一种检测活体酵母细胞upr水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用的制作方法

一种检测活体酵母细胞upr水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用，质粒为pUST-08质粒，利用基因克隆技术，依次将Gal10p、Rluc-Hac1p、Hac1i、Fluc克隆到质粒YCplac33中，组成Gal10p-Rluc-Hac1p-Fluc-Hac1i?UPR检测双荧光素酶报告元件。该系统可用于检测活体酵母细胞UPR水平。本发明检测周期短、灵敏度高、实验操作简便、成本低。
【专利说明】—种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用

【技术领域】
[0001]本发明属于用于细胞UPR检测质粒及其构建和应用领域，特别涉及一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用。

【背景技术】
[0002]当大量未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网上过度积累时，在真核生物酵母乃至高等哺乳动物细胞中都广泛存在一种内质网胁迫应激机制，其中最显著的就是未折叠蛋白响应(UPR)，UPR通过激发IREl在内的多种调节因子，并利用IREl的核酸内切酶活性识别并剪切HAC13’末端的内含子序列，使Hacli丧失对HACl翻译抑制作用提高HACl的表达水平，进而提高下游蛋白折叠相关的分子伴侣的表达，以此降低未折叠蛋白在内质网上的过度积累应对内质网胁迫。
[0003]内质网胁迫及未折叠蛋白响应与重组蛋白的异源表达产率密切相关(appliedmicrob1logy and b1technology46, 365,1996)，也与人类的神经性病变、心血管疾病、糖尿病等多种疾病有直接的对应关系(Science Translat1nal Medicine5,138, 2013 ；Nature Reviews Drug Discoveryl2, 703, 2013),针对UPR进行的检测和研究是探索相关工业和医疗蛋白质生产、疾病发病机制的重要技术手段(Methods Enzymol.490,31,2011),同时也是相关疾病治疗及诊断的重要突破口(Science Translat1nal Medicine5,138,2013)。
[0004]利用信使HACl选择性剪接对UPR的响应机制(celll07，103，2001)，将HACl启动子及内含子移植到表达质粒中研究UPR产生后IREl对质粒HACl的调控机制。证实了 HACl在表达质粒中同样具有灵敏的UPR响应调控机制。
[0005]现有检测UPR水平的方法主要有(I) RT-PCR或northern-blot检测HACl表达水平及HACl内含子剪接率；(2)利用未折叠蛋白响应元件UPRE来检测UPR水平；(3)利用免疫共沉淀(IP)分析UPR相关蛋白的表达量来检测UPR水平；(4)通过生化指标，如Ca2+含量等，来检测细胞UPR水平。但都存在无法克服的缺点，如:
[0006]1.RT-PCR或Northern-blot实验周期长、灵敏度低；
[0007]2.检测UPRE或IP时难以避免蛋白折置受抑制后对标记蛋白折置的干扰；
[0008]3.现有的Ca2+等离子测定精度不高，且实验成本高、实验周期长；
[0009]4.需要借助内参进行定量，无法对活体细胞进行高通量检测；


【发明内容】

[0010]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒及其构建和应用，该发明检测周期短、灵敏度高、实验操作简便、成本低。
[0011]本发明的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒，所述质粒为pUST-08质粒；具体为GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR双荧光素酶报告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0012]本发明的一种监测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的构建，包括:
[0013](I)设计用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR扩增的上下游引物；
[0014](2)利用PCR技术，以含Gal 1p序列的质粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的质粒PJD375和含Hacli序列的酵母基因组作为扩增模板，扩增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列；
[0015](3)利用基因克隆技术，依次将GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到质粒YCplac33中，组成Gal1p-Rluc-Haclp-Fluc-HacIi UPR双荧光素酶报告元件，即为pUST-08 质粒。
[0016]所述步骤(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR扩增的上下游引物为:
[0017]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ;如 SEQ ID NO:1 所示
[0018]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ;如 SEQ ID NO:2 所示
[0019]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ;如 SEQ ID NO:3 所示
[0020]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；如SEQ ID NO:4 所示
[0021]Hacl1-F:GGGGTAC CTATAGCGGGAAACAGTCTAC ;如 SEQ ID NO:5 所示
[0022]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ;如 SEQ ID NO:6 所示
[0023]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ;如 SEQ ID NO:7 所示
[0024]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC? 如 SEQ ID NO:8 所示
[0025]所述PUST-08是一种能够在大肠杆菌及酿酒酵母中稳定复制表达的低拷贝穿梭型重组质粒。所述pUST-08能够通过其双荧光素酶报告元件中的HACl内含子序列响应UPR，调控其上游的Fluc报告基因的表达。
[0026]所述pUST-08能够通过其双荧光素酶报告元件中的GallO启动子，控制双荧光素酶报告元件的转录的开启与关闭，提高UPR监测的操作性。
[0027]所述双荧光素酶报告元件中的Rluc可作为UPR检测时萤火虫荧光素酶报告基因Fluc的内对照，消除单一报告基因在UPR检测过程中，因内质网胁迫后的蛋白折叠效率改变，对单一荧光素酶活性造成的干扰。
[0028]本发明的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，包括:
[0029](I)将pUST-08转入酿酒酵母BY4741a中，于SC-URA培养基中筛选；
[0030](2)将上述携带有pUST-08的酵母BY4741a进行复苏，次日进行活化，离心，洗涤，配制酵母菌悬液；
[0031](3)取上述酵母菌悬液，并分成两等份，分别转移到培养板中，静置诱导，然后向一份中加入D-突光素钾柠檬酸钠溶液,另一份加入腔肠素溶液，避光晃动20-30s,然后在Imin内检测荧光素酶荧光值。
[0032]所述步骤⑵中活化为0.60D_的初始菌浓活化4hr。
[0033]所述步骤⑵中洗涤为用无菌水悬洗。
[0034]所述步骤⑵配制酵母菌悬液为:用2%葡萄糖为碳源的SC_URA、2%半乳糖作为碳源的SC-URA或2%半乳糖作为碳源并添加药物的SC-URA悬起来，即得。
[0035]所述药物衣霉素Tm和/或二硫苏糖醇DTT ;优选浓度为0.5mg/ml或2mg/ml的衣霉素(Tm)，0.1mM或0.5mM的二硫苏糖醇(DTT)。
[0036]所述步骤(3)中静置诱导为30°C静置诱导3hr。
[0037]所述步骤(3)中D-荧光素钾柠檬酸钠溶液的浓度为ImM，腔肠素溶液的浓度为20 μ M ；D-荧光素钾柠檬酸钠溶液或腔肠素溶液于酵母菌悬液的体积比为1:1。
[0038]本发明设计并构建一种能够检测活体细胞内UPR的质粒及利用该质粒检测不同UPR激活剂处理后活体细胞中的UPR水平。更具体的说，将HACl启动子5’UTR序列Haclp、HACl内含子Hacli及其3’UTR序列完整移植到低拷贝穿梭质粒YCplac33中，借助HACl在UPR激活后的特殊剪接机制，利用该质粒搭载的双荧光素酶报告基因，监测活体细胞内UPR的情况。
[0039]内质网胁迫及未折叠蛋白响应与重组蛋白的异源表达产率，以及人类的神经性病变、心血管疾病、糖尿病等多种疾病密切相关，以HACl剪切为基础的UPR检测技术是研究蛋白药物生产、相关疾病的发病机制及药物筛选的重要技术手段。但现有检测技术存在操作繁琐、灵敏度低等缺陷，难以满足相关疾病研究及药物筛选的高灵敏度、高通量的要求。依照本发明构建的UPR监测质粒能够方便、快捷、高通量的监测活体细胞的UPR情况。
[0040]有益.效果
[0041](I)检测周期短:利用pUST-08质粒对酵母UPR水平进行检测周期短，仅需要3h的诱导、处理时间及Imin的检测时间即可完成对酵母UPR水平的检测，而传统RT-PCR检测方法，则需要3h的药物处理、5h的总RNA提取、2h的cDNA合成、3h的PCR检测、30min的凝胶电泳检测。本检测系统可以大大缩短检测周期；
[0042](2)灵敏度高:传统RT-PCR法检测HACl剪切率，仅能检测高浓度UPR诱导剂的UPR水平，对于低浓度UPR诱导剂的UPR水平则难以检测。而本检测系统，在检测低浓度的UPR诱导剂，如0.5 μ g/mL的衣霉素(Tm)、0.1mM的二硫苏糖醇(DTT)，依然可以检测出UPR水平；
[0043](3)实验操作简便、成本低:常规RT-PCR操作繁琐、成本高昂，RT-PCR检测主要包括总RNA的提取，cDNA的合成，PCR检测，凝胶电泳检测等内容，总RNA提取及cDNA的合成需要使用价格较为昂贵的试剂盒。而本检测系统，仅需要将待测样品放置在30°C恒温箱中静置3h，加入荧光底物，直接可以通过多功能荧光酶标仪进行检测，相比较传统RT-PCR检测法，本法操作更为简便、成本更低；
[0044](4)不需要额外设置内参:对比与UPRE-LacZ通过检测淀粉酶活性的办法，往往需要额外设置内参，且使用检测精确度不高。而UPR检测质粒中GallOp启动子和Rluc海肾荧光素酶基因的加入，为本检测系统提供了检测所需的本底和内参。检测过程中，将不进行半乳糖诱导的荧光值作为本底，将RLU作为内参，可以方便的通过减去本底，对比RLU荧光强度计算出实际的FLU表达水平；
[0045] (5)本检测系统具有传统RT-PCR、Northern-blot、UPRE_Lacz不具备的优势，如周期短、灵敏度高、操作简便、不需要额外设置内参等特点，此外本检测系统还可以利用多功能酶标仪进行闻通量检测，本检测系统在细胞内质网胁迫、UPR应激等相关疾病及基础研究中具有良好的应用前景。

【专利附图】

【附图说明】
[0046]图1为UPR检测质粒pUST-08的工作原理图；
[0047]图2为UPR检测质粒pUST-08的构建示意图；
[0048]图3为常规RT-PCR技术检测野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT 处理后 HAClmRNA 的剪接率，图中 HAClu 为 unspliced HACl,即代表未发生剪接的HACl ;图中HACls为spliced HACl，即代表剪接后的HACl ；ACT1为内参；
图4为hac I Λ、ire I Λ衣霉素、DTT敏感度测试，SC+Tm为SC培养基中额外添加0.5 μ g/mL的衣霉素，SC+DTT为SC培养基中额外添加0.5mM DTT ；
[0049]图5为通过多功能荧光酶标仪检测到pUST-08质粒在野生型与HACl缺陷型酵母中诱导表达后产生的相对Fluc/Rluc荧光强度比值；
[0050]图6为通过多功能荧光酶标仪检测到pUST-09质粒在野生型酵母中诱导表达后产生的相对Fluc/Rluc荧光强度比值；
[0051]图7为通过多功能荧光酶标仪检测到pUST-08质粒在IREl缺陷型酵母中诱导表达后产生的相对Fluc/Rluc荧光强度比值。

【具体实施方式】
[0052]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0053]实施例1
[0054]UPR检测质粒pUST-08的构建
[0055]利用常规基因克隆技术依次将可操纵启动子GallOp、荧光素酶报告基因Rluc、HACl启动子5’ UTR序列Haclp、HACl内含子Hacli及其3’ UTR序列、荧光素酶报告基因Fluc克隆到酵母低拷贝穿梭型质粒YCplac33中(如图2所示)。
[0056]1、设计引物
[0057]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
[0058]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
[0059]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
[0060]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
[0061]Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
[0062]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
[0063]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
[0064]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
[0065]2、以质粒 YEP51-LIPIN1 为模板、GallOp - F 和 GallOp - R 作为扩增引物(GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；)，使用常规PCR体系反应程序进行PCR扩增，PCR扩增条件为:95°C预热3min ；35个循环，每个循环包括:94°C变性20秒，55°C退火30s，72°C延伸
2.5min ;最后72°C延伸lOmin。获得GallOp的PCR产物，再将PCR产物进行纯化回收。
[0066]3、将纯化后的Gal 1p的PCR产物及YCplac33进行Hindi 11,XbaI双酶切，酶切产物进一步进行纯化回收。
[0067]4、将纯化后的酶切产物GallOp及YCplac33经T4连接酶的作用下进行连接，转入大肠杆菌DH5 α后，经含氨苄青霉素筛LB平板筛选后获得正确质粒，所获质粒为YCplac33-Gall0p。
[0068]5、以质粒PJD375为模板、Rluc - Haclp - F和Rluc - Haclp _ R作为扩增引物(Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG)，使用常规PCR体系反应程序进行PCR扩增，PCR扩增条件为:95°C预热3min ;35个循环，每个循环包括:94°C变性20秒，55°C退火30s，72°C延伸Imin ;最后72°C延伸lOmin，获得Rluc-Haclp的PCR产物，再将PCR产物进行纯化回收。
[0069]6、将纯化后的 Rluc-Haclp 的 PCR 产物及 YCplac33_Gall0p 进行 Xba1、BamHI 双酶切，酶切产物进一步进行纯化回收。
[0070]7、将纯化后的酶切产物Rluc-Haclp及YCplac33_经T4连接酶的作用下进行连接，转入大肠杆菌DH5 α后，经含氨苄青霉素筛LB平板筛选后获得正确质粒，所获质粒为YCplac33_Gal1p-Rluc-HacIp。
[0071]8、以质粒PJD375为模板、Hacl1- F和Hacli _ R作为扩增引物(Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；Hacli _ R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；)，使用常规 PCR 体系反应程序进行PCR扩增，PCR扩增条件为:95°C预热3min ;35个循环，每个循环包括:94°C变性20秒，55°C退火30s，72。。延伸30s ;最后72°C延伸lOmin，获得Hacli的PCR产物，再将PCR产物进行纯化回收。
[0072]9、将纯化后的 Hacli 的 PCR 产物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp 进行 ΚρηΙ、EcoRI双酶切，酶切产物进一步进行纯化回收。
[0073]10、将纯化后的酶切产物Hacli及YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp经T4连接酶的作用下进行连接，转入大肠杆菌DH5 α后，经含氨苄青霉素筛LB平板筛选后获得正确质粒，所获质粒为 YCplac33-Gal 1p-Rluc-HacIp-HacIi。
[0074]11、以质粒PJD375为模板、Fluc - F和Fluc _ R作为扩增引物(Flue - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC)，使用常规 PCR 体系反应程序进行PCR扩增，PCR扩增条件为:95°C预热3min ;35个循环，每个循环包括:94°C变性20秒，55°C退火30s, 72°C延伸lmin30s ;最后72°C延伸1min,获得Fluc的PCR产物，再将PCR产物进行纯化回收。
[0075]12、将纯化后的 Fluc 的 PCR 产物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 进行BamH1.Kpnl双酶切，酶切产物进一步进行纯化回收。
[0076]13、将纯化后的酶切产物 Hacli 及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 经 T4 连接酶的作用下进行连接，转入大肠杆菌DH5 α后，经含氨苄青霉素筛LB平板筛选后获得正确质粒，所获质粒 YCp Iac33-Gal 1p-Rluc-Hac lp-Fluc-Hac I i，并命名为 pUST-08。
[0077]14、对所构建的pUST-08质粒送测序公司进行测序，测序结果与酿酒酵母基因文库(SOT)中的HACl序列、YEP51-LIPIN1质粒、PJD375质粒序列分别进行比对，证明所构建的质粒序列完全正确。
[0078]实施例2
[0079]利用UPR常规检测技术RT-PCR来检测HAClmRNA的选择性剪接规律
[0080]利用常规RT-PCR技术检测野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT 处理后 HAClmRNA 的剪接率
[0081]1、优选地使用引物
[0082]ACT1-F:GCTTTGTTCCATCCTTCTG，如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0083]ACT 1-R: GAAACACTTGTGGTGAACGjn SEQ ID NO: 10 所示；
[0084]HAC1-F:AGGAAAAGGAACAGCGAAGGjn SEQ ID NO: 11 所示；
[0085]HAC1-R:GAATTCAAACCTGACTGCGC，如 SEQ ID NO: 12 所示。
[0086]2、按照常规RT-PCR技术检测HACl剪接率其步骤为:(I)将野生型酵母BY4741a克隆，挑入3mL SC-URA液体培养基中作为种子菌，30°C，180rpm，过夜培养；(2)次日，将上述种子菌分别转接到新鲜6mL SC-URA液体培养基，保证初始菌浓在0.40D_左右，30°C，180rpm，额外添加0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT进行处理3h，同时以不添加任何药物的组作为对照组，同样步骤处理3h ； (3)按照takara公司的酵母总RNA提取试剂盒(yeast RNAiso kit, code:D300)的步骤提取野生型酵母总RNA ; (4)按照 takara 公司的 cDNA 合成试剂盒(PrimeScript?IIlst Strand cDNA Synthesis Kit,6210A)操作方法合成cDNA ； (5)按照常规PCR技术对HACl进行PCR检测，通过凝胶电泳及凝胶成像仪进行光密度分析，并根据分析结果计算不同药物处理后酵母HACl的剪接率。
[0087]3、结果，采集各处理组的样品(n = 2)进行HACl剪接率分析，不进行药物处理的对照组HACl剪接率7.5 %，0.5 μ g/mL衣霉素处理的酵母HACl剪接率为8.9 %，2 μ g/mL衣霉素处理的酵母HACl剪接率为24.9%，0.1mM的DTT处理的酵母HACl剪接率为9.1%，
0.5mM的DTT处理的酵母HACl剪接率为11.5%。对各组的酵母HACl剪接率进行显著性方差分析，设定α为0.05，发现仅2 μ g/mL衣霉素处理后的酵母HACl剪接率与对照组的HACl剪接率有显著性差异(如附图3所示)。
[0088]实施例3
[0089]had Δ、irel Δ为UPR超敏感菌株的证实
[0090]IREl介导的HAClmRNA剪切激活是UPR的重要途径之一，合成的HACl能够通过激活下游UPR相关基因的表达提闻内质网蛋白折置能力，以缓解内质网胁迫。HACl或IREl的缺陷将导致细胞应对环境胁迫下的IRE1/HAC1为的内质网胁迫解救机制失效，加剧细胞内的未折叠蛋白在内质网上的积累。为了证实该论点，对HACl和IREl缺失突变体进行UPR诱导药物的敏感性试验。
[0091]1、将待测菌株(BY4741a，hacl Λ、irel Λ)挑入3mL SC液体培养基中作为种子菌，30°C，180rpm，过夜培养。
[0092] 2、取约I X 17的酵母细胞(0D_~I)，10倍比进行梯度稀释后(稀释5个梯度)，每个浓度梯度取5ul稀释后的菌液，滴在含有待测药物(0.5 μ g/mL的衣霉素、0.5mM DTT)的SC固体培养基中，以不含的待测药物的SC固体培养基作为对照，30°C培养2~5d后观察。
[0093]3、通过药物敏感性试验，可以发现HACl和IREl的缺陷菌株表现出对UPR诱导药物高度敏感(如图4所示)，证实了 haclA、irelA为UPR超敏感菌株。
[0094]实施例4
[0095]pUST-08质粒检测UPR可靠性、灵敏度的证实为了验证所构建的pUST_08UPR检测质粒的可靠性，将所构建的pUST-08质粒分别转入野生型和HACl缺陷型酵母中，检测衣霉素、DTT等药物处理后UPR水平。利用药物、浓度及菌株间的药物敏感度不同所产生的UPR水平差异，来检测本检测系统的可靠性，并对比实施例2的RT-PCR结果，进一步论证本检测系统的灵敏度。
[0096]1、利用常规酵母电转化方法，将构建好的pUST-08分别转入野生型和HACl缺陷型酿酒酵母BY4741a中，经SC-URA平板筛选后获得阳性克隆。
[0097]2、将上述携带有pUST-08质粒的BY4741a阳性克隆，挑入3mL SC-URA液体培养基中作为种子菌，300C，180rpm,过夜培养。
[0098]3、次日，将上述种子菌分别转接到新鲜6mL SC-URA液体培养基，保证初始菌浓在0.60D_左右，30°C，180rpm，培养约4hr后菌浓达到1.40D6(I(I，从中各取ImL分成1、2、3、4、5、6共6组转移到1.5mL EP管中，6000g/min，3min收集。收集后各组菌沉淀用ImL的无菌水悬洗一次，以同样转速离心收集后，组I用ImL等体积的2%葡萄糖为碳源的SC-URA悬起来、组2用等体积的2%半乳糖作为碳源的SC-URA悬起来、组3~6分别等体积的2%半乳糖作为碳源并额外添加不同药物(0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT>0.5mM DTT)的 SC-URA 中悬起来。
[0099]4、各组设立2~4个平行各200 μ L，每个平行等分成两份各100 μ L转移到黑色96孔培养板中，封盖后30°C恒温静置3hr。
[0100]5、避光条件下，向其中一份中加入100 μ L的荧光虫荧光底物ImM D-1uciferin柠檬酸溶液(ImM D-luciferin0.1M柠檬酸钠，PH = 5.0溶剂)，向另一份加入100 μ L的腔肠素溶液(ImM腔肠素0.1M柠檬酸钠，PH = 5.0溶剂)，立即避光轻轻晃动30s，使底物与荧光素酶充分混匀。
[0101]6、立即在Imin内根据常规多功能酶标仪检测规程各样品的荧光值，检测模式为luminescence模式,检测类型为endpoint,积分时间Is,其他均为系统默认值。
7、实验过程中以同样携带pUST-08的hacl缺陷菌株作为对照，按本实施例步骤中的2~6步的方法对携带有pUST-08质粒的hacl缺陷菌株进行相同的操作及检测。
[0102]8、在野生型酵母进行的检测中，对比0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT处理后的Fluc/Rluc比值，发现野生型酵母经不同浓度不同药物处理后，Fluc/Rluc比值与不进行处理的对照有显著差异，且其比值与药物种类、处理浓度相对应(如附图5所示);通过与实施例2的结果进行对比，发现本检测系统且能检测出常规RT-PCR技术难以检测的低浓度的衣霉素和DTT所引起的UPR，证实该检测系统较常规UPR检测技术灵敏度更高；在1^(31突变菌株的检测中，进行相同药物及浓度的处理后，所检测到的UPR水平较野生型要高。但对于2 μ g/mL的衣霉素处理后UPR水平，两者无明显差异(如附图5所示)。基于上述结果，可以证实pUST-08质粒检测UPR可靠性高、灵敏度高。
[0103]实施例5
[0104]pUST-08质粒中的Haclintron剪接调节机制的证实
[0105]为了验证pUST-08质粒中的Haclintron剪接调节机制与内源Haclintron调节机制的一致性，分别针对Haclintron转录后调控及IREl介导的Haclintron剪接进行了验证。
[0106]1、在构建好的pUST-08基础上，在Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl终止序列CYClt,即 Fluc-CYClt-Hacli，将该质粒命名为 pUST-09 (PUST-09 型 Gal 10p-Rluc-Haclp-Fluc-CYCIt-HacIi UPR检测双荧光素酶报告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 14所示)。通过在Fluc下游引入CYCl终止序列，阻碍质粒中Hacli的转录,使质粒中的Hacli丧失翻译调控功能，以此验证pUST-08质粒中Haclintron对Fluc的调控作用。
[0107]2、按照实施例1的方法，在pUST-08中的Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl终止序列CYClt，将纯化后的pUST-08及PJD375进行BamH1、KpnI双酶切，酶切后进行凝胶电泳，将pUST-08酶切所得的约8.0kbp的pUST-08载体及PJD375酶切后所得的约1.9kbp的Fluc-CYClt片段进行割胶回收并纯化。
[0108]3、将纯化后的酶切产物pUST-08载体及Fluc-CYClt经T4连接酶的作用下进行连接，转入大肠杆菌DH5 α后，经含氨苄青霉素筛LB平板筛选，后经菌落PCR验证获得正确质粒，所获质粒即为pUST-09。
[0109]4、按照实施例4的方法，将质粒pUST-09转入野生型酿酒酵母中，经SC-URA平板筛选后获得阳性克隆。
[0110]5、按照实施例4的方法，利用pUST-09质粒检测衣霉素、DTT处理后野生型酵母的UPR水平。结果发现携带pUST-09的野生型酵母在不同浓度不同药物处理后，Fluc/Rluc比值与不进行处理的对照同样没有显著差异(如附图6所示)，pUST-08中Haclintron的正常转录是保证pUST-08具有UPR检测功能的重要前提。
[0111]6、按照实施例4的方法，将质粒pUST-08转入IREl缺陷型酵母中，经SC-URA平板筛选后获得阳性克隆。
[0112]7、按照实施例4 的方法，利用pUST-08质粒检测衣霉素、DTT处理后IREl缺陷型酵母的UPR水平。结果发现携带pUST-08的IREl缺陷型酵母在不同浓度不同药物处理后，Fluc/Rluc比值与不进行处理的对照同样没有显著差异(如附图7所示)，pUST-08中Haclintron剪接机制与内源Haclintron —样，是依赖于IREl的剪接调节机制。
[0113]8、基于本实例中第5条和第7条的结果，证实了 pUST-08质粒中的Haclintron剪接调节机制与内源Haclintron调节机制是一致的。
【权利要求】
1.一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒，其特征在于:所述质粒为pUST-08质粒；具体为GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR检测双荧光素酶报告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
2.一种如权利要求1所述的检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的构建，包括: (1)设计用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR扩增的上下游引物； (2)利用PCR技术，以含Gal1p序列的质粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的质粒PJD375和含HACi序列的酵母基因组作为扩增模板，扩增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列； (3)利用基因克隆技术，依次将GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到质粒YCplac33中，组成GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR双荧光素酶报告元件，即为pUST_08质粒。
3.根据权利要求2所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的构建，其特征在于:所述步骤(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR扩增的上下游引物为:
GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
Rluc - Haclp - F :GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
Rluc - Haclp _ R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
4.一种如权利要求1所述的检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，包括: (1)将pUST-08转入酿酒酵母BY4741a中，于SC-URA培养基中筛选； (2)将上述携带有pUST-08的酵母BY4741a进行复苏，次日进行活化，离心，洗涤，配制酵母菌悬液； (3)取上述酵母菌悬液，并分成两等份，分别转移到培养板中，静置诱导，然后向一份中加入D-荧光素钾柠檬酸钠溶液,另一份加入腔肠素溶液,避光晃动20-30s,然后在Imin内检测荧光素酶荧光值。
5.根据权利要求4所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述步骤(2)中活化为0.60D_的初始菌浓活化4hr。
6.根据权利要求4所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述步骤(2)中洗涤为用无菌水悬洗。
7.根据权利要求4所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述步骤(2)配制酵母菌悬液为:用2%葡萄糖为碳源的SC-URA、2%半乳糖作为碳源的SC-URA或2%半乳糖作为碳源并添加药物的SC-URA悬起来，即得。
8.根据权利要求7所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述药物为衣霉素Tm和/或二硫苏糖醇DTT。
9.根据权利要求4所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述步骤(3)中静置诱导为30°C静置诱导3hr。
10.根据权利要求4所述的一种检测活体酵母细胞UPR水平的双荧光素酶监测质粒的应用，其特征在于:所述步骤(3)中D-荧光素钾柠檬酸钠溶液的浓度为ImM，腔肠素溶液的浓度为20 μ M ；D-荧光 素钾柠檬酸钠溶液或腔肠素溶液于酵母菌悬液的体积比为1:1。
【文档编号】C12Q1/68GK104164443SQ201410333939
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】黄志伟, 房志家, 匡鑫, 杜秀秀, 刘伟伟, 肖君华 申请人:东华大学