一种芝麻染色体荧光原位杂交方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其采用涂片技术制作芝麻中期染色体标本，染色体分散效果好，制片效率高；在此基础上，采用荧光素标记BAC探针，建立了芝麻BAC的染色体原位杂交技术。探针杂交染色体后，荧光信号可被直接检测，从而确定目的DNA片段在染色体上的拷贝数量及位置。采用本发明方法制作的染色体标本可用于多次重复杂交，提高了标本的利用率和试验效率，并节省大量时间和成本；填补了我国芝麻染色体BAC原位杂交技术的空白。
【专利说明】一种芝麻染色体焚光原位杂交方法
[0001]
【技术领域】 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种芝麻染色体制片与BAC荧光原位杂交方法。
【背景技术】
[0002] 染色体制片和细菌人工染色体荧光原位杂交（BAC-FISH)技术是开展生物DNA片 段染色体定位、物理图谱构建等细胞遗传学研究的重要技术手段。目前在芝麻染色体核型 分析研究中，所使用的染色体制片方法均为传统的压片方法；而且尚未见任何制片技术在 芝麻BAC-FISH研究中的应用报道。在制作染色体标本时，传统的压片法需要对染色体标本 进行敲片、盖片处理，染色体容易变形；在进行原位杂交时，染色体标本因处于细胞质包裹 中，往往其背景信号较强，对杂交信号的观察干扰较大；而且中间操作过程中的揭片环节极 有可能导致染色体丢失，从而导致制片效率低、费工费时。此外，传统压片技术不利于制片 的多次重复使用，这也很大程度地影响了原位杂交技术在芝麻物理图谱构建和特定片段染 色体定位研究中的应用。因此，当前急需探讨一种稳定高效快速的芝麻染色体制片方法和 BAC-FISH杂交技术，为加快芝麻细胞遗传学和基因组学研究提供技术支撑。
【发明内容】
[0003] 为克服现有技术不足，本发明目的在于提供一种高效便捷的芝麻染色体荧光原位 杂交技术方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其包括如下步骤： A、 染色体标本的制备； B、 BAC探针制备： 1)BAC质粒DNA提取 从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒 DNA 浓度 100 - 500 ng/ μ L ; 2 )探针标记 取20 μ L BAC DNA，0. lKpa、120°C下放置5min，然后冰浴放置5min，随机引物法进行探 针标记，37°C水浴20h，65°C灭活5min，-20°C保存备用；标记体系见表1 ; 表1探针突光标记反应体系
【权利要求】
1. 一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤： A、 染色体标本的制备； B、 BAC探针制备： 1)BAC质粒DNA提取 从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒 DNA 浓度 100 - 500 ng/ μ L ; 2 )探针标记 取20 μ L BAC DNA，0. lKpa、120°C下放置5min，然后冰浴放置5min，随机引物法进行探 针标记，37°C水浴20h，65°C灭活5min，-20°C保存备用；标记体系见表1 ; 表1探针突光标记反应体系
C、 荧光原位杂交 将标记好的探针用杂交液稀释10倍作为工作液用于荧光原位杂交；工作液各组分见 表2 ; 表2荧光原位杂交所用工作液组成
1)染色体制片处理 将染色体制片浸泡于45%乙酸中1 一 2min，取出自然晾干，褪去吉姆萨染液颜色；37°C 下用含1〇〇μ g/mL RNase A的2XSSC处理制片标记区lh ;然后用2XSSC洗片三次，每次 5min ;使用70%、85%及无水乙醇对制片逐级脱水，每级3 - 5min ; 自然晾干后，37°C下用1%胃蛋白酶处理制片标记区30min，lXPBS洗2次，每次5min ; 然后用1%多聚甲醛处理制片标记区l〇min，2XSSC洗2次，每次5min，自然晾干； 在制片标记区加70%去离子甲酰胺，加盖片，70°C变性2min ;将变性后的制片进行脱 水，依次置于_20°C预冷的70%、85%及无水乙醇中逐级脱水，每级3 - 5min，自然晾干备用； 2) 探针变性 取20 μ L工作液，95°C变性lOmin，冰浴5min以上，备用； 3) 杂交 制片标记区内加工作液8 μ L，加盖片，胶水封边，37°C杂交过夜； 4) 信号检测 室温下2XSSC液浸泡制片，洗去盖片，含0. 1 wt % SDS的2 XSSC浸洗3次，每 次5min ;然后用蒸馈水冲洗一遍，避光瞭干；在制片标记区滴入4μ L含4Pg/mL DAPI的 Vectashield H1000,加盖片置于Nikon 80i突光显微镜下，根据制片坐标确定目标染色体， 观察杂交信号，冷光源CCD下进行图像采集，采用Spot Rtke 4.1软件进行图像合成，并利 用Adobe Photoshop 7.0软件对图像进行调整。
2. 如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤A染色体标本 的制备具体为： 1) 根尖培养 选取健康芝麻种子，播于铺有湿滤纸的培养皿中，21 °C暗培养至根长1. 2 - 1. 8cm ; 2) 根尖处理 切取4 一 5mm含分生区的根尖置于玻瓶中，浸入0. 002 Μ 8-羟基喹啉于21°C暗处理 1. 5h，倒出液体，直接加入由体积比为3:1的无水甲醇和冰乙酸组成的固定液4°C固定lh ; 取出根尖于蒸馏水中清洗2 - 3次，切取根尖分生区于蒸馏水中浸泡10 - 20min，然后 按每10个根尖分生区加入2〇μ1含2. 5%纤维素酶和2. 5%果胶酶的混合酶液于37°C水浴中 酶解2 - 3h ;取出根尖分生区，蒸馏水洗去酶液，然后蒸馏水中浸泡10 - 20min ;然后将根 尖分生区再次移至固定液中4°C固定lh ; 3) 涂片 用胶头滴管吸取根尖分生区，置于已于4°C预冷的干净玻片上，用尖头镊子尖端将根尖 分生区敲碎制成局部细胞悬液；然后滴加固定液使悬液分散于整个玻片，自然瞭干； 4) 染色 玻片倒置于一玻璃板上，两端用毛细管支起，使玻片与玻璃板之间留有空隙，将吉姆萨 染液注入此空隙，染色15min，然后自来水冲洗，自然晾干； 5) 镜检 在Nikon 80i荧光显微镜下，挑选处于有丝分裂中期的染色体制片，在背面标记目的 染色体所在范围，即标记区，记录其在玻片上对应的坐标位置。
3. 如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，将杂交后的制片 标本进行后处理用以重复利用，具体为：揭去盖片后，用含0. 2% Tween20的2XSSC浸洗 10min，然后蒸馏水冲洗一次，自然晾干，重复上述C步骤中的变性、脱水处理，即可用于另 一组探针的原位杂交检测。
【文档编号】C12Q1/68GK104099416SQ201410322009
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】张海洋, 苗红梅, 赵瑞红, 李春, 马琴, 魏利斌, 段迎辉 申请人:河南省农业科学院芝麻研究中心