一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法。本发明提供的食用菌菌种纯化方法，依次包括如下步骤：(1)取食用菌的出发菌株，制备原生质体；(2)进行原生质体再生，得到原生质体再生菌；(3)进行如下(a)和/或(b)：(a)检测各个原生质体再生菌的菌丝生长速率，菌丝生长速率的一致性高的原生质体再生菌即为纯化后的菌种；(b)检测各个原生质体再生菌的子实体产量，子实体产量的一致性高的原生质体再生菌即为纯化后的菌种。本发明可广泛应用于食用菌栽培工厂和专业的食用菌菌种生产和销售公司。
【专利说明】一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法。 【背景技术】
[0002] 目前，随着食用菌产业规模的日益扩大，对食用菌菌种质量的要求也日益提高。 "菌种纯度"是影响菌种质量的一个关键因素。
[0003] 食用菌菌种是指生长在适宜培养基质上具有结实性的菌丝培养物，菌丝一般为多 细胞结构，因此菌种是由许多菌丝细胞组成的细胞群体。
[0004] 食用菌菌种在继代培养和保藏过程中，由于其自身的碱基突变、转座子、准性生殖 等生物学机制，会导致菌种中各个细胞在遗传和表型上的不一致性，也就是说菌种纯度降 低，或菌种不纯。
[0005] 不纯的菌种在生产上会导致生长不一致、出菇不整齐、子实体商品性状杂乱、产量 降低、栽培周期延长等诸多问题，这些问题在工厂化栽培中表现尤为严重。
[0006] 为了恢复或提高菌种的纯度，目前生产中通常利用子实体组织分离技术、孢子分 离杂交、继代培养筛选等方法。子实体组织分离技术和继代培养筛选获得的菌种仍然来源 于多细胞群体，只能是在一定程度上提高菌种纯度，仍然不纯。孢子分离技术虽然能获得纯 菌种，但是有性孢子形成过程中经历一次染色体重组，其性状会发生较大的变异。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种食用菌菌种纯化方法。
[0008] 本发明提供的食用菌菌种纯化方法，依次包括如下步骤：
[0009] (1)取食用菌的出发菌株，制备原生质体；
[0010] (2)进行原生质体再生，得到原生质体再生菌；
[0011] ⑶进行如下（a)和/或（b):
[0012] (a)检测各个原生质体再生菌的培养特性，菌丝生长速率的一致性高的原生质体 再生菌即为纯化后的菌种；
[0013] (b)检测各个原生质体再生菌的出菇特性，子实体产量的一致性高的原生质体再 生菌即为纯化后的菌种。
[0014] 所述（a)具体可为：检测各个原生质体再生菌的菌丝生长速率，菌丝生长速率的 一致性高于所述出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种；
[0015] 所述（b)具体可为：检测各个原生质体再生菌的子实体产量，子实体产量的一致 性高于所述出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种。
[0016] 所述"制备原生质体"的方法具体包括如下步骤：①将所述出发菌株接种到PDB培 养基，25°C培养5-10d ;②完成步骤①后，收集菌丝体，用0. 6M甘露醇水溶液洗涤，然后用无 菌滤纸吸干菌丝体表面的溶液；③取0. lg步骤②得到的菌丝体，加入0. 8ml溶壁酶溶液， 30°C反应4h ;④完成步骤③后，在无菌条件下用无菌脱脂棉滤芯过滤，收集滤液，即为含有 原生质体的溶液。所述PDB培养基的组成具体如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml， 自然pH。所述溶壁酶溶液的制备方法具体如下：将0. 4g溶壁酶（广东省微生物菌种保藏 中心，http://www. gimcc. net/prolist. asp)溶于 10ml0· 6M 甘露醇水溶液，用 0· 22 μ m 无 菌过滤器过滤除菌。
[0017] 所述"进行原生质体再生"的方法包括如下步骤：①取原生质体溶液，涂布到再生 培养基，25 °C培养5-6天；②完成步骤①后，挑取菌落，接种至PDA试管培养基，25 °C培养 6-10天（如6-7天或8-10天）；③完成步骤②后，取双核菌株，即为原生质体再生菌。所述 原生质体溶液具体可为原生质体浓度为1〇 6个/ml的原生质体溶液。所述再生培养基的组 成具体如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、甘露醇109g、水1000ml，自然pH。
[0018] 所述食用菌可为杏鲍菇或平菇，具体可为杏鲍菇ACCC52627或平菇ACCC50838。
[〇〇19] 本发明还保护以上任一所述方法在食用菌生产中的应用。所述应用中，选择菌丝 生长速率高于所述出发菌株的原生质体再生菌和/或子实体产量高于所述出发菌株的原 生质体再生菌进行生产。
[0020] 食用菌菌种是多细胞的菌丝组成的。利用原生质体制备可以分离获得单细胞，单 细胞的原生质体再生可以重新萌发形成菌种。原生质体再生菌种的所有细胞都起源于同一 个原生质体细胞，所以这些细胞的遗传和表型一致，也就是说单细胞原生质体再生获得的 菌株是遗传上高度一致的纯菌种。另外，利用原生质体纯化菌种的过程中未经历有性过程 和染色体重组，所以最大程度上保留了菌种原有的农艺性状和商品性状。
[0021] 食用菌菌种纯度是影响菌种质量的一个关键因素。食用菌菌种是由多细胞的菌丝 组成的，在长期继代培养和保藏过程中，由于自身的生物学特性，会导致细胞之间遗传和表 型上的差异。本发明提供了一种新的食用菌菌种纯化方法，即利用原生质体技术纯化食用 菌菌种，包括如下步骤：①原生质体的制备；②原生质体再生；③菌种性状的评价和筛选。 利用本发明的方法可以获得遗传上高度一致的纯菌种。在生产中使用纯菌种可以显著提高 菌丝生长的整齐度，子实体商品性状的一致性。另外，通过性状的评价和筛选还能获得产量 超过原始菌株的菌种。本发明可广泛应用于食用菌栽培工厂和专业的食用菌菌种生产和销 售公司。 【具体实施方式】
[0022] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。本发明中的菌种纯度，也称为菌种的一致性，是指菌种中各个细胞在遗传和表型上 的一致性，而不是指由于杂菌污染而导致的菌种不纯。ACCC的全称为中国农业微生物菌种 保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，网址：http://www. accc. org. cn〇
[0023] PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，自然pH。PDB培养基： 马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml，自然pH。溶壁酶溶液：将0.4g溶壁酶（广东省微生 物菌种保藏中心， http://www.gimcc.net/prolist.asp)溶于10ml0.6M甘露醇水溶液，用 0. 22 μ m无菌过滤器过滤除菌。再生培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、甘露醇 109g、水 1000ml，自然 pH。
[0024] 实施例1、杏鲍菇ACCC52627的纯化
[0025] 实施例1中所采用的杏鲍菇为获自ACCC的编号为52627的杏鲍菇，因此称为杏鲍 ? ACCC52627。
[0026] 一、原生质体的制备
[0027] 1、菌种活化，将杏鲍菇ACCC52627接种到新鲜的PDA培养基，25°C培养7-10d。
[0028] 2、完成步骤1后，将活化后的菌株接种到PDB培养基，25°C培养5-10d。
[0029] 3、完成步骤2后，收集菌丝体，用0. 6M甘露醇水溶液洗涤两次，然后用无菌滤纸吸 干菌丝体表面的溶液。
[0030] 4、取0. lg步骤3得到的菌丝体，放于2. 0ml离心管中，加入0. 8ml溶壁酶溶液， 30°C反应4h (每隔lOmin颠倒离心管混匀一次）。
[0031] 5、完成步骤4后，在无菌条件下用无菌脱脂棉滤芯过滤，收集滤液。
[0032] 6、取步骤5得到的滤液，在显微镜下用血球计数板检查计算原生质体的纯度和数 量，结果表明，滤液中没有菌丝，只有球形原生质体，原生质体的浓度为6. 40X 107/ml。
[0033] 7、取步骤5得到的滤液，用0. 6M甘露醇水溶液调节原生质体浓度，得到原生质体 浓度为1〇6个/ml的原生质体溶液。
[0034] 二、原生质体的再生
[0035] 1、取100 μ 1步骤一的7得到的原生质体溶液，涂布到再生培养基，25°C培养5-6 天（菌落萌发，可以观察到肉眼可见的菌落）。
[0036] 2、完成步骤1后，挑取菌落，接种至PDA试管培养基，25°C培养8-10天（培养基表 面长满菌落）。
[0037] 3、完成步骤2后，采用插片法制片（将待观察的菌株接种到PDA平板培养基的中 间，在接种块的周围约2cm的位置，斜插入无菌盖玻片，25°C倒置培养，当菌落前沿的菌丝 附着到盖玻片时，用镊子取出盖玻片，放在载玻片上），然后在显微镜下观察，根据锁状联合 的有无确定是双核菌株还是单核菌株（对于平菇和杏鲍菇来说：菌丝相对较粗，具有锁状 联合的菌株为双核菌株，又称异核菌株；菌丝相对较细，无锁状联合的菌株为单核菌株，又 称同核菌株）。
[0038] 三、菌种筛选
[0039] 完成步骤二后，随机选择3个双核菌株（杏鲍菇ACCC52627-2、杏鲍菇 ACCC52627-7、杏鲍菇ACCC52627-9)，以步骤一的1活化后的杏鲍菇ACCC52627 (原始菌株） 作为对照，进行性状评价（包括农艺栽培性状鉴定和子实体的商品性状鉴定），选择性状好 的菌株用于生产。对于单核菌株，可以选择不同交配类型的单核菌株杂交，重新获得双核菌 株，然后进行性状评价。
[0040] 1、菌丝生长速率以及菌丝生长速率的一致性
[0041] 将杏鲍菇ACCC52627、杏鲍菇ACCC52627-2、杏鲍菇ACCC52627-7和杏鲍菇 ACCC52627-9分别接种到新鲜的PDA培养基，25°C培养7d。
[0042] 结果见表1。从原始菌株（杏鲍菇ACCC52627)获得的三个原生质体再生菌株（杏 鲍菇ACCC52627-2、杏鲍菇ACCC52627-7、杏鲍菇ACCC52627-9)的菌丝生长速率有显著差 异，说明原始菌株各个细胞的遗传型和表型存在差异。三个原生质体再生菌株的菌丝生长 速率的标准差低于原始菌株，说明原生质体再生菌株的菌丝生长速率的一致性要高于原始 菌株。根据步骤1的鉴定，应选择杏鲍菇ACCC52627-7和杏鲍菇ACCC52627-9进行后续生 产。
[〇〇43] 表1原始菌株与其原生质体再生菌株的菌丝生长率
[0044]
[0045]
【权利要求】
1. 一种食用菌菌种纯化方法，依次包括如下步骤： (1) 取食用菌的出发菌株，制备原生质体； (2) 进行原生质体再生，得到原生质体再生菌； (3) 进行如下（a)和/或（b): (a) 检测各个原生质体再生菌的培养性状，菌丝生长速率的一致性高的原生质体再生 菌即为纯化后的菌种； (b) 检测各个原生质体再生菌的出菇特性，子实体产量的一致性高的原生质体再生菌 即为纯化后的菌种。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述（a)为：检测各个原生质体再生菌的菌丝生长速率，菌丝生长速率的一致性高于 所述出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种； 所述（b)为：检测各个原生质体再生菌的子实体产量，子实体产量的一致性高于所述 出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述"制备原生质体"的方法包括如下步骤： ① 将所述出发菌株接种到PDB培养基，25°C培养5-10d ; ② 完成步骤①后，收集菌丝体，用〇. 6M甘露醇水溶液洗涤，然后用无菌滤纸吸干菌丝 体表面的溶液； ③ 取〇. lg步骤②得到的菌丝体，加入〇. 8ml溶壁酶溶液，30°C反应4h ; ④ 完成步骤③后，在无菌条件下用无菌脱脂棉滤芯过滤，收集滤液，即为含有原生质体 的溶液。
4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于： 所述"进行原生质体再生"的方法包括如下步骤： ① 取原生质体溶液，涂布到再生培养基，25°C培养5-6天； ② 完成步骤①后，挑取菌落，接种至PDA试管培养基，25°C培养6-10天； ③ 完成步骤②后，取双核菌株，即为原生质体再生菌。 所述原生质体溶液具体可为原生质体浓度为1〇6个/ml的原生质体溶液。
5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述食用菌为杏鲍菇或平菇。
6. 权利要求1至5中任一所述方法在食用菌生产中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于：选择菌丝生长速率高于所述出发菌株的原 生质体再生菌和/或子实体产量高于所述出发菌株的原生质体再生菌进行生产。
【文档编号】C12R1/645GK104087518SQ201410320034
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】张瑞颖, 顾金刚, 张金霞 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所