一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有四种针对MTHFR基因的探针，以及两种针对MTRR基因的探针和两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与上述基因的SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1-8所示。本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，也能够实现低通量的检测，灵活性高，对于有些医院临床样本不多的情况下可操作性强，且设备投入少，成本低廉。
【专利说明】一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种叶酸代谢能力相关基因检测技术，属于分子生物学基因芯片【技术领域】，具体属于体外诊断试剂领域中SNP多态性检测方法，更具体地是运用了多重聚合酶链式反应技术和反向点杂交技术。
【背景技术】
[0002]中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的20%。我国常见的出生缺陷有神经管畸形、先天性心脏病、唇腭裂、尿道下裂等。据中国疾病预防控制中心统计资料显示，每年有80万-120万名出生缺陷儿，平均每30秒就有一名缺陷儿出生。其中，除20% -30%患儿经早期诊断和治疗可以获得较好生活质量外，30% -40%患儿在出生后死亡，约40%将成为终身残疾，这意味着每年将有40万家庭被卷入终生痛苦的漩涡中。
[0003]出生缺陷的发生原因十分复杂，有些还不为人类所认识，但主要是遗传因素、环境因素或二者的共同作用。我国是全球神经管畸形高发国家，最常见的就是脊柱裂儿和无脑儿，近年来大量研究已经证实，叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因:一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因)缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下(叶酸代谢通路障碍)。
[0004]叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低出生体重等发病率。
[0005]科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。随着生命科学技术的发展，叶酸利用能力基因检测与风险评估于2008年即已被中国疾病预防控制中心妇幼保健中心列为临床应用指南(参见《妇幼保健医疗临床遗传检测项目资料汇编》第六卷临床应用指南之二十一《叶酸利用能力》)。这一崭新的生命科学技术成果近两年来已在国内部分妇幼保健院(四川省内如德阳市妇幼保健院)取得较大成效，为个体化(差异化)增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供了更高水平的科学手段和临床依据。
[0006]但是，在妇幼保健院的应用中发现一个普遍存在的问题，即50%以上的孕妇是在无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后至少2~3个月(怀孕前三个月即应开始增补叶酸)，错过了补充叶酸的关键时期，不利于预防胎儿神经管缺陷。因此，应该提倡叶酸增补从新婚开始(在发达国家，新婚期即开始了叶酸的增补)。
[0007]男性增补叶酸对优生有着同等重要的意义。科学研究进一步表明，叶酸摄入不足，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果:一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱，二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。
[0008]综上所述，通过最先进的科学手段检测每对新婚夫妇对叶酸的利用能力，不仅可以实现个性化增补叶酸，还可以增强新婚夫妇增补叶酸的意识和依从性，从而更有效地降低新生儿出生缺陷风险。
[0009]科学研究证实，与叶酸代谢密切相关的基因是5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。研究发现，MTHFR677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100%，携带CT基因型的活性则为CC的71%，基因型为TT型的只有34%。另外，研究还发现，MTHFRl298位点的多态性也是影响该酶的活性的一个重要因素，携带MTHFR1298C等基因的酶活性为野生型1298A的68%左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。
[0010]甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。主要突变型有122M(A66G)
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[0011]MTHFR和MTRR等基因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
[0012]目前市面上有关叶酸相关基因检测的方法主要是测序法，虽然测序法是基因检测的“金标准”，但是测序法检测周期长，在临床上，对于患者来说，他们是希望越快拿到检测结果越好，所以测序法不利于临床上开展叶酸代谢相关基因的检测。而且测序法成本相对还高，对患者和相关检测机构来说，成本都很高，这进一步限制其在临床上的应用。因此，需要一种既方便又经济的检测方法就迫在眉睫。
【发明内容】
[0013]本发明提供了一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒，解决了现有技术中的不足，本发明可以方便灵活地对单个或多个样本进行检测。
[0014]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0015]一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有四种针对MTHFR基因的探针，以及两种针对MTRR基因的探针和两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与上述基因的SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列分别为:
[0016]针对MTHFR 基因 677C 位点的探针 Tl:5’ -GGGAGCCGATTTCATC-3’ ；如 SEQ ID NO:I所示，
[0017]针对MTHFR 基因 677T 位点的探针 T2:5’ -GGGAGTCGATTTCATC-3’ ；如 SEQ ID NO:2所示，
[0018]针对MTHFR 基因 1298A 位点的探针 T3:5 ’ -ACCAGTGAAGAAAGTGTC-3 ’ ；如 SEQ IDNO:3所示，
[0019]针对MTHFR 基因 1298C 位点的探针 T4:5 ’ -ACCAGTGAAGCAAGTGTC-3 ’ ；如 SEQ IDNO:4所示，
[0020]针对MTRR 基因 66A 位点的探针 T5:5 ’ -TCGCAGAAGAAATATGTGAG-3 ’ ；如 SEQ ID NO:5所示，
[0021]针对MTRR 基因 66G 位点的探针 T6:5’ -TCGCAGAAGAAATGTGTGA-3’ ；如 SEQ ID NO:6所示，
[0022]针对人类基因组设计的阳性质控探针T7:5’ -TTGAACAGGTGGAGGC-3’ ；如SEQ IDNO:7所示，
[0023]针对人类基因组设计的阴性质控探针T8:5’ -TGGCCAGCGTGGACAAC-3’ ；如SEQ IDNO:8所示，
[0024]上述探针均进行5’端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5_20uMo
[0025]所述的基质载体上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示:
[0026]5 ’ -TTCGGTTGGGCTTTAC-3 ’，所述显色控制探针CC的5 ’端进行氨基标记，3 ’端进行生物素标记。
[0027]所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下:
[0028]针对MTHFR基因677位点的上游引物Ml:
[0029]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTTCAGTCATGAGCCCAGCC-3，；如 SEQ ID NO:10 所示，
[0030]针对MTHFR基因677位点的下游引物M2:
[0031]5’ -GGGACACGCAGTCGACATCGCAAGTGATGCCCATGTC-3’ ；如 SEQ ID NO:11 所示，
[0032]针对MTHFR基因1298位点的上游引物M3:
[0033]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTTGCTTGTGGTTGACCTGG-3，；如 SEQ ID NO:12 所示，
[0034]针对MTHFR基因1298位点的下游引物M4:
[0035]5，-GGGACACGCAGTCGACATCTCCCTTTGCCATGTCCAC-3，；如 SEQ ID NO:13 所示，
[0036]针对MTRR基因66位点的上游引物M5:
[0037]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTAGCCCAAGTAGTTTCGAGC-3，；如 SEQ ID NO:14 所示，
[0038]针对MTRR基因66位点的下游引物M6:
[0039]5，-GGGACACGCAGTCGACATCCCACTGTAACGGCTCTAACC-3，，如 SEQ ID NO:15 所示。
[0040]所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下:
[0041]通用上游引物M7:5’ -GGAGGACTGCTCACGAACT-3’ ；如 SEQ ID NO:16 所示；
[0042]通用下游引物M8:5’-GGGACACGCAGTCGACATC-3’ ；如 SEQ ID NO: 17 所示；所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
[0043]所述的基质载体为玻片或尼龙膜。
[0044]本发明同时还提供了针对叶酸代谢基因进行基因分型的方法，该方法包括以下步骤:
[0045]A.设计相关基因分型的引物和探针，所述探针如SEQ ID NO: 1_9所示，所述引物如 SEQ ID NO:10-16 所示。
[0046]B.用活性氨基标记步骤A中的探针的5’端，并将其依次固定在尼龙膜上，制成检测的膜条，对所述下游通用引物M8的5’端进行生物素标记，对显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，并对其3’端进行生物素标记。
[0047]C.利用步骤A所述引物进行人类基因组的PCR扩增，将扩增产物与检测膜条杂交，以过氧化物酶和四甲基联苯胺显色。
[0048]D.采用扫描仪进行杂交信号的扫描或是肉眼直接观察，然后判断分型结果。
[0049]本发明提供的技术方案与现有技术相比有以下优点:
[0050](I)本发明的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，也能够实现低通量的检测，灵活性高，对于有些医院临床样本不多的情况下可操作性强，且设备投入少，成本低廉。
[0051](2)本发明对样本的要求很低，可以是抗凝血，也可以是无创采样的唾液等。
[0052](3)本发明的试剂盒由于采用通用引物进行PCR扩增，扩增条件一致的情况下，还只使用了一个生物素标记的通用引物，大大节省了试剂成本，相比市面上的一些试剂成本更低廉。
[0053](4)本发明的一个特点是试剂盒中有阳性质控探针、阴性质控探针以及显色反应质控探针，阳性质控可以监控DNA提取的质量，PCR反应的过程等，阴性质控可以监控PCR过程中的污染等情况，显色反应点可以监控杂交过程是否正确与否，这些质控的加入，大大增加了结果的可靠性和准确性。
[0054](5)本发明的另一个意义是通过MTHFR基因677、1298位点基因型及MTRR基因66位点基因型的结果，结合临床情况来综合判断叶酸的合理摄入量，从而有效指导合理用药。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]图1为本发明所提供的试剂盒中基质载体上各探针位置示意图；
[0056]图2为本发明实施例中进行PCR扩增的循环参数图。
[0057]图3为MTHFR基因677TT、1298GG基因型及MTRR基因66GG基因型结果扫描图；
[0058]图4为MTHFR基因677CC、1298AA基因型及MTRR基因66AA基因型结果扫描图；
[0059]图5为MTHFR基因677CT、1298AG基因型及MTRR基因66AG基因型结果扫描图；
[0060]图6为MTHFR基因677CC、1298AG基因型及MTRR基因66GG基因型结果扫描图；
【具体实施方式】
[0061]下面结合具体实施例和附图对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0062]本实施例提供的针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒，括PCR反应液和DNA杂交膜条，所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有四种针对MTHFR基因的探针，以及两种针对MTRR基因的探针和两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与上述基因的SNP位点杂交的寡核苷酸序列，基质载体上各探针位置如图1所示。所述的基质载体可以是玻片、尼龙膜或是其他可以固定探针的载，本实施例中为尼龙膜。
[0063]上述探针中，针对MTHFR基因677C位点的探针Tl其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。针对MTHFR基因677T位点的探针T2其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。针对MTHFR基因1298A位点的探针T3其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。针对MTHFR基因1298C位点的探针T4其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。针对MTRR基因66A位点的探针T5其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。针对MTRR基因66G位点的探针T6其核苷酸序列如SEQ IDN0:6所示。针对人类基因组设计的阳性质控探针T7其核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。针对人类基因组设计的阴性质控探针T8其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。上述探针均进行5’端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5-20uM。
[0064]本发明中将高灵敏度的多重聚合酶链反应(PCR)技术和反向点杂交技术进行了结合，从而得到一种全新的基因及基因突变检测技术。本发明中将特异的探针分别固定到固相载体上，再将经PCR特异性扩增的产物(在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，通过酶联反应及显色，肉眼就能判断出基因分型的结果，更适用于临床检测的需要。本发明具体针对MTHFR基因677位点、1298位点及MTRR基因66位点的核苷酸序列，设计一套特异性的探针，采用合适的浓度，按照图1所示位置，采用自动点样仪进行点样，将相应探针印制在尼龙膜相应区域上，在本实施例中将探针稀释到5XSSC、0.05% SDS溶液中，终浓度为5uM，每个探针点样lul，从而制成特定的杂交膜条。根据显色位点的不同，来判断各位点的基因型别。
[0065]所述的尼龙膜上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。所述的显色控制探针CC 的引入可对显色过程进行有效的质量控制。
[0066]所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下:针对MTHFR基因677位点的上游引物Ml其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，针对MTHFR基因677位点的下游引物M2其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，针对MTHFR基因1298位点的上游引物M3:其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，针对MTHFR基因1298位点的下游引物M4其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，针对MTRR基因66位点的上游引物M5其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，针对MTRR基因66位点的下游引物M6其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0067]所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下:通用上游引物M7其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；通用下游引物M8其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
[0068]在实际检测时，将提取好的基因组DNA加入到PCR反应液中，采用多重PCR反应，扩增出带有生物素标记的目的基因片段，取DNA杂交膜条和45ulPCR产物进行杂交显色反应，杂交温度设定为45°C，杂交时间为60分钟，然后洗涤，再显色，肉眼判断显色结果。
[0069]本实施中例提供的上述试剂盒进行基因分型的方法如下:
[0070]取100例临床样本进行本发明的试剂盒进行检测，同时用测序法进行对比实验。
[0071]a.样本DNA的提取。
[0072]临床样本可以是EDTA-抗凝血，也可以是唾液样本，方便灵活多样，采用市面上相应的试剂盒进行提取DNA。取5ulDNA加入到试剂盒中的PCR反应液中，
[0073]b.按图2所示循环参数进行PCR扩增:
[0074]c.采用本发明的DNA杂交膜条，对以上PCR产物进行杂交检测。首先将PCR产物进行预变性，95°C，5min，然后立即置于冰水混合物上预冷。
[0075]d.杂交:
[0076]取5mL离心管，放入标记膜条I张，标记好对应的检测样本编号，加2ml杂交缓冲液液、对应的PCR产物40ul，盖紧管盖，放入振荡水槽(或空气浴摇床)，45°C下轻摇(约100转/分)40分钟。同时预热洗膜缓冲液。
[0077]e.偶联:
[0078]杂交结束后，将膜条从杂交管里取出，放入50mL离心管中(最多可在同一管里处理10张膜片)；
[0079]加预热洗膜缓冲液20ml，POD液1ul，混匀，使膜条充分展开。45°C轻摇(40~50转/分)10分钟，弃去液体；
[0080]加预热洗膜缓冲液40ml，45°C轻摇3分钟，弃去液体；重复I次；
[0081]加显色缓冲液40ml，室温轻摇3分钟，弃去液体。
[0082]f.显色:
[0083]取50ml离心管，加显色缓冲液20ml，TMBlml，H2O21ul,混匀即为显色液。
[0084]放入膜条后水平混匀，使膜条充分展开后在室温避光静置8分钟，弃去液体。
[0085]加显色缓冲液40ml，轻摇3分钟，弃去液体。取出杂交膜条，显色完成。
[0086]g.结果分析:
[0087]用吸水纸吸去膜条表面水分，在扫描仪上尽快扫描。显色反应控制点(CC)显色正常，表示偶联和显色过程正常，否则需要重新检查杂交过程。
[0088]图3、图4、图5、图6为膜条杂交结果显色扫描图，参照分型结果进行分析和统计。与测序结果进行对比发现，一致性为100%。
[0089]实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势，一次可做任意数量的样本，检测的准确性和可靠性都很高，检测结果与测序结果完全相符。
[0090]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种针对叶酸代谢基因进行基因分型的试剂盒，包括PCR反应液和DNA杂交膜条，其特征在于:所述的DNA杂交膜条由基质载体和探针组成，基质载体上依次固定有四种针对MTHFR基因的探针，以及两种针对MTRR基因的探针和两种针对人类基因组设计的探针，所述探针均为能够与上述基因的SNP位点杂交的寡核苷酸序列，所述探针的核苷酸序列分别为: 针对 MTHFR 基因 677C 位点的探针 Tl:5’ -GGGAGCCGATTTCATC-3’ ； 针对 MTHFR 基因 677T 位点的探针 T2:5’ -GGGAGTCGATTTCATC-3’ ； 针对 MTHFR 基因 1298A 位点的探针 T3:5’ -ACCAGTGAAGAAAGTGTC-3’ ； 针对 MTHFR 基因 1298C 位点的探针 T4:5’ -ACCAGTGAAGCAAGTGTC-3’ ； 针对 MTRR 基因 66A 位点的探针 T5:5’ -TCGCAGAAGAAATATGTGAG-3’ ； 针对 MTRR 基因 66G 位点的探针 T6:5’ -TCGCAGAAGAAATGTGTGA-3’ ； 针对人类基因组设计的阳性质控探针T7:5’ -TTGAACAGGTGGAGGC-3’ ； 针对人类基因组设计的阴性质控探针T8:5’ -TGGCCAGCGTGGACAAC-3’ ； 上述探针均进行5’ 端氨基标记以用于与基质载体偶联，上述探针的浓度为5-20uM。
2.根据权利要求1所述的进行基因分型的试剂盒，其特征在于:所述的基质载体上还设置有显色控制探针CC，所述显色控制探针CC的核苷酸序列如下所示: 5’ -TTCGGTTGGGCTTTAC-3’，所述显色控制探针CC的5’端进行氨基标记，3’端进行生物素标记。
3.根据权利要求1所述的进行基因分型的试剂盒，其特征在于:所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的引物，所述引物的浓度为0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下: 针对MTHFR基因677位点的上游引物Ml:
5， -GGAGGACTGCTCACGAACTTCAGTCATGAGCCCAGCC-3，； 针对MTHFR基因677位点的下游引物M2:
5’ -GGGACACGCAGTCGACATCGCAAGTGATGCCCATGTC-3’ ； 针对MTHFR基因1298位点的上游引物M3:
5’ -GGAGGACTGCTCACGAACTTGCTTGTGGTTGACCTGG-3’ ； 针对MTHFR基因1298位点的下游引物M4:
5’ -GGGACACGCAGTCGACATCTCCCTTTGCCATGTCCAC-3’ ； 针对MTRR基因66位点的上游引物M5:
5’ -GGAGGACTGCTCACGAACTAGCCCAAGTAGTTTCGAGC-3’ ； 针对MTRR基因66位点的下游引物M6:
5，-GGGACACGCAGTCGACATCCCACTGTAACGGCTCTAACC-3，。
4.根据权利要求1所述的进行基因分型的试剂盒，其特征在于:所述PCR反应液中含有扩增包含MTHFR基因677位点、1298位点以及MTRR基因66位点的通用引物，所述通用引物的浓度为0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下: 通用上游引物 M7:5’ -GGAGGACTGCTCACGAACT-3’ ； 通用下游引物 M8:5’ -GGGACACGCAGTCGACATC-3’ ； 所述通用下游引物的5’端进行生物素标记。
5.根据权利要求1所述的进行基因分型的试剂盒，其特征在于:所述的基质载体为玻片或尼龙膜。
【文档编号】C12Q1/68GK104131087SQ201410330456
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】徐志勇, 秦伟 申请人:武汉千麦医学检验所有限公司