一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应用。本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。本发明的实验证明，本发明得到麦蚜体内共生菌Hamiltonella?defensa28469基因，采用体外饲喂dsRNA方法，可抑制或沉默麦蚜体内共生菌Hamiltonella?defensa28469基因，导致麦蚜生长发育受阻并产生致死效应。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜 虫生长中的应用。 一种蚜虫共生菌基因的dsRNA及其在抑制蚜虫生长中的应 用 【背景技术】
[0002] 麦蚜是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，中国每年小麦蚜虫危害面积 可高达0. 17亿公顷，占小麦总种植面积的62%，造成减产15% -30%，严重时可高达50%。 近年来，由于全球气候变暖、耕作制度变化等因素，使蚜虫的繁殖能力和适应性显著增强， 其危害日趋严重。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且 造成了严重的环境污染。培育抗蚜虫小麦和蔬菜品种是防止蚜虫危害的最有效途径，但由 于现有种质资源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效。挖掘和利 用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦抗蚜新种质具有重要意义。
[0003] 植物介导的RNAi技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，RNAi现象其作用 过程是双链RNA(dsRNA)进入生物体内，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA与RNA 诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer识别，造成靶基因表达量的下 降。近年来，利用dsRNA体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已 经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析。孟山都公司通过植物介导的昆虫 肠道特异基因 RNAi技术成功获得了抗玉米根螟的转基因玉米，有效缓解了长期应用Bt转 基因玉米诱发昆虫产生抗性等问题，目前已完成生产性试验。棉铃虫肠道中特异P450基因 可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450 基因 dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450基因的表达量 下降，同时幼虫发育受阻，表现出抗棉铃虫性能。
[0004] 共生菌在昆虫体内的生长、繁殖过程中起着十分重要的作用，如营养功能、解毒作 用、调控生殖及与寄主适应性等等。Hamiltonella defensa是半翅目昆虫体内存在的一 种次级共生细菌，存在于刺吸食害虫如蚜虫、木虱和粉虱体等昆虫体内。在蚜虫体内中， Hamiltonella defensa在含菌体、肠道、卵巢等部位存在。通过寄主植物表达相应昆虫寄生 菌特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其体内相应的共生菌的基因，导致共生菌死亡或 者数量下降，影响昆虫的正常生长，从而达到控制害虫危害的目的。通过RNAi技术沉默共 生菌相关基因的方式，间接控制蚜虫的研究还尚未有报道。此研究将为挖掘有效的RNAi靶 标基因及利用其创制新型抗蚜转基因新种质奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供了 dsRNA。
[0006] 本发明提供的dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示 的核苷酸组成的双链RNA。
[0007] 上述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段也是本发明保护的范围，上 述dsRNA的编码基因具体为序列表中序列1所示的核苷酸。
[0008] 上述dsRNA或上述的编码基因在如下1)_4)中至少一种中的应用也是本发明保护 的范围：
[0009] 1)防治蚜虫或制备防治蚜虫产品；
[0010] 2)促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品；
[0011] 3)抑制蚜虫生长中或制备抑制蚜虫生长产品；
[0012] 4)抑制姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达或在制备抑制 虫牙虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达产品。
[0013] 上述应用为将上述dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长 和/或抑制姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达；所述导入具体为饲 喂；
[0014] 所述蚜虫为麦蚜。
[0015] 本发明的另一个目的是提供具有功能的产品，其活性成分为上述dsRNA或其编码 基因；
[0016] 所述功能为如下1)-4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫 生长；4)抑制姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因表达。
[〇〇17] 所述蚜虫为麦蚜。
[0018] 姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的核苷酸序列为序列表中序列 1〇
[0019] 本发明的实验证明，本发明得到麦姆的共生菌Hamiltonella defensa28469cDNA 的保守序列的dsRNA，采用体外饲喂dsRNA方法，进行了利用RNAi技术沉默麦蚜体内共生 菌Hamiltonella defensa28469基因，导致麦蚜产生致死效应，并且随着饲喂时间延长，麦 蚜的死亡率均逐渐增加。对饲喂后蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因实时 荧光定量PCR研究表明，28469的表达明显受到抑制。表明蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa的28469基因的保守序列可应用于通过植物介导的RNAi技术提高小麦抗蚜性的研 究。 【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1蚜虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的PCR扩增
[0021] 图2姐虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因和GFP的体外合成dsRNA 【具体实施方式】
[0022] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0023] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 下述实施例中麦蚜（钱幼亭，周广和，张淑香，张向才.麦蚜有性世代的研究.植 物保护，1982, 1:14-15。公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得）由中国农业科学 院植物保护研究所提供，饲养蚜虫的小麦品种为科农199,将蚜虫接种到小麦幼苗上，放入 人工气候箱中（温度（20±2)°C，湿度60%-80%，光周期L : D = 16 : 8)进行繁殖。
[0025] 质粒提取试剂盒购自Biomega公司，内切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7体外 转录试剂盒购自NEB公司，大肠杆菌菌株DH5 α、反转录试剂盒购自北京全式金公司，rTaq DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit购自Qiagen公司，各种氨基酸及其它试剂均购自北京拜尔迪公司。
[0026] 实施例1、姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的dsRNA的获得
[0027] 1、麦蚜总RNA的提取和cDNA的合成
[0028] 分别取约20头麦蚜，按照北京全式金公司的Trizol试剂盒说明书提取总RNA，用 RNA Cleaning Kit进行纯化，反转录合成cDNA第一链，操作步骤均参考试剂盒说明书。
[0029] 2、引物设计与基因克隆
[0030] 根据麦蚜肠道转录组测序得到蚜虫共生菌相关基因28469 (获得的28469的一个 片段用于RNAi干扰），利用Primer Primer5. 0软件设计引物P1 (表1)，由北京华大基因公 司合成。绿色荧光蛋白基因（GFP)片段从国家小麦改良中心实验室保存的GFP质粒上扩增， 利用Primer Primer5. 0软件设计引物P2 (表1)。
[0031] PCR 反应体系为 10 X PCR Buffer5 μ L、dNTP (2. 5mmol · Γ1) 4 μ L、rTaqO. 5 μ L， Forward primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、Reverse primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、cDNA/GFP 质粒 lyL，用 ddH20 补足至 50yL。PCR 的反应条件为 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s， 39 个循环；72°C lOmin ;4°C保存。
[0032] 以麦蚜的cDNA为模板，用PI作为引物进行扩增，得到283bp PCR产物（含40bp 的T7启动子序列），经过测序，该283bp PCR产物具有序列表中的序列1 (可人工合成）所 示的核苷酸。
[0033] 以GFP质粒为模板，用P2作为引物进行扩增，得到360bp PCR产物（含40bp的T7 启动子序列），其具有序列表中的序列3 (可人工合成）所示的核苷酸。
[0034] 将上述 PCR 电泳结果如图 1 所不，M :100bp marker ;1 :麦虫牙 Sitobion avenae2 : GFP，可以看出得到目的片段。
[0035] 将上述283bp PCR产物核苷酸序列去掉T7启动子序列提交到NCBI数据库 (http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)进行BLAST比对分析，BLAST结果表明，与豌豆虫牙体内 次级共生菌基因具有100%同源性，可确定该核苷酸序列为保守序列。
[0036] 表1为共生菌基因28469与GFP的PCR扩增引物
[0037]
【权利要求】
1. dsRNA，为由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的 双链RNA。
2. 权利要求1所述dsRNA的编码基因或含有该编码基因的DNA片段。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述dsRNA的编码基因的核苷酸序 列为序列表中序列1。
4. 权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编码基因在如下1)-4)中至少一种中的 应用： 1) 防治蚜虫或制备防治蚜虫产品； 2) 促进蚜虫死亡或制备促进蚜虫死亡产品； 3) 抑制!牙虫生长中或制备抑制!牙虫生长广品； 4) 抑制姆虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达或在制备抑制姆虫 体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因的表达产品。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1或2所述 dsRNA导入蚜虫，实现防治蚜虫、促进蚜虫死亡、抑制蚜虫生长和/或抑制蚜虫体内共生菌 Hamiltonella defensa28469 基因的表达。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于： 所述导入为饲喂。
7. 根据权利要求4-6中任一所述的应用，其特征在于： 所述蚜虫为麦蚜。
8. -种具有功能的产品，其活性成分为权利要求1所述dsRNA或权利要求2所述的编 码基因，所述功能为如下1)_4)中任意一种：1)防治蚜虫；2)促进蚜虫死亡；3)抑制蚜虫生 长；4)抑制姐虫体内共生菌Hamiltonella defensa28469基因表达。
【文档编号】C12N15/113GK104109671SQ201410328123
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】夏兰琴, 孙永伟, 蔡洵 申请人:中国农业科学院作物科学研究所