一种红色诺卡氏菌新的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种红色诺卡氏菌新的培养方法，该方法为在5升以上机械搅拌式发酵罐中扩大培养红色诺卡氏菌细胞壁骨架生产菌红色诺卡氏菌。该方法所用培养基的配方为葡萄糖1％、酵母粉1％、pH7.0-7.2；在发酵罐中培养的条件为：搅拌转速250-350r/min、通气量1∶0.83-1.1、接种量7.0-11.0％、装液量为罐容积的60％、温度28-30℃。本发明相对于现有摇瓶培养技术，红色诺卡氏菌生长速度快、培养周期缩短；菌体产品更加均匀；菌体收率更高、培养规模更易于扩大，有助于提高红色诺卡氏菌细胞壁骨架相关药物的生产效率、实现扩大生产规模。
【专利说明】一种红色诺卡氏菌新的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架生产菌红色诺卡氏 菌新的培养方法。
【背景技术】
[0002] 1984年福建省微生物研究所在昆明的土壤中筛选到一株红色诺卡氏菌P0_8(菌 种保藏编号：CGMCC NO :0187)，由该菌提取获得的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制成的冻干粉 针剂已获准上市，作为一种免疫调节剂，广泛用于控制各种肿瘤所引起的胸水和腹水，并且 能很好的辅助如膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤的治疗（《中 国生物制品规程》2000年版）。
[0003] 现有获准的生产工艺"红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂制造及检定规程"以及相 关专利（专利号CN93104969. 5\名称为"利用红色诺卡氏菌制造细胞壁骨架粉末的方 法"）表明一种利用相同保藏编号的红色诺卡氏菌菌种，"振荡通气培养"以及"经培养 基进行菌体培养与制备、菌体破壁、蛋白酶处理、溶媒提出、真空干燥处理制造骨架粉末 的方法，"其中，培养特征为"旋转培养或采用振动培养"方式，这些描述均指摇瓶培养方 式。专利号201210466904. 4、名称红色诺卡氏菌细胞壁骨架口含片及其制备方法，仅涉 及制剂的制备方法；其他专利均仅涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架的相关药物用途方面， 如：申请号CN200510077407. 5 :红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备抗真菌感染的药物中的 用途；以及 CN200510127603. 9、CN200610082627. 1\CN200610156653. 4\CN02132415. 8\ CN200510105533. 7\201310101232. 1〇
[0004] 目前尚未见有关红色诺卡氏菌其他培养方法的文献报道。获准生产的现有培养工 艺是采用玻璃摇瓶恒温振荡培养（《中国生物制品规程》2000年版的"红色诺卡氏菌细胞 壁骨架制剂制造及检定规程"），该方式批培养装液量有限、不易于用于自动化工业化生产， 使得生产规模受到制约；同时，规模化培养具有培养过程的温度、酸碱度、溶解氧（通气）等 参数不易精确自动控制，瓶间差异大，造成菌体产品质量不稳定；而且，溶氧效果相对较差， 菌体生长速度慢，培养周期长，收率较低等缺点。
[0005] 采用机械搅拌式发酵罐培养微生物，是目前成熟的培养方式，它具有培养液均匀、 溶氧好、装液量大、易于调节控制及放大等优点，使之规模化的生产周期短、产品均匀稳定。 但是不同的微生物、不同的培养目的，发酵罐培养控制参数，如：培养基配方、装料量、接种 量、温度、搅拌速度、通气量等，均有不同的要求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有摇瓶培养技术的缺点与不足，提供一种红色诺卡氏菌 新的培养方法，该方法为在5升以上机械搅拌式发酵罐中扩大培养，用于注射用红色诺卡 氏菌细胞壁骨架的制备。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] -种红色诺卡氏菌新的培养方法，为在5升以上机械搅拌式发酵罐中扩大培养， 包括如下步骤：将红色诺卡氏菌种子液接种到装有培养基的容积5升以上机械搅拌式发 酵罐中培养。其中，所述的培养基的配方为：葡萄糖1%、酵母粉1%、PH7. 0-7. 2 ;在发酵 罐中培养的条件优选为：搅拌转速250-350r/min、通气量1 : 0.83-1. 1(发酵液体积与 每分钟通气量的体积比）、接种量7. 0-11. 0%、装液量为罐容积的60%、温度28-30°C ;更 优选的，在发酵罐中培养条件为：搅拌转速289-3071'/1^11、通气量1:0.97-1.03、接种量 8. 6-9. 2%。
[0009] 所述的红色诺卡氏菌优选为红色诺卡氏菌P0-8,保藏编号为CGMCC N0 :0187。
[0010] 所述的种子液优选通过包含如下步骤的方法培养得到：将红色诺卡氏菌P0-8接 种到培养基中，在28°C、220r/min的摇床下培养36-38h ;该培养基的配方也为：葡萄糖 1%、酵母粉 1%，ρΗ7· 0-7. 2。 toon] 本发明的有益效果在于：提供一种生产红色诺卡氏菌细胞壁骨架的红色诺卡氏菌 培养方法，相对于现有摇瓶培养技术，机械搅拌式发酵罐培养使得菌体生长速度快、培养周 期缩短；菌体产品更加均匀；菌体收率更高、培养规模更易于扩大等，更有助于提高相关药 物的生产效率、实现扩大生产规模。
【具体实施方式】
[0012] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别 指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0013] 实施例中所用的红色诺卡氏菌为红色诺卡氏菌Ρ0-8菌株，其保藏编号为CGMCC Ν0:0187。红色诺卡氏菌Ρ0-8菌株种子液的培养方法为：将红色诺卡氏菌Ρ0-8接种到培养 基（葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7·0-7·2)中，在28°C、220r/min的摇床下培养36-38h。下 述实施例摇瓶培养和发酵罐培养所用培养基与培养种子液的培养基相同。
[0014] 实施例1红色诺卡氏菌在5L摇瓶中的扩大培养
[0015] 取种龄为38小时的种子液100mL接种到装有1L培养基的5L摇瓶中，28-30°C、往 复式摇床转速80r/min，恒温振荡培养5d，获得红色诺卡氏菌的最大菌体量为24. 24g/L。
[0016] 实施例2红色诺卡氏菌5L发酵罐培养接种量实验
[0017] 采用培养基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7. 2 ;装量3. 0L，搅拌转速289r/min， 通气量1 : l(v/V/min，表示实际发酵液与每一分钟通入空气量体积比。），28-30°C恒温发 酵罐培养的工艺，先后以3%、5%、7%、9%和11%的接种量接种种龄为38小时的种子液， 分别进行发酵实验，接种后从〇h开始至60h，间隔4h取样，稀释20倍，测定0D600制得生长 曲线（图1)。从生长曲线可知，接种量7 %与9 %，发酵生物量增长相对稳定，生物量水平较 高，是适宜的接种量参数。
[0018] 实施例3红色诺卡氏菌5L发酵罐培养通气量实验
[0019] 采用培养基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、pH7. 2 ;装量3.0L，搅拌转速289r/ min，接种量9% (种子液种龄为38小时），28-30°C恒温发酵罐培养的工艺，先后以2. 5L/ min(l : 0.83)、3.0L/min(l : 1)和 3.5L/min(l : 1.17)的通气量，分别进行发酵实验。 接种后从Oh开始至60h，间隔4h取样，稀释20倍，测定0D600制得生长曲线（图2)。由生 长曲线可以看出通气量3L/min(l : 1)的发酵最大生物量较高。因此，该通气量参数较为 适宜。
[0020] 实施例4红色诺卡氏菌5L发酵罐培养搅拌转速实验
[0021] 采用培养基配方：葡萄糖1%、酵母粉1%、ρΗ7. 2;装量3. 0L，通气量1 : 1，接种 量9% (种子液种龄为38小时），28-30°C恒温发酵罐培养的工艺，先后以100r/min、200r/ min、300r/min和400r/min的搅拌转速，分别进行发酵实验，接种后从Oh开始至60h，间隔 4h取样，稀释20倍，测定0D600制得生长曲线（图3)。
[0022] 实施例5红色诺卡氏菌5L发酵罐培养工艺优化实验
[0023] 在发酵培养基配方（葡萄糖1 %、酵母粉1%、pH7. 0-7. 2)、发酵罐装量相对固定 (装液量为60%)的条件下，以上述实施例的单因素实验结果为基础，采用响应面法（RSM) 和基于人工神经网络的遗传算法（ANN-GA)，对红色诺卡氏菌在机械搅拌式发酵罐中的主要 发酵条件（搅拌转速、通气量、接种量）进行优化，最终研制最优的发酵工艺。
[0024] (1)响应面法优化实验
[0025] 响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数理统计方法，本实验采用响 应面分析法中的Box-Bohnken(BBD)，以菌体生物量为响应值，对转速、通气量和接种量3因 素与菌体生物量之间的对应关系进行拟合（表1)。其他发酵条件一致，进行了 15次发酵实 验（表2)，应用软件SAS9. 2对实验数据进行分析。
[0026] 表1响应面分析因素和水平
[0027]
【权利要求】
1. 一种红色诺卡氏菌新的培养方法，其特征在于包括如下步骤：将红色诺卡氏菌种子 液接种到装有培养基的容积5升以上机械搅拌式发酵罐中发酵培养； 所述的培养基的配方为：葡萄糖1 %、酵母粉1 %，PH7. 0-7. 2 ; 在发酵罐中培养的条件为：搅拌转速250-350r/min、通气量1 : 0.83-1. 1、接种量 7. 0-1L 0%、装液量 60%、温度 28-30°C。
2. 根据权利要求1所述的红色诺卡氏菌新的培养方法，其特征在于：在发酵罐中培养 的条件为：搅拌转速289-307r/min、通气量1 : 0. 97-1. 03、接种量8. 6-9. 2%。
3. 根据权利要求1所述的红色诺卡氏菌新的培养方法，其特征在于：所述的红色诺卡 氏菌为红色诺卡氏菌PO-8,保藏编号为CGMCC NO :0187。
4. 根据权利要求1所述的红色诺卡氏菌新的培养方法，其特征在于：所述的种子液通 过包含如下步骤的方法培养得到：将红色诺卡氏菌P0-8接种到培养基中，在28°C、220r/ min的摇床下培养36-38h。
【文档编号】C12N1/20GK104099271SQ201410320363
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】谢必峰 申请人:谢必峰