一种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用方法
【专利摘要】本发明涉及一种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用方法，属微生物发酵食品工程领域。本方法特征在于云南风味腌菜的微生物发酵剂由3株乳酸菌、3株增香酵母菌和1株红曲霉组成。3株乳酸菌制成菌粉，按重量比2:2:1混合成乳酸菌剂1；3株增香酵母菌制成菌粉，按重量比1:1:1混合成酵母菌剂2；1株红曲霉制成红曲霉菌粉3；把乳酸菌剂1、酵母菌剂2、红曲霉菌粉3按重量比5:1:1混合制成云南风味腌菜的微生物发酵剂。应用时，本发明的微生物发酵剂添加量为青菜重量0.0875%，均匀撒入到已备好的青菜或通过发酵池回淋管加入到发酵池中。本发明生产的云南风味腌菜色泽鲜亮、酸味纯正、硝酸盐含量极低、质量可控。
【专利说明】—种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用，属微生物发酵食品工程领域。
【背景技术】
[0002]腌菜是我国传统发酵蔬菜制品之一，其生产是利用食盐的高渗透作用，以乳酸菌发酵为主的微生物发酵过程。其原理是利用食盐的高渗透压作用、微生物(主要是乳酸菌，还有部分酵母菌、醋酸菌等)的发酵作用和蛋白质的水解作用，以及其它一系列的生物化学变化，最终使腌制品得以保存，并具有独特的色、香、味。
[0003]目前，国内腌菜企业多采用自然发酵工艺，该工艺的弊端有:(I)发酵周期相对较长，生产力低下；(2)受卫生条件、生产季节和用盐量影响，发酵易失败；(3)发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准化生产；(4)沿用老泡溃盐水的传统工艺，难以实现大规模的工业化生产；(5)异地生产，难以保证产品的一致性；(6)亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差。为了解决上述问题，国内外相继进行了乳酸菌纯菌种发酵和直投式菌种发酵的研究，取得了较好的效果:Caldwell B1fermentat1n Canada inc.在1998年获得了复合菌种接种发酵蔬菜的专利技术；李幼筠等在1996年分离出干酪乳杆菌和短乳杆菌作为发酵剂代替野生菌株的自然发酵，缩短了生产周期，提高了产品质量，并申请了专利；蒋和体认为生产泡菜的纯接种应是植物乳杆菌、发酵乳杆菌和肠膜明串珠菌这3种菌以3:1:1比例混合最佳；罗云波却认为以上3种菌的混合比例应为5: 3: 2最佳；陈惠音报道了超低盐多菌种快速发酵腌菜，采用1-1.5%的盐，并添加适量蔗糖、葡萄糖、乙醇，采用肠膜明串珠菌、植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌混合发酵，并确定了最佳发酵条件；张建军研究了甘蓝乳酸发酵和葛笋纯接种乳酸发酵，确定了最佳发酵条件，并发现纯接种蔬菜发酵应采用异型乳酸发酵等等。但腌菜生产是一个十分复杂的微生物发酵过程，同时伴随着复杂的生物化学变化和物理变化，腌菜在很多方面仍然是“知其然不知其所以然”，国内腌菜还需加强以下方面的研究:优良腌菜乳酸菌种的筛选和不同乳酸菌种之间的配、乳酸菌发酵工艺技术、终止发酵和防腐保鲜技术、适宜的发酵温度、风味改善、食品安全等坐寸ο
[0004]另外，国内对腌菜的研究主要集中在韩国泡菜、四川泡菜、东北腌菜和苏浙酱菜等方面，对云南风味酸腌菜报道极少。云南是一个有着多种少数民族的地区，各地民族都有着自己独特的饮食文化与自己喜好的传统腌菜的加工方法。云南风味酸腌菜不同于韩国泡菜、四川泡菜、东北腌菜和苏浙酱菜等，具有独特的色、香、味。云南风味酸腌菜以青菜为原料，青菜是十字花科蔬菜，含丰富的硫糖苷，每一种硫糖苷经腌制都能产生相应的特征风味。云南风味酸腌菜的特征风味物质是以烯丙基异硫氰酸酯为主要成分的无色至淡黄色透明状液体，俗称芥子油。因此，云南风味酸腌菜一般微辣、偏酸、色鲜、有香味。
[0005]目前，云南的腌菜企业也多是采用自然发酵工艺，该工艺的弊端在云南腌菜行业普遍存在。本发明针对自然发酵工艺的弊端，发明了一种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用方法。
[0006]本发明采用从云南省最大的腌菜企业——云南宏斌绿色食品有限公司，市场畅销的云南风味腌菜产品中，分离筛选得到产酸和降硝酸盐效果较好的3株乳酸菌(经云南省微生物研究所鉴定，分别为:戍糖乳杆菌/--?11SW1S、胚芽乳酸杆菌LactobaciIlus plan tarum、戍糖片球菌 Ped1coccus pen tosaceus0 )，添加云南省微生物研究所保藏的3株产香酵母菌(季也聚假丝酵母Candida讲iT7i6?r?o/7￡/i1、异常汉逊酵母Hansenula 7a、球拟酵母5/7)和 I株产红色素的红曲霉(ifciftasass anka),组成复合微生物发酵剂；应用方法为:先将按青菜重量0.0875%的微生物发酵剂均匀撒入到已备好的青菜中，再将按青菜重量6%的食盐均匀撒入；或是先用青菜重量6%的食盐在发酵池中腌制青菜1-2天，再把按青菜重量0.0875%的微生物发酵剂通过发酵池回淋管，加入到发酵池中。本发明具有发酵菌种可控、发酵时间缩短、食盐用量减少、不需添加色素等优点，本发明生产的云南风味腌菜色泽鲜亮、酸味纯正、硝酸盐含量极低、质量可控。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于:针对目前云南风味腌菜普遍采用的自然发酵工艺存在的发酵周期长；发酵质量不稳定；不利于工厂化、规模化及标准化生产；产品质量不稳定；安全性差、工艺过程难控制等弊端，提供一种云南风味腌菜的微生物发酵剂及其应用方法，其具有发酵菌种可控、发酵时间短、食盐用量低、不需添加色素、产品工艺和质量可控、操作简单等优点。
[0008]本发明的目的通过以下技术方案实现。
[0009]1、菌株:
乳酸菌3株:戍糖乳杆菌Lac tobaciIlus pen tosus、胚芽乳酸杆菌Lac tobaciIlus
戍糖片球菌Ped1coccus从云南省最大的腌菜企业-云南宏斌绿色食品有限公司市场畅销的云南风味腌菜产品中分离筛选得到，由云南省微生物研究所鉴定保减；
增香酵母菌3株:季也聚假丝酵母gui 11 iermondi 1、异常iyj逊藤母Hansenula
球拟酵母Torulopsis sp,由云南省微生物研究所保藏；
红曲霉I株:红曲霉Mwa1Sa1S1S anka,由云南省微生物研究所保藏。
[0010]2、培养基
用于制备乳酸菌种子的乳酸菌种子培养基(MRS培养基):蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、7水硫酸镁0.58g、4水硫酸锰 0.25g、琼脂 20g、水 100mL, ρΗ6.2-6.4，121°C、30min 灭菌；
乳酸菌扩大培养基(MRS培养基):蛋白胨10g、牛肉膏10g，酵母膏5g、葡萄糖20g、磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，醋酸钠5g，7水硫酸镁0.58g，4水硫酸锰0.25g，水100mL,pH6.2-6.4 o 121°C、30min 灭菌;
用于乳酸菌的菌落计数的乳酸菌分离培养基(MRS+溴甲酚紫):MRS (成分见上)，溴甲酚紫 0.lg, 121°C、30min 灭菌；
用于制备酵母菌种子和酵母菌菌落计数的酵母菌种子和分离培养基(YPD培养基):酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000 mL, pH自然,121°C、30min灭菌； 酵母菌扩大培养基(YPD培养基):酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、水lOOOmL，pH自然，121。。、30min 灭菌；
用于制备红曲霉种子的红曲霉种子培养基:6-8飞^麦芽糖lOOOmL、可溶性淀粉50g、蛋白胨30g、琼脂30g、冰醋酸2mL，121°C、30min灭菌；
红曲霉的扩大培养基:大米，洗净浸泡浙干、蒸煮熟透、高温蒸汽消毒30min ；
用于霉菌的菌落计数(包括红曲霉的菌落计数)的霉菌分离培养基:(马丁氏培养基):磷酸二氢钾lg、葡萄糖10g、7水硫酸镁0.5g、蛋白胨5g、琼脂18g、孟加拉红0.033g、水lOOOmL, 121°C>30min 灭菌。
[0011]3、实施方法 (O菌株的活化
乳酸菌的活化:无菌条件下，在MRS斜面培养基上划线接种，置于36°C ±1°C温箱静止培养2d，再转接到另一支MRS斜面培养基上，置于36°C ± I°C的温箱静止培养2d，如此重复转接培养三次。
[0012]增香酵母菌的活化:无菌条件下，在Yro斜面培养基上划线接种，置于28°C ±1°C温箱静止培养2d，再转接到另一支YPD斜面培养基上，置于28°C ± 1°C温箱静止培养2d，如此重复转接培养三次
红曲霉的活化:无菌条件下，在红曲霉培养基斜面上接种，置于30°C 土1°C温箱里静止培养14d，再转接到另一支红曲霉培养基上，置于30°C ± 1°C温箱静止培养14d，如此重复转接培养三次。
[0013](2)种子制备
乳酸菌种子的制备:将活化好的斜面菌种在无菌条件下接种在MRS三角瓶液体培养基中，置于36°C ±l°C、160r/min振荡培养2d。
[0014]增香酵母菌种子的制备:将活化好的斜面菌种在无菌条件下接种在YPD三角瓶液体培养基中，置于28°C ±l°C、160r/min振荡培养2d。
[0015]红曲霉种子的制备:将活化好的斜面菌种在无菌条件下接种在红曲霉种子培养基的三角瓶液体培养基中，置于30°C ±l°C、160r/min振荡培养14d。
[0016](3)菌粉制备
乳酸菌菌粉制备:将制备好的乳酸菌种子液，在无菌条件下接种在200L，装有MRS液体培养基的发酵罐中，36°C ±l°C、160r/min培养2d左右，乳酸菌活菌数高于18个/ml时，终止发酵，进行离心(10000r/min, 4min),收集菌体低温干燥，磨细成粉。
[0017]增香酵母菌菌粉制备:将制备好的增香酵母菌种子液，在无菌条件下接种在200L，装有Yro液体培养基的发酵罐中，28°C ±l°C、160r/min振荡培养2d左右，酵母菌活菌数高于18个/ml时，终止发酵，进行离心(10000r/min, 4min),收集菌体低温干燥，磨细成粉。
[0018]红曲霉菌粉制备:将大米洗净浸泡14h?15h后捞出浙干，采用蒸煮熟透，分装入100rnl三角瓶中，分别用4层纱布和纸封住罐头瓶口，再经高温蒸汽消毒30min，冷却至35°C以下，在无菌条件下分装至罐头瓶中待用；在半无菌条件下，将制备好的红曲霉种子液，按米饭重量的10-12%接入装有米饭的罐头瓶中，用无菌竹筷充分拌匀，置于30°C ± IV的温箱里培养14d左右，红曲霉菌活菌数高于18个/g时，终止发酵，出料于无菌纸袋中，在不高于45°C的烘箱中烘干，磨细成粉制成红曲霉菌粉3备用。
[0019](4)云南风味腌菜微生物发酵剂制备
?巴 3 株酸菌 actobacillus pen tosus > Lactobacillus pi an tarum ^ Ped1coccuspentosaceus的菌粉按重量比2:2:1混合成乳酸菌剂I ;
3Candida guiIliermondii > Hansenula anomala > Torulopsis sp 白勺菌粉，按重量比1:1:1混合成酵母菌剂2 ；
把乳酸菌剂1、酵母菌剂2和红曲霉菌粉3，按重量比5:1:1混合，就制成云南风味腌菜的微生物发酵剂。
[0020](5)利用云南风味腌菜微生物发酵剂人工发酵腌菜
方法一:
青菜原料洗净，切割，晾干表明水分；
按青菜原料重量的0.0875%称取发酵剂，同时按青菜原料重量6%称取食盐；
先把发酵剂均匀撒入青菜，再把食盐均匀撒入青菜，然后快速充分拌匀、装罐压紧，室温进行发酵；
方法二:
青菜原料准备:要求青菜成熟度、脱水程度、洁净度符合要求，过磅；
腌制池准备:清洁腌制池，要求池中无积水、无杂物，在腌制池过道边的一角安放回淋管；
发酵剂和食盐准备:按青菜原料重量的0.0875%称取发酵剂，同时按青菜原料重量6%称取食盐；
下池:将青菜整齐堆放进腌制池中(每层堆码厚度15cm-20cm)，堆菜方法按阶梯形叠压(第二层的菜杆压在第一层的菜叶上，依次类推)，堆一层菜均匀撒一层发酵剂和食盐，先均匀撒发酵剂，再均匀撒食盐，层菜层发酵剂层盐，菜梗菜叶相互叠放；
压池:将剩余的食盐撒入最上一层青菜面上后压池，压池第一层用塑料网，第二层用木板，第三层用装2/3水的200kg塑料桶，木板与塑料网应铺放平整，青菜不得外漏，所有压池材料应清洗干净，以防止酸菜发霉变质；
回淋:压池的第2天后，有大量汁液渗出时，开始回淋，每天回淋一次，第7天后每3天回淋一次，每次回淋时间不低于30分钟；当菜体开始变色(正常色为淡黄色)，芥辣味刺鼻，刺眼，盐度稳定后进行并池；
并池:将初腌的青菜取出，互相合并，将腌制池并满；要求边并边压实，排除菜体之间的空气，可防止氧化变色和防止腐败菌的大量繁殖，有利于厌氧发酵；
封池:将青菜表面扒平，压实，撒上一层盐(20kg左右)，铺上食品级薄塑料膜，压平，四周密封好，再在塑料膜的上面铺上约5cm厚的食盐将池口全部密封；在盐的上面再用塑料膜盖严池口 ；发酵过程中不能随便开池透空气，防止氧化变色和好氧菌繁殖；
出池:封池自然发酵3个月后，即可得到味浓郁清香，色泽淡黄的半成品腌菜一腌菜坯，腌菜坯出池进行后续加工。
[0021]方法三:
青菜原料准备:要求青菜成熟度、脱水程度、洁净度符合要求，过磅；
腌制池准备:清洁腌制池，要求池中无积水、无杂物，在腌制池过道边的一角安放回淋管；
发酵剂和食盐准备:按青菜原料重量的0.0875%称取发酵剂，同时按青菜原料重量6%称取食盐；
下池:将青菜整齐堆放进腌制池中(每层堆码厚度15cm-20cm)，堆菜方法按阶梯形叠压(第二层的菜杆压在第一层的菜叶上，依次类推)，堆一层菜均匀撒一层食盐，层菜层盐，菜梗菜叶相互叠放；
压池:将剩余的食盐撒入最上一层青菜面上后压池，压池第一层用塑料网，第二层用木板，第三层用装2/3水的200kg塑料桶，木板与塑料网应铺放平整，青菜不得外漏，所有压池材料应清洗干净，以防止酸菜发霉变质；
回淋:压池的第2天后，有大量汁液渗出时，开始回淋；第一次回淋时，把准备好的发酵剂加入到渗出的汁液中，回淋不低于12小时；之后每天回淋一次，第7天后每3天回淋一次，每次回淋时间不低于30分钟；当菜体开始变色(正常色为淡黄色)，芥辣味刺鼻，刺眼，盐度稳定后进行并池；
并池:将初腌的青菜取出，互相合并，将腌制池并满；要求边并边压实，排除菜体之间的空气，可防止氧化变色和防止腐败菌的大量繁殖，有利于厌氧发酵；
封池:将青菜表面扒平，压实，撒上一层盐(20kg左右)，铺上食品级薄塑料膜，压平，四周密封好，再在塑料膜的上面铺上约5cm厚的食盐；将池口全部密封；在盐的上面再用塑料膜盖严池口 ；发酵过程中不能随便开池透空气，防止氧化变色和好氧菌繁殖；
出池:封池自然发酵3个月后，即可得到味浓郁清香，色泽淡黄的半成品腌菜一腌菜坯，腌菜坯出池进行后续加工。
[0022]四、
【具体实施方式】
通过下列实施例来更清晰的说明本发明的目的、技术方案和优点。实施例中未注明具体条件的实验方法，按文献公开的常规方法和条件进行。
[0023]实施例1:
青菜准备:将18Kg成熟度、脱水程度符合要求的青菜原料洗净，切割，晾干表面水分，备用;
发酵菌剂和食盐准备:按青菜重量的0.0875%称取发酵剂15.75g，同时按青菜重量6%称取食盐1080g ；
菌剂接种:先把发酵剂均匀撒入青菜，再把食盐均匀撒入青菜，然后快速充分拌匀、装罐压紧，6公斤/罐。
[0024]发酵培养:将装罐青菜置于宏斌公司的厂房屋檐台上，室温进行发酵培养。90d后就可得到美味可口的云南风味酸腌菜产品。
[0025]实施例2:
10吨青菜准备:要求青菜成熟度、脱水程度、洁净度符合要求，过磅。
[0026]腌制池准备:清洁腌制池，确保池中无积水、无杂物，在腌制池过道边的一角安放回淋管。
[0027]称量出微生物发酵剂8750g，称量出食盐600Kg。
[0028]下池:将青菜整齐堆放进腌制池中(每层堆码厚度15cm-20cm)，堆菜方法按阶梯形叠压(第二层的菜杆压在第一层的菜叶上，依次类推)，堆一层菜均匀撒一层发酵剂和食盐，先均匀撒发酵剂，再均匀撒食盐，层菜层发酵剂层盐，菜梗菜叶相互叠放。根据腌制池的容积，每池堆放3300Kg青菜左右。
[0029]压池:将剩余的食盐撒入最上一层青菜面上后压池，压池第一层用塑料网，第二层用木板，第三层用装2/3水的200Kg塑料桶，木板与塑料网应铺放平整，青菜不得外漏，所有压池材料应清洗干净，以防止酸菜发霉变质。
[0030]回淋:压池的第2天后，有大量汁液渗出，开始回淋，每天回淋一次，第7天开始每3天回淋一次，每次回淋时间不低于30分钟；当菜体开始变色(正常色为淡黄色)，芥辣味刺鼻，刺眼，盐度稳定后进行并池；
并池:将三个腌制池钟初腌的青菜合并到一个腌制池；边并边压实，排除菜体之间的空气，防止氧化变色和防止腐败菌的大量繁殖，有利于厌氧发酵；
封池:将青菜表面扒平，压实，撒上一层盐(20Kg左右)，铺上食品级薄塑料膜，压平，四周密封好，再在塑料膜的上面铺上约5cm厚的食盐；将池口全部密封；在盐的上面再用塑料膜盖严池口 ；发酵过程中不能随便开池透空气，防止氧化变色和好氧菌繁殖。
[0031]出池:封池发酵3个月后，即得到味浓郁清香，色泽淡黄的半成品腌菜一腌菜坯，腌菜坯出池进行后续加工。
[0032]实施例3:
900Kg青菜准备:要求青菜成熟度、脱水程度.洁净度符合要求，过磅。
[0033]腌制池准备:清洁腌制池，确保池中无积水、无杂物，在腌制池过道边的一角安放回淋管。
[0034]称量出微生物发酵剂787.5g，称量出食盐54Kg。
[0035]下池:将青菜整齐堆放进腌制池中(每层堆码厚度15cm-20cm)，堆菜方法按阶梯形叠压(第二层的菜杆压在第一层的菜叶上，依次类推)，堆一层菜均匀撒一层食盐，菜梗菜叶相互叠放。
[0036]压池:将剩余的食盐撒入最上一层青菜面上后压池，压池第一层用塑料网，第二层用木板，第三层用装2/3水的200kg塑料桶，木板与塑料网应铺放平整，青菜不得外漏，所有压池材料应清洗干净，以防止酸菜发霉变质。
[0037]回淋:压池的第2天后，有大量汁液渗出，开始回淋，第一次回淋时，把准备好的787.5g发酵剂加入到渗出的汁液中，回淋不低于12小时；之后每天回淋一次，第7天开始每3天回淋一次，每次回淋时间不低于30分钟；当菜体开始变色(正常色为淡黄色)，芥辣味刺鼻，刺眼，盐度稳定后进行封池。
[0038]封池:将青菜表面扒平，压实，撒上一层盐(20Kg左右)，铺上食品级薄塑料膜，压平，四周密封好，再在塑料膜的上面铺上约5cm厚的食盐(以60Kg/平方米的标准向塑料布上平铺洒盐)将池口全部密封；在盐的上面再用塑料膜盖严池口 ；发酵过程中不能随便开池透空气，防止氧化变色和好氧菌繁殖。
[0039]出池:封池发酵3个月后，即得到味浓郁清香，色泽淡黄的半成品腌菜一腌菜坯，腌菜坯出池进行后续加工。
【权利要求】
1.一种云南风味腌菜的微生物发酵剂，其特征在于:由3株乳酸菌(戊糖乳杆菌 Lactobacillus pentosus、胚芽乳酸杆菌 Lactobacillus plantarum、戍糖片球菌Ped1coccus pentosaceus、)、3株增香酵母菌(季也聚假丝酵母Candida guilliermondi1、异常汉逊酵母Hansenula anomala、球拟酵母Torulopsis sp)和I株红曲霉(Monasassanka)组成。
2.根据权利要求1所述的云南风味腌菜的微生物发酵剂，其特征在于:3株乳酸菌戊糖乳杆菌 Lactobacillus pentosus、胚芽乳酸杆菌 Lactobacillus plantarum、戍糖片球菌Ped1coccus pentosaceus菌粉,按重量比2:2:1混合制成乳酸菌剂I ;3株增香酵母菌季也聚假丝酵母Candida guilliermondi1、异常汉逊酵母Hansenula anomala、球拟酵母Torulopsis sp菌粉按重量比1:1:1混合制成酵母菌剂2 ；1株红曲霉(Monasass anka)菌粉制成红曲霉菌粉3 ;把乳酸菌剂1、酵母菌剂2、红曲霉菌粉3按重量比5:1:1混合制成云南风味腌菜的微生物发酵剂。
3.一种云南风味腌菜的微生物发酵剂的应用方法，其特征在于:先将按青菜重量0.0875%的微生物发酵剂均匀撒入到已备好的青菜中，再将按青菜重量6%的食盐均匀撒入；或是先用青菜重量6%的食盐在发酵池中腌制青菜1-2天，再把按青菜重量0.0875%的微生物发酵剂通过发酵池回淋管，加入到发酵池中。
【文档编号】C12N1/16GK104263669SQ201410332866
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】任洪冰, 沈锐, 侯春, 赖泳红, 李治滢 申请人:云南宏斌绿色食品有限公司