一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记，选择刀鲚逆转座子SINE的多态性位点为目标，依据插入位点的侧翼序列，设计特异性引物，应用PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分子克隆等方法获得SINE插入或缺失位点的DNA片段，用这些特异的DNA片段来识别刀鲚的不同种群。本发明可以快速、准确地确定刀鲚种群，在刀鲚的分子标记辅助育种、鱼苗的人工放流效果评价和种群动态监测等方面具有广泛用途。
【专利说明】一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类的分子生物学【技术领域】，具体地说，是一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记。
【背景技术】
[0002]鱼类物种的界定涉及两个层次，一是物种水平，二是种群水平。物种识别方法有外部形态判断法、生化法，以及最近十几年发展的一种分子标记的方法。形态判断法常用于物种水平的鉴别；种群水平的识别，曾使用生化方法，但该方法较为繁锁，且误判率也较高，现基本上不再采用，取而代之的是一种分子标记的方法。因为分子标记的稳定性好，现被广泛地应用于鱼类种群识别、种群遗传结构、遗传作图等理论研究，以及鱼类保护生物学和鱼类遗传育种等实践领域。
[0003]目前，基于DNA片段差异作为分子标记的主要有3种:(I)基于PCR的分子标记技术，如限制性片段长度多态性，随机扩增多态性DNA，基因特异扩增片段长度多态性等；
(2)基于重复序列的分子标记，如微卫星DNA和小卫星DNA; (3)基于转座子的插入和缺失的分子标记，如Tcl和SINE。
[0004]SINE ( short interspersed element , SINE )称短散在重复序列，序列长度一般仅为100~500 bp,在真核生物基因组中的拷贝数为103~105，散布于生物基因组内。SINE具有3个结构域:5’端tRNA相关区、tRNA非相关区、3’端尾区。SINE在相关的逆转座酶的介导下，通过“复制一插入”的机制，其复制子整合到宿主的基因组内。SINE插入到基因组内后，将会产生稳定的遗传；而且宿主对SINE的插入缺乏删除机制，使得不同种系基因组的等位点产生SINE的插入或缺失，通过“插入或缺失”性状，可识别不同的种系或种群。
[0005]中国专利文献CN101864476A公开了一种一种特异性鉴别刀鲚与凤鲚的PCR技术。根据刀鲚与凤鲚线粒体DNA控制区(D-1oop)和细胞色素b (Cytochrome b)基因的保守序列，设计出两对特异引物，制定了便捷的鉴别刀鲚与凤鲚的PCR反应体系。提取鱼肌肉DNA进行PCR扩增，取扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下检测，如P1F/R引物对扩增产物存在1220bp DNA条带，P2F/R引物对无扩增，则确定所检鲚鱼为刀鲚jBPlF/R引物对无扩增，P2F/R引物对产物存在280bp DNA条带，则可确定为凤鲚。
[0006]目前，针对鱼类开发的SINE分子标记非常稀少，对于名贵的刀鲚{Coilia nasus)的不同生态型种群的SINE标记还未见研究报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记，所述的分子标记为SINE插入位点的特异引物，所述的特异引物为Locus 5位点、Locus 29位点或Locus 60位点的引物的一种或者其组合,所述的引物序列分别为: Locus 5位点的上游引物如SEQ ID N0.1所示，
Locus 5位点的下游引物如SEQ ID N0.2所示，
Locus 29位点的上游引物如SEQ ID N0.3所示，
Locus 29位点的下游引物如SEQ ID N0.4所示，
Locus 60位点的上游引物如SEQ ID N0.5所示，
Locus 60位点的下游引物如SEQ ID N0.6所示。
[0009]所述的分子标记用于识别刀鲚的不同种群。
[0010]所述的分子标记进行种群识别的方法，包括以下步骤:运用所述的分子标记通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，根据扩增片段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
[0011]本发明优点在于:
基于SINE位点扩增片段的数目和大小的分子标记技术，可以快速、准确地确定刀鲚种群。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]附图1是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江苏靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱阳湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)种群，每个种群样本数10尾(I 一 10)，Locus5 DNA片段的扩增结果。
[0013]附图2是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江苏靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱阳湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)种群，每个种群样本数10尾(I 一 10)，Locus29 DNA片段的扩增结果。
[0014]附图3是刀鲚的6个不同种群:浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江苏靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱阳湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)种群，每个种群样本数10尾(I 一 10)，Locus60 DNA片段的扩增结果。
【具体实施方式】
[0015]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0016]本发明通过选择SINE插入位点的侧翼序列，设计特异引物，利用PCR、分子克隆和测序等现代分子生物学技术，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统获得的图片，根据凝胶图片上DNA片段的大小和数目，识别刀鲚不同生态型种群。
[0017]实施例1 实验材料
刀鲚按照样本来源，分为浙江象山港(XS)，上海崇明(CM)，江苏靖江(JJ)，太湖(TH)，江西鄱阳湖(PY)，湖南洞庭湖(DT)6个种群，每个种群样本数为10尾。浙江象山港样本来自水产品市场，采集地不祥，其余样本为随船捕捞。
[0018]基因组DNA提取
样本基因组DNA的提取，按照上海Sangon的UNIQ — 10柱式基因组DNA提取试剂盒说明书操作，提取的DNA用紫外分光光度计检测其质量和浓度，-20°C保存备用。
[0019]位点分离
根据SINE的保守序列设计引物，通过PCR方法获得刀鲚基因组中SINE部分序列，此序列的5端连接生物素，作为探针，然后与磁珠形成“探针一生物素一磁珠”复合体后，与酶切的刀鲚基因组DNA文库杂交，捕获文库中包含SINE的DNA片段，克隆和测序，由此得到刀鲚基因组中SINE插入位点的信息。
[0020]引物设计
根据SINE插入位点的侧翼序列，用PrimerPremier6.0软件和Jellyfishl.4软件,设计SINE插入位点的特异引物，由上海Sangon生物工程公司合成，PCR对刀鲚不同生态型种群的DNA扩增后，有3对引物在不同种群中扩增出差异的DNA条带，其序列分别是:
Locus 5 的上游引物:AGTATGCTTGTTCACGTTCA (SEQ ID N0.1)；
Locus 5 的下游引物:TTCGCTCTATTGCTCTGTGT(SEQ ID N0.2)；
Locus 29 的上游引物:ATTGAGCTGGTTCCTGTCATAACG(SEQ ID N0.3)；
Locus 29 的下游引物:GGTCATGTTG CCTGTGTGTCTTT (SEQ ID N0.4)；
Locus 60 的上游引物:CCACCAGGTCTGTCAGTGTTGT(SEQ ID N0.5)；
Locus 60 的下游引物:TGTTGTGAATGTGTCAGCAGTAAGG(SEQ ID N0.6)。
[0021]扩增和克隆
PCR扩增反应在德国Eppendorf公司生产的Mastercycler? ep gradient热循环仪上进行，每个扩增反应总体积为20ul，其中模板基因组DNAlOOng，每种dNTP，每种引物各0.5uI, TaqDNA 聚合酶 0.25U,反应液在 94°C预变性 3 min, 94°C变性 30sec，52°C退火 30sec(58°C Locus 29 和 Locus 60)，72°C延伸 8min，共 35 个循环，最后在 72°C延伸 1min0 PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中分离，用上海Sangon公司胶回收试剂盒纯化切取的扩增片段，纯化方法参照产品手册进行，将回收的DNA片段克隆于载体PMD19 — T (TakaRa公司)，连接反应及细菌转化按PMD19 - T载体试剂盒说明书进行操作。
[0022]测序和序列分析
选取阳性克隆菌落，经PCR鉴定后，由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用Blastn软件进行核苷酸序列相似性比较，分析所得克隆序列是否在其他物种中存在同源性。依据Jellyfish软件分析SINE的插入或缺失。
[0023]综合运用以上实验方法与技术，扩增刀鲚不同生态型种群中SINE插入或缺失位点的DNA片段，下面将结合附图，进一步详述其扩增结果在刀鲚种群识别上的应用。
[0024]从图1可知，XS、CM、JJ、TH的群体中，大部分样本能扩增出3条大小分别约为650bp的条带，少部分样本能扩增出350,280bp的条带；PY、DT的群体中，绝大部分样本能扩增出350，280bp的条带，仅在DT6和DT8样本中扩增出650 bp的条带。测序结果表明:650bp的条带具有200bp的一个单元的SINE序列；350bp的条带没有SINE序列；而280bp的条带为非特异性扩增的结果。Locus 5位点的350bp的条带，用于识别PY和DT种群样本的准确率90% (18/20)，而从XS、CM、JJ、TH群体中误判为PY和DT样本率为17.5% (7/40)。
[0025]从图2可知，XS、CM、JJ、TH的群体的样本，都能扩增出I条约为500 bp的条带；PY、DT群体样本都能扩增出I条大约400bp的条带。测序结果表明:500bp的条带具有202bp的一个单元的SINE序列；400bp的条带仅具有部分SINE序列(96bp)，为SINE的部分片段缺失的结果。Locus 29位点的400bp的条带，用于识别PY和DT种群样本的准确率100%，可把PY、DT种群与XS、CM、JJ、TH群体相区分。
[0026]从图3可知，XS、CM、JJ、TH的群体样本都能扩增出2条大小分别约为700、200 bp的条带；PY、DT的群体样本都能扩增出I条约为350bp的条带。测序结果表明:700、350bp的条带具有168bp的一个单元的SINE序列；而200bp的条带不具有SINE序列。Locus 60位点的350bp的条带，用于识别PY和DT种群样本的准确率100%，可把PY、DT种群与XS、CM、JJ、TH群体相区分。
[0027]综合使用上述3个位点的SINE分子标记，可快速、准确地识别出刀鲚的鄱阳湖和洞庭湖的种群。
[0028]实施例2
实验方法
SINE插入位点的特异引物，其序列为:
Locus 5位点的上游引物如SEQ ID N0.1所示，
Locus 5位点的下游引物如SEQ ID N0.2所示，
Locus 29位点的上游引物如SEQ ID N0.3所示，
Locus 29位点的下游引物如SEQ ID N0.4所示，
Locus 60位点的上游引物如SEQ ID N0.5所示，
Locus 60位点的下游引物如SEQ ID N0.6所示。
[0029] 通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，根据扩增片段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
[0030]实施例3 实验方法
SINE插入位点的特异引物，其序列为:
Locus 5位点的上游引物如SEQ ID N0.1所示，
Locus 5位点的下游引物如SEQ ID N0.2所示。
[0031]通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，分析Locus 5位点的测序结果，能够扩增出3条大小为650 bp的条带但不能扩增出350，280bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚，能扩增出350，280bp的条带但不能扩增出650 bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
[0032]实施例4 实验方法
SINE插入位点的特异引物，其序列为:
Locus 29位点的上游引物如SEQ ID N0.3所示，
Locus 29位点的下游引物如SEQ ID N0.4所示。
[0033]通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，分析Locus 29位点的测序结果，能扩增出I条约为500 bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚，能扩增出I条约为350bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
[0034]实施例5 实验方法
SINE插入位点的特异引物，其序列为:Locus 60位点的上游引物如SEQ ID N0.3所示，
Locus 60位点的下游引物如SEQ ID N0.4所示。
[0035]通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，分析Locus 60位点的测序结果，能够扩增出2条大小分别约为700、200 bp的条带的样本为象山港、崇明、靖江或太湖的刀鲚，能扩增出I条约为350bp的条带的样本为鄱阳湖或洞庭湖的刀鲚。
[0036]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于刀鲚不同生态型种群识别的分子标记，其特征在于，所述的分子标记为SINE插入位点的特异引物,所述的特异引物为Locus 5位点、Locus 29位点或Locus 60位点的引物的一种或者其组合，所述的引物序列分别为: Locus 5位点的上游引物如SEQ ID N0.1所示， Locus 5位点的下游引物如SEQ ID N0.2所示， Locus 29位点的上游引物如SEQ ID N0.3所示， Locus 29位点的下游引物如SEQ ID N0.4所示， Locus 60位点的上游引物如SEQ ID N0.5所示， Locus 60位点的下游引物如SEQ ID N0.6所示。
2.根据权利要求1所述的分子标记的用途，其特征在于，所述的分子标记用于识别刀鲚的不同种群。
3.根据权利要求1所述的分子标记进行种群识别的方法，其特征在于，包括以下步骤:运用所述的分子标记通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、克隆、测序获得SINE位点的种群特异性的DNA片段，根据 扩增片段数目、大小的差异性，识别出刀鲚的不同种群。
【文档编号】C12Q1/68GK104073562SQ201410329645
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】刘 东, 唐文乔, 郭弘艺 申请人:上海海洋大学