一种抗WSSV自噬相关基因Cq-Atg8及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】一种抗WSSV自噬相关基因Cq-Atg8及其制备方法与应用，涉及一种自噬相关基因。所述抗WSSV自噬相关基因Cq-Atg8源自红螯螯虾(C.quadricarinatus)，命名为Cq-Atg8。所述Cq-Atg8的制备方法包括以下步骤：1)构建Cq-Atg8原核重组表达载体；2)将步骤1)所得Cq-Atg8原核重组表达载体导入宿主细胞，并用IPTG对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即rCq-Atg8。所述rCq-Atg8对WSSV感染复制具有明显抑制作用，因此rCq-Atg8可在制备抗WSSV类药物和动物抗病饲料添加剂中应用。
【专利说明】-种抗WSSV自噬相关基因 Cq-Atg8及其制备方法与应用 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种自噬相关基因，尤其是涉及一种从红螯螯虾（Cherax quadricarinatus)分离出来的抗病毒活性基因：红螯螯奸自嗤相关基因一Cq_Atg8。 【背景技术】
[0002] 白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，WSSV)是对奸的主要病原，还能够 感染螯虾、蟹和龙虾等，该病毒对许多重要水产甲壳动物经济养殖业造成极大的危害。遗憾 的是，人们至今尚未找到对抗WSSV感染的有效药物。
[0003] 自嗤相关基因（Autophagy-related gene，Atg)8-Atg8是一泛素样蛋白，该蛋 白是自嗤小体（Autophagosome)膜形成、延伸和与溶酶体融合的必要成分。此外，通过 与衔接蛋白（Adaptors)的相互作用，Atg8还参与选择性识别细胞质中的货物（Cargo) 并运输至溶酶体中进行降解（Weidberg H，Shvets E，Elazar Ζ· Biogenesis and cargo selectivity of autophagosomes[J].Annu Rev Biochem，2011，80:125-156)，而且Atg8还 具有非自噬活动相关的生物学功能。Atg8家族蛋白最初被发现主要参与细胞内许多物质转 运过程，包括：伽马氨基丁酸受体（Y _aminobutyric acid receptor，GABA receptor)向 细胞膜表面的转运（Leil T A，Chen Z W，Chang C S，et al.GABAA receptor-associated protein traffics GABAA receptors to the plasma membrane in neurons [J]. J Ne uiOsci，2004, 24(50) :11429-11438);结合包括转铁蛋白、Ila型磷酸钠协同转运蛋白 (NaPi-IIa)、血管紧张素 I 型受体（Angiotensin II Typelreceptor，ATlR)、瞬时受体电位 V 型（Transient receptor potential vanilloidl，TRPV1)、κ 亚型阿片受体（k opioid receptor) (Reining S C, Gisler S M，Fuster D，et al. GABARAP deficiency modulates expression of NaPi-IIa in renal brush-border membranes[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 296(5):F1118-1128 ；Lainez S,Valente P,Ontoria-Oviedo I, et al. GABAA receptor associated protein(GABARAP)modulates TRPVlexpression and channel function and desensitization[J]. FASEB J,2010, 24(6):1958-1970 ；Cook J L, Re R N, deHaro D L, et al. The trafficking protein GABARAP binds to and enhances plasma membrane expression and function of the angiotensin II typelreceptor[J]. Circ Res, 2008, 102(12) :1539-1547 ；Chen C, Wang Y, Huang P, et al. Effects of C-terminal modifications of GEClprotein and gamma-aminobutyric acid type A(GABA(A)) receptor-associated protein (GABARAP), two microtubule-associated proteins, on kappa opioid receptor expression [J]. J Biol Chem, 2011, 286(17) :15106-15115 ；Green F，0' Hare T, Blackwell A，et al. Association of human transferrin receptor with GABARAP[J].FEBS Lett，2002,518(1-3):101-106)及膜蛋白等并参与这些受体蛋白的胞内 转运；细胞内一些膜的转运和融合过程（Wild P，McEwan D G，Dikic I.The LC3interactome at a glance [J].J Cell Sci，2014, 127 (Ptl) :3-9)〇
[0004] Atg8作为一个具有多样生物学活性的基因，参与广泛的生物学活动，包括对 抗病毒感染的机体防御反应（Shelly S，Lukinova N，Bambina S，et al.Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus [J]. Immunity, 2009, 30 (4) : 588-598);另一方面，病毒感染也可能利用 Atg8 蛋 白的相关功能，如鼠肝炎病毒利用Atg8和源自ER的囊泡产生双层膜囊泡，用于病毒 复制(Reggiori F, Monastyrska I, Verheije Μ H, et al. Coronaviruses Hijack the LC3-I-positive EDEMosomes, ER-derived vesicles exporting short-lived ERAD regulators, for replication[J]· Cell Host Microbe, 2010, 7(6) :500-508),流感病毒感 染过程中M2离子通道蛋白（Matrix2 (M2) ion-channel protein)可与Atg8相互结合，导致 Atg8在细胞膜表面定位，促进病毒的丝状出芽，提高其稳定性，从而利于流感病毒的传播 (Beale R, Wise H, Stuart A, et al. A LC3-interacting motif in the influenza A virus M2protein is required to subvert autophagy and maintain virion stability[J]. Cell Host Microbe, 2014, 15(2):239-247)。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8。
[0006] 本发明的第二目的在于提供抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的制备方法。
[0007] 本发明的第三目的在于提供抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的应用。
[0008] 所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8源自红螯螯奸（C. quadricarinatus)，故又命 名为 Cq_Atg8。
[0009] 所述Cq_Atg8的基因序列为：
[0010]
【权利要求】
1. 抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8,源自红螯螯奸（C. quadricarinatus)，命名为 Cq_Atg8。
2. 如权利要求1所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8,其特征在于Cq_Atg8的基因序列 为：
3. 如权利要求1所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8,其特征在于Cq_Atg8的氨基酸序 列为：
4. 如权利要求1所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的制备方法，其特征在于包括以下 步骤： 1) 构建Cq_Atg8原核重组表达载体； 2) 将步骤1)所得Cq_Atg8原核重组表达载体导入宿主细胞，并用IPTG对宿主细胞进 行诱导表达，获得表达产物； 3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即rCq-AtgS。
5. 如权利要求4所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的制备方法，其特征在于在步骤 1) 中，所述表达载体选用PGEX4T-2。
6. 如权利要求4所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的制备方法，其特征在于在步骤 2) 中，所述宿主细胞为大肠杆菌E. coli BL21。
7. 如权利要求4所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8的制备方法，其特征在于在步骤3) 中，所述分离纯化步骤2)所得的表达产物的方法为超声破碎诱导表达后的大肠杆菌菌体， 再进行亲和层析。
8. 如权利要求1所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8在制备抗WSSV类药物中的应用。
9. 如权利要求1所述抗WSSV自噬相关基因 Cq_Atg8在制备动物抗病饲料添加剂中的 应用。
【文档编号】C12N15/12GK104087593SQ201410327802
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】刘海鹏, 陈荣元, 王克坚 申请人:厦门大学