtgaagaagt ggtggatatg gggctactgg 2100 atttcgccta tgatgtacgc acagaatgct atcgctgtga atgaatttct agggaagagt 2160 tgggcacatg ttcctcctaa ctccacgggc acagagacat t.aggagtatc attcttgaaa 2220 tcgcgtggaa tctttccaga agcaagatgg tattggattg gagcaggagc tcttcttgga 2280 tatgttttac tcttcaattt catgttcact gtggccttag cttatctcaa cccatttggt 2340 aaatctcagg cagttctttc agaagaaact gttgccgaga ggaatgcaag caaaaggggt 2400 gaggttattg aactatctcc gatagaaaag cgctcttctg aaagaggaaa tgatgttcgg 2460 cgaagtgcat. cttccaggtc tatgtcctca agggtaggca gcattactga ggctgattta 2520 aacaagagaa ggggaatgat tctccctttt gagccccttt ctattacttt tgacgatatc 2580 agatacgcag tagatatgcc acaggaaatg aaagctcaag gtgtggctga ggatcggctt 2640
[0003] gaactcttga aaggtgtgag tggtgctttt aggccaggag ttttgacagc tctaatgggt 2700 gtaagtggag ctggtaagac cacccttatg gatgtcttag ctggtaggaa aactggcgga 2760 tacattgacg gaaccatcag tatatcaggg tacccgaaac aacaagaaac gtttgcgcgg 2820 atagctggat actgtgagca aactgacatt cattcacctc atgttacagt. atatgaatca 2880 ttgcagtttt ctgctttgct tcgattgcct cgtgaagttg acactgaaac tagaaagatg 2940 ttcgttgaag aggtcatgga actcgtagag cttacccctc taagagaagc acttgttgga 3000 ttgcctggcg tgaatggtct ttGaactgaa caacgaaaac ggcttacagt tgcagttgaa 3060 cttgttgcca acccttctat aatattcatg gatgagccaa cctctggact agatgctaga 3120 gcagctgcaa tagtgatgag aacagttaga aacacggtag atacaggccg aacagtggta 3180 tgcactatcc atcagcctag catcgacata tttgatgctt tcgatgagct cctactcctg 3240 aaacgaggag gtgaagaaat atatgtcggc ccattaggac gccattcttc tcaccttatt 3300 aagtattttg agggaattga tggagttcca aaaatcaaag atggttataa tccagcaaca 3360 tggatgttgg agataacttc agtagcacaa gaagcagctc gcgtaattga ctttacagaa 3420 ttatacaaga actcagaatt gtataggaga aacaaagcat taatcaagga actaagtgta ,3480 ccaccccctt gttcaaaaga cctctacttt ccaactaagt actcccaatc tttcttcacc 3540 caatgcaagg cttgtttctg gaaacagcac tggtcatact ggagaaatcc accttacaca 3600 gcagtcaggc tcatgtttac attctttatt gctctcatgt ttggaacaat attctgggat 3660 cttggctcca gaaggaaaag gcaacaagat cttttgaatg ctataggttc aatgtatgct 3720 gctgtcttgt ttcttggtgt acaaaatgca acttcagtgc agccagttat tgccattgag 3780 aggacggaaa gagcggctgg aatgtactct gctctgcctt atgctttcgg acaggttatg 3840 attgagGtcc catacctttt catccagacg atcatatatg gagttatagt atatgtcatg 3900 atcggatttg aatggacagt tgccaagttc ttttggtatc tgttctttat gtatttcacc 3960 ttgttatact tcacattgta tgggatgatg acagtagctg ttactcctaa tcacagcatt 4020 gcagccatca tttcatctgc attttatgca atatggaacc ttttctgtgg attcgtcgtt 4080 ccaaaaacag acttagtctt ctatggaagc aagtccgatg gcagcaactt tgtcttgagt 4140 atcacggtct gcgcgcgaat tgctgttggc gtacgcgaca ctatttggat ctgccagtgg 4200 ctaggcgctg gtgcttggca ttgggtctgc gcgcggggaa ctgtctgtgc gggcagcgct 4260 gttggcaaca tgatggtttg tgcgcgtagc attgtcggta cgcgcggcac tgatggcatt 4320 cgccagGCgc tgggcgctga aactgattat cggtgggacg acagaggcgt atgcgtgctt 4380 gttacttggc gctgccaaga ccacggggcc gaccgtggct ctaggcgttg ggaggcttgc 4440 cgggatgcca cggggcgcgt ccaaggggtc atgggtcgat ga 4482 <210 4 <211> 1493 <2I2> PRT <213 > 烟草（Linn.) <220> <223>烟草独脚金内酯转运蛋白 <400> 4 Met Glu Gly Gly Glu Asp Ser Phe Arg Val Ser Ser Ala Arg Leu
[0004] 15 10 15 Scr Ser Ser Asn Val Trp Arg Asn Ser Ala Met Asp Val Phe Ser 20 25 30 Arg Scr Scr Arg Glu Ala Asp Asp Glu Glu Ala Leu Lys Trp Ala 35 40 ,15 Ala Leu Glu Lys Leu Pro Thr Tyr Leu Arg lie Arg Arg Gly lie 50 55 60 Leu Thr Glu Glu Glu Gly Gin Ser Arg G丄u Val Asp 丄丄e Thr lys 65 70 75 Leu Asp Leu Val Glu Arg Arg Asn Leu Leu Glu Arg Leu Val Lys 80 85 90 lie Ala Asp Glu Asp Asn Glu Lys Phe Leu Leu Lys Leu Lys Lys 95 100 105 Arg lie Ala Arg Val Gly Leu Asp Leu Pro Thr lie Glu Val Arg 110 115 120 Phe Glu His Val Ser Val Asp Ala Glu Ala Arg Yal Gly Ser Arg 125 130 135 Ala Leu Pro Thr lie Phe Asn Phe Thr Val Asn lie Leu Glu Asp 140 1.15 150 Phe Leu Asn Tyr Leu His lie Leu Pro Ser Arg Lys Lys Pro Leu 丄55 160 165 Pro He Leu His Glu Val Ser Gly lie lie Lys Pro Gly Arg Met 170 175 180 Thr Leu Leu Leu Gly Pro Pro Ser Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu 185 190 195 Leu Ala Leu Ala Gly Lys Leu Asp Lys Asp Leu Lys Val Ser Gly 200 205 210 Arg Val Thr Tyr Asn Gly His Gly Met Asp Glu Phe Val Pro Gin 215 220 225 Arg Ser Ser Ala Tyr lie Ser Gin Asn Asp Leu His lie Gly Glu 230 235 240 Met Thr Val Arg Glu Thr Leu Ala Phe Ser Ala Arg Cys Gin Gly 245 250 255 Val Gly Ala Lys Tyr Glu lie Leu Ala Glu Leu Ser Arg Arg Glu
[0005] 260 265 270 Lys Gly Ala Asn lie Lys Pro Asp Pro Asp Val Asp lie Phe Met 275 280 285 Lys Scr Ala Trp Asn Glu Gly Gin Glu Ala Asn Val Val Thr Asp 290 295 300 Tyr Thr Leu Lys lie Leu Gly Leu Glu lie Cys Ala Asp Thr Leu 305 310 315 Val Gly Asp G丄u Met 丄丄e Arg Gly lie Ser G丄y Gly Gin Arg Lys 320 325 330 Arg Leu Thr Thr Gly Glu Met Met Val Gly Pro Ala Arg Ala Leu 335 3-10 315 Phe Met Asp Glu lie Ser Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Thr Tyr 350 355 360 Gin lie Val Asn Ser lie Arg Gin Ser lie His lie Leu Gin Gly 365 370 375 Thr Ala Val lie Ser Leu Leu Gin Pro Ala Pro Glu Thr Tyr Asp 380 385 390 Leu Phe Asp Asp lie lie Leu Leu Ser Asp Gly Gin lie Val Tyr 395 400 105 Gin Gly Pro Arg Glu Asn Val Leu Glu Phe Phe Glu Tyr Met Gly 110 415 420 Phe Met Cys Pro Glu Arg Lys Gly Val Ala Asp Phe Leu Gin Glu 125 430 135 Val Thr Ser Arg Lys Asp Gin Glu Gin Tyr Trp Ala Arg Arg Asp 440 445 450 Glu Pro Tyr Lys Tyr lie Thr Val Arg Glu Phe Ser Glu Ser Phe 155 460 465 Gin Ser Phe His lie Gly Arg Lys Leu Gly Asp Glu Leu Ala Val 170 175 180 Pro Phe Asp Lys Ser Lys Ser His Pro Ala Ala Leu Thr Thr Lys 185 490 195 Lys Tyr Gly lie Ser Lys Lys Glu Leu Leu Lys Ala Cys Thr Ala 500 505 510 Arg Glu Tyr Leu Leu Met Lys Arg Asn Ser Phe Val Tyr lie Phe
[0006] 515 520 525 Lys Met lie Gin Leu Thr Leu Met Ala Ser lie Thr Met Thr Leu 530 535 510 Phc Leu Arg Thr Glu Met His Arg Asn Thr Thr Thr Asp Gly Ala 5X15 550 555 Val Phe Leu Gly Ala Leu Phe Tyr Ala Val lie Met lie Met Phe 560 565 570 Asn Gly Phe Ser Giu Leu Ala Leu Ser 丄丄e Met Lys Leu Pro Ser 575 580 585 Phe Tyr Lys Gin Arg Asp Leu Leu Phe Phe Pro Ala Trp Ala Tyr 590 595 600 Ala Leu Pro Thr Trp lie Leu Lys lie Pro Val Thr Leu Val Glu 605 610 615 Val Ala lie Trp Val Cys Met Thr Tyr Tyr Val lie Gly Phe Glu 620 625 630 Ala Asp Val Gly Arg Phe Phe Lys Gin Leu Phe Leu Leu lie Cys 635 640 615 Val Asn Gin Met Ala Ser Gly Leu Phe Arg Phe lie Gly Ala Leu 650 655 660 Gly Arg Asn Val lie Val Ala Asn Thr Phe Gly Ser Cys Ala Leu 665 670 675 Leu Thr Val Leu Val Met Gly Gly Phe lie Leu Ser Arg Asp Asp 680 685 690 Val Lys Lys Trp Trp lie Trp Gly Tyr Trp lie Ser Pro Met Met 695 700 705 Tyr Ala Gin Asn Ala lie Ala Val Asn Glu Phe Leu Gly Lys Ser 710 715 720 Trp Ala His Val Pro Pro Asn Ser Thr Gly Thr Glu Thr Leu Gly 725 730 735 Val Ser Phe Leu Lys Ser Arg Gly lie Phe Pro Glu Ala Arg Trp 740 lAh 750 Tyr Trp Lie Gly Ala Gly Ala Lou Leu Gly Tyr Val Leu Leu Phe 755 760 765 Asn Phe Met Phe Thr Val Ala Leu Ala Tyr Leu Asn Pro Phe Gly
[0007] 770 775 780 Lys Ser Gin Ala Val Leu Ser Glu Glu Thr Val Ala Glu Arg Asn 785 790 795 Ala Scr Lys Arg Gly Glu Val lie Glu Leu Ser Pro lie Glu Lys 800 805 810 Arg Ser Ser Glu Arg Gly Asn Asp Val Arg Arg Ser Ala Ser Ser 815 820 825 Arg Ser Met Ser Ser Arg Va.丄 Gly Ser 丄丄e Thr Glu Ala. Asp Leu 830 835 840 Asn Lys Arg Arg Gly Met lie Leu Pro Phe Glu Pro Leu Ser lie 8?5 850 855 Thr Phe Asp Asp lie Arg Tyr Ala Val Asp Met Pro Gin Glu Met 860 865 870 Lys Ala Gin Gly Val Ala Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Gly 875 880 885 Val Ser Gly Ala Phe Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Met Gly 890 895 900 Val Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Leu Met Asp Val Leu Ala Gly 905 910 915 Arg Lys Thr Gly Gly Tyr lie Asp Gly Thr lie Ser lie Ser Gly 920 925 930 Tyr Pro Lys Gin Gin Glu Thr Phe Ala Arg lie Ala Gly Tyr Cys 935 940 945 Glu Gin Thr Asp lie His Ser Pro His Val Thr Val Tyr Glu Ser 950 955 %() Leu Gin Phe Ser Ala Leu Leu Arg Leu Pro Arg Glu Val Asp Thr 965 970 975 Glu Thr Arg Lys Met Phe Val Glu Glu Val Met Glu Leu Val Glu 980 985 990 Leu Thr Pro Leu Arg Glu Ala Leu Val Gly Leu Pro Gly Val Asn 995 1000 1005 Gly Leu Ser Thr Glu Gin Arg Lys Arg Leu Thr Val Ala Val Glu 1010 1015 1020 Leu Val Ala Asn Pro Ser lie lie Phe Met Asp Glu Pro Thr Ser
[0008] 1025 1030 1035 Gly Leu Asp Ala Arg Ala Ala Ala lie Val Met Arg Thr Val Arg 1040 1045 1050 Asn Thr Val Asp Thr Gly Arg Thr Val Val Cys Thr lie His Gin 1055 1060 1065 Pro Ser lie Asp lie Phe Asp Ala Phe Asp Glu Leu Leu Leu Leu 1070 1075 1080 Lys Arg Gly Gly Glu Glu 丄丄e Tyr Va丄 Gly Pro Leu G丄y Arg His 1085 1090 1095 Ser Ser His Leu lie Lys Tyr Phe Glu Gly lie Asp Gly Val Pro 1100 110.5 1110 Lys lie Lys Asp Gly Tyr Asn Pro Ala Thr Trp Met Leu Glu lie 1115 1120 1125 Thr Ser Val Ala Gin Glu Ala Ala Arg Val lie Asp Phe Thr Glu 1130 1135 1140 Leu Tyr Lys Asn Ser Glu Leu Tyr Arg Arg Asn Lys Ala Leu lie 1145 1150 1155 Lys Glu Leu Ser Val Pro Pro Pro Cys Ser Lys Asp Leu Tyr Phe 1160 1165 1170 Pro Thr Lys Tyr Ser Gin Ser Phe Phe Thr Gin Cys Lys Ala Cys 1175 1180 1185 Phe Trp Lys Gin His Trp Ser Tyr Trp Arg Asn Pro Pro Tyr Thr 1190 1195 1200 Ala Val Arg Leu Met Phe Thr Phe Phe lie Ala Leu Met Phe Gly 1205 1210 1215 Thr lie Phe Trp Asp Leu Gly Ser Arg Arg Lys Arg Gin Gin Asp 1220 1225 1230 Leu Leu Asn Ala lie Gly Ser Met Tyr Ala Ala Val Leu Phe Leu 1235 1240 12?5 Gly Val Gin Asn Ala Thr Ser Val Gin Pro Val lie Ala lie Glu 1250 1255 1260 Arg Thr Glu Arg Ala Ala Gly Met Tyr Ser Ala Leu Pro Tyr Ala 1265 1270 1275 Phe Gly Gin Val Met lie Glu Leu Pro Tyr Leu Phe lie Gin Thr
[0009] 1280 1285 1290 lie lie Tyr Gly Val lie Val Tyr Val Met He Gly Phe Glu Trp 1295 1300 1305 Thr Val Ala Lys Phe Phe Trp Tyr Leu Phe Phe Met Tyr Phe Thr 1310 1315 1320 Leu Leu Tyr Phe Thr Leu Tyr Gly Met Met Thr Val Ala Val Thr 1325 1330 1335 Pro Asn His Ser 丄丄e Ala A丄a lie 丄丄e Ser Ser A丄a Phe Tyr Ala 1340 1345 1350 lie Trp Asn Leu Phe Cys Gly Phe Val Val Pro Lys Thr Asp Lou 1355 1360 1365 Val Phe Tyr Gly Ser Lys Ser Asp Gly Ser Asn Phe Val Leu Ser 1370 1375 1380 lie Thr Val Cys Ala Arg lie Ala Val Gly Val Arg Asp Thr lie 1385 1390 1395 Trp lie Cys Gin Trp Leu Gly Ala Gly Ala Trp His Trp Val Cys 1400 1405 1410 Ala Arg Gly Thr Val Cys Ala Gly Ser Ala Val Gly Asn Met Met 1415 1420 1425 Val Cys Ala Arg Ser lie Val Gly Thr Arg Gly Thr Asp Gly lie 1430 1435 1440 Arg Gin Pro Leu Gly Ala Glu Thr Asp Tyr Arg Trp Asp Asp Arg 1445 1450 1455 Gly Val Cys Val Leu Val Thr Trp Arg Cys Gin Asp His Gly Ala 1460 1465 1470 Asp Arg Gly Ser Arg Arg Trp Glu Ala Cys Arg Asp Ala Thr Gly 1475 1480 1485 Arg Val Gin Gly Val Met Gly Arg 1490 1493 <2!0> 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列
[0010] <220> <223> NLPDR6基因的荧光定量上游引物 <400> 5 tggaatgaag gacaggaggc taa 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> NtPDR6基因的荧光定量下游引物 <400> 6 Glccaaccal caicicccci glag 24 <210 7 <211〉 20 <212> DNA <213>人工序列 <220 <223> MC^LPD//基因的荧光定量上游引物 <400> 7 tggglgtcaa cgagaaggaa 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213>人下序列 <220> <223> MGAPD//基因的荧光定最下游引物 <400> 8
[0011] Iclggglggc aguicigggci 19 <210> 9 <211> 315 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> NtPDR6基因截断片段 <400> 9 taactaaact tgatttggtg gaaaggagga atttattaga aaggcttgtc aagattgctg 6U atgaagataa tgagaagttc ttgttgaaac tcaaaaagcg cattgctaga gttggtcttg 120 atcttcctac aattgaagtc cggtttgagc atgtgagtgt agatgcagaa gctagagttg 18(J gtagtagagc tctacctaca atattcaact tcacagttaa catcttagag gatttcttga 240 actatcttca tattcttcca agtagaaaga aaccattgcc aatccttcac gaagtcagtg 300 gaatcatcaa accag 315 <210> 10 <2!1> 34 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>正向片段上游引物 <400> 10 ccgclcgagl aactaaaclt galllgglgg aaag 34 <210> 11 <211> 33 <212> DNA [0012] <2〗3>人丁i序列 <220> <223>正向片段下游引物 <400〉 11 cggggtaccc Iggttigalg altccactga ctt 33 <210> 12 <211〉 33 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>反向片段上游引物 <400> 12 tgclclagal aaclaaacil galUggtgg aaag 34 <210〉 13 <211〉 33 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>反向片段下游引物 <400> 13 cccaagctlc iggiugaig attccactga ctt 33 <2I0> 14 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220〉
[0013] <223> 35S上游引物 <400> 14 gaaggglctl gcgaaggala 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <220 <223> 35S下游引物 <400> 15 Ugiaaaacg acggccaglg 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213>人丄序列 <220> <223> NptI丨上游引物 <400> 16 alaccglaaa gcacgaggaa g 21 <210〉 17 <21 卜 18 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> Nptll下游引物 <400> 17 clgaagcggg aagggacl 18
【权利要求】
1. 烟草独脚金内酯转运蛋白NtroR6,其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或 SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列经取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且来源于烟草的具有独 脚金内酯转运蛋白功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6的基因，其特征在于：核苷酸 序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列经取代、缺失或添加至少一个核 苷酸，且来源于烟草的具有独脚金内酯转运蛋白功能的核苷酸序列。
3. 干扰权利要求1所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6表达的转基因干扰表达载体。
4. 根据权利要求3所述的干扰表达载体，其特征在于：所述干扰表达载体为含有干扰 SEQ ID NO. 3所示序列表达的发夹结构经Not I酶切位点连入pART27植物表达载体而得。
5. 根据权利要求4所述的干扰表达载体，其特征在于：所述发夹结构含有如SEQ ID NO. 9所示的正向序列和反向序列。
6. 权利要求3-5任一项所述干扰表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以 SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11所示序列为引物，烟草的根组织cDNA为模板进行PCR扩增 获得正向序列，将正向序列通过Xhol和ΚρηΙ酶切位点连入pHANNIBAL载体，获得含有正向 序列的pHANNIBAL载体；然后以SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示序列为引物，烟草的根 组织cDNA为模板进行PCR扩增获得反向序列，将获得的反向序列通过Xbal和Hindlll连 入含有正向序列的pHANNIBAL载体，获得含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL载体，再利 用Not I酶切位点从含有正向序列和反向序列的pHANNIBAL载体切下发夹结构序列并连入 经Not I酶切、去磷酸化的pART27植物表达载体中，即得干扰表达载体。
7. 权利要求1所述烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6在抑制烟草侧枝、腋芽或侧芽增长 中的应用。
8. 权利要求2所述编码烟草独脚金内酯转运蛋白NtH)R6的基因在抑制烟草侧枝、腋芽 或侧芽增长中的应用。
9. 权利要求3-5任一项所述干扰表达载体在促进烟草侧枝、腋芽或侧芽增长中的应 用。
【文档编号】C12N15/84GK104086637SQ201410316861
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】王根洪, 夏庆友, 谢小东, 高军平, 熊海军 申请人:西南大学