牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及牙鲆原始生殖细胞调控序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用。牙鲆Nanos3基因的3’UTR序列如SEQ?ID?No.1中所示。所述SEQ?ID?No.1中所示的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达的应用。本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水鱼以及其它动物譬如斑马鱼PGCs的标记，以及PGCs中特异表达目的基因。
【专利说明】牙鲆原始生殖细胞Nan〇S3基因的调控序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及牙鲆原始生殖细胞调控序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞 Nanos3基因的调控序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国 的重要海水养殖鱼类。针对养殖牙鲆种质退化、抗病力下降，严重制约其养殖产业发展的现 象，近年来陆续在牙鲆中进行了多种育种方法的尝试。其中，性别控制育种、多倍体育种、分 子标记辅助选择育种作为常用的育种方法，既耗时又需要较大的水体，也无法将外源优良 性状基因导入。而且，通过保存亲本进行优良种质保存也需要大面积养殖水体。基于原始 生殖细胞（PGCs)的操作技术，则可以分离获得PGCs，并通过PGCs的冷冻保存技术来有效地 保存优良种质，如此减少优良性状牙鲆等鱼类种质资源保存需要的大量水体，也将促进人 工分子设计育种将外源优良性状基因导入技术的开发。然而，有关于牙鲆PGCs相关研究尚 未见到报道，PGCs特异基因及PGCs的标记也未获得。
【发明内容】
[0003] 本发明在于提供一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列及其应用。
[0004] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0005] -种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列，牙鲆Nanos3基因的3' UTR序列 如SEQ ID No. 1中所示。
[0006] 一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，所述SEQ ID No. 1中所示 的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表达的应用。
[0007] 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作为鱼类中调控目的基因在PGCs中特异 表达的应用。
[0008] 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作为斑马鱼或牙鲆中调控目的基因在PGCs 中特异表达的应用。
[0009] 本发明的优点：
[0010] 本发明是首次在牙鲆中发现原始生殖细胞标志因子的调控序列，并证实其有原 始生殖细胞特异性的调控作用，该序列在鱼类包括海水鱼类原始生殖细胞的标记、分离等 应用中具有极大的价值，这为鱼类包括海水鱼类原始生殖细胞相关研究提供了基础技术保 证。
[0011] 本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水鱼以及其它动物譬如斑 马鱼PGCs的标记以及PGCs中特异表达目的基因；在不影响原有细胞功能的条件下活体标 记。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为本发明实施例提供的Nanos3 3' UTR RACE电泳图谱。
[0013] 图2本发明实施例提供的pSP64Poly (A) (Promega)组成示意图。
[0014] 图3为本发明实施例提供的牙鲆Nanos3基因能够驱动GFP特异表达在斑马鱼 PGCs中的示意图。其中，GFP-YPNanos3 3' UTR mRNA标记斑马鱼原始生殖细胞（PGCs)，侧 面观，箭头所指位置是PGCs。hpf，受精后小时。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例详述本发明的实验步骤。
[0016] 实施例1
[0017] 1. RNA提取及SMATer3' RACE文库的构建
[0018] 牙鲆性腺的总RNA提取采用Trizol (Invitrogen)提取，具体步骤如下：取大约 0. lmg牙鲆性腺，加入0. lmL Trizol，充分混勻，然后加入TrizolO. 9mL，室温放置5min。加 入氯仿0. 2mL，剧烈振荡15s，室温放置3min。12000 X g，4°C，离心15min，离心后将离心管小 心取出。取上清到新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置l〇min，12000 X g，4°C， 离心10min。去掉异丙醇，加入预冷的75%乙醇lmL洗漆沉淀，7500Xg，4?，离心5min。去 掉乙醇，置于超净台中使乙醇挥发。加入水（无 RNA酶）30yL，55-60°C水浴10min使RNA 溶解，取出后置于冰上。加入luL DNase (无 RNA酶），37°C水浴15min，消化DNA以去除 DNA的残余。取出后置于冰上，lyL电泳检测质量及完整度，测吸光度检测浓度及质量。直 接用于余下实验，或者液氮速冻，-80°C保存
[0019] SMATer3' RACE cDNA 文库的合成利用 SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)试剂盒进行，具体操作如下：合成所用的引物：3'-RACEα)SPrimerA5'-AAGCAGTGGTATCA ACGCAGA GTA C(T)30VN - 3'（12 μ M)。
[0020] 取性腺总 RNA3. 75 μ L，1 μ L 反转录引物 3' -RACE CDS primer A70°C 3min，冰 上冷却 2min，离心，加入 2· 0 μ L5X First-Strand Buffer，1· 0 μ L DTT(20mM)，1· 0 μ L dNTP Mix (lOmM),0. 25 μ L RNase Inhibitor (40U/μ L),1. 0 μ L SMARTScribe? Reverse Transcriptase (100U)，混勻后离心，42°C温育 90min，然后 70°C 10min。离心后加 20 μ L 水 (无 RNA酶）稀释，-20°C保存备用。
[0021] 2、Nanos3 3' UTR 的获得。
[0022] PCR 所用弓丨物如下：（1) 10X Universal Primer A Mix(UPM)长弓丨物 5' - CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT - 3'（0· 4 μ Μ)，短引物 5' - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' (2 μ Μ) ； (2)Nested Universal Primer A(NUP)5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT-3,（10μΜ) ;(3)RACE15, -CCGACCTGGTGTATGGATCC CACTGG-3'（10μΜ) ;(4)RACE2 5'-CTGCGACAGTACGTGTGTCC CCTCTG-3'（10μΜ)。
[0023] 按照巢式PCR进行两次反应。
[0024] 第一次反应PCR管分配及所含混合物如下：
[0025]
【权利要求】
1. 一种牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列，其特征在于：牙鲆Nanos3基因的 3' UTR序列如SEQ ID No. 1中所示。
2. -种权利要求1所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在 于： 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作为在调控目的基因在原始生殖细胞中特异表 达的应用。
3. 按权利要求2所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在 于：所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作为鱼类中调控目的基因在PGCs中特异表达的 应用。
4. 按权利要求3所述的牙鲆原始生殖细胞Nanos3基因的调控序列的应用，其特征在 于：所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作为斑马鱼或牙鲆中调控目的基因在PGCs中特 异表达的应用。
【文档编号】C12N15/113GK104120129SQ201410336602
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】谭训刚, 李美洁, 王倩, 尤锋, 焦爽 申请人:中国科学院海洋研究所