一种区位选择性细菌硝基还原酶基因、其重组酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种突变型细菌硝基还原酶基因、其重组酶及其应用，属于酶工程领域。本发明提供的大肠杆菌硝基还原酶NfsB组合突变体T41L/N71S/F124W可显著改变对多硝基底物硝基还原的区域选择性，催化重要的工业原材料2,4-二硝基甲苯和2,4-二硝基苯甲醚专一性还原生成相应的2-NHOH产物。本方法具有产物纯度高，反应条件温和、易于放大等优势，且可根据目标化合物的结构特点，对酶进行理性设计，改变硝基还原的区域选择性，因此在羟氨化合物的生产中具有很好的应用前景。
【专利说明】一种区位选择性细菌硝基还原酶基因、其重组酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程领域，具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基 因的重组酶，及其在硝基区位选择性还原中的应用。
【背景技术】
[0002] 芳香羟胺（又名芳胺）是一种重要的有机合成中间体，被广泛用于阻聚剂、抗氧 齐IJ、农药、医药、化妆品等的合成。某些芳香羟胺本身也具有很高的药理及生理活性。目前 芳香羟胺的制备主要通过选择还原芳香硝基化合物来实现，常采用的方法有催化氢转移还 原法、金属选择还原法、电化学还原法等。然而这些制备方法对羟氨还原的选择性比较差， 中间体芳香羟胺迅速转化为相应的胺，且容易生成偶氮等一系列副产物。此外，化学还原羟 氨在反应条件上也比较苛刻，需要使用危险的高压装置、易燃的氢气、有毒的重金属或有害 的化学试剂等。相对于传统的化学制备方法，生物催化法除具有高效、特异的催化效率外， 其最大的优势在于无可比拟的化学选择性和区域选择性。同时，生物催化的反应条件温和， 可在常温常压、适宜pH的水相中进行反应，这与"可持续发展" "绿色化学"等工业发展目 标相符。
[0003] 硝基还原酶是一类依赖于FMN或FAD的细胞质酶，可利用NAD (P) Η催化硝基还原， 经亚硝基中间产物最终生成羟氨或氨基产物。利用硝基还原酶作为生物催化剂还原芳香硝 基化合物生成相应的羟胺产物的还原过程，越来越受到人们的关注。虽然多数硝基还原酶 可有效的实现单硝基化合物或无区位选择性差异的多硝基化合物的还原，但对于多硝基化 合物的专一选择性还原却难以实现。目前绝大多数多硝基化合物上硝基都存在位置差异， 以重要的工业原材料2, 4-二硝基甲苯（24DNT)为例，硝基还原酶可催化该底物生成2-羟 氨-4-硝基甲苯（2ΗΑΝΤ)或4-羟氨-2-硝基甲苯（4ΗΑΝΤ)。作为同分异构体的2ΗΑΝΤ和 4ΗΑΝΤ，由于其羟氨基团取代位置的不同，在医药、农药合成及应用上也互不相同。但酶催化 生成的羟氨混合产物由于化学性质相近，很难进行下一步分离纯化得到单一纯品，从而限 制了硝基还原酶在羟氨生物合成中的应用。若能通过对酶分子的改造，使其在底物催化过 程中专一性生成某一种目的还原产物，将大大减少后期分离纯化成本且绿色环保，有利于 硝基还原酶在羟氨生物合成中的应用和开发。
[0004] 因此，寻找开发具有不同专一还原选择性的硝基还原酶在羟氨化合物生物合成中 具有显著的商业价值和应用前景。
【发明内容】
[0005] 为获得专一区位选择性的硝基还原酶，本发明通过蛋白质结构及分子对接模拟分 析，发现124的氨基酸残基通过与底物侧链基团的相互作用从而影响底物在活性中心的定 位。若将124位的苯丙氨酸（Phe)突变为色氨酸（Trp)，可显著改变酶的区域选择性。与 野生型硝基还原酶相比，突变体T41L/N71S/F124W对重要的工业原材料2, 4-二硝基甲苯 (240阶')和2,4-二硝基苯甲醚（240隱吣的还原由4-順0!1产物转为2-順0!1产物，实现2-勵 2 的专一性还原。本文所述T41L、N71S、F124W的含义分别为：将41位的苏氨酸（Thr)突变 为亮氨酸（Leu)(简写为T41L)，将71位的天冬酰胺（Asn)突变为丝氨酸（Ser)(简写为 N71S)，将124位的苯丙氨酸（Phe)突变为色氨酸（Trp)(简写为F124W)。
[0006] 目前硝基还原酶的生理底物和催化机制尚不明确，尤其是针对于外源的硝基芳香 化合物而言，无法确定该底物在酶活性口袋内的正确定位，从而无法确定与侧链基团相互 作用的关键氨基酸以及其是如何影响底物在活性口袋内的定位。即使单点突变对酶的区位 选择性有一定程度的改变，但很难达到专一性区位选择性。通过对这一问题的分析，可能的 原因是酶对底物的结合和定位通常不是由某一个氨基酸所决定的，而是通过活性口袋内的 多个氨基酸共同作用实现的。同时对这些位点的突变具有很高的风险性和不确定性，虽然 在一定程度上可实现区位选择性的改变，但可能引起酶催化活性的降低甚至丧失。针对这 一问题，本发明在单点突变的基础上，进一步将有益突变位点进行组合突变，考察其对选择 性实现的协同作用。
[0007] 本发明具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组表达载体 和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该突变型硝基还原酶或含有该 突变型基因重组表达转化体作为催化剂在羟氨化合物生物合成中的应用。
[0008] 本发明的一方面在于提供一种突变型硝基还原酶的基因，命名为组合突变体 T41L/N71S/F124W,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009] 本发明的另一目的是提供上述突变型硝基还原酶基因编码的蛋白，氨基酸序列如 SEQ ID N0:2 所示。
[0010] 本发明的另一目的是提供含有该突变型硝基还原酶基因的重组表达载体及其重 组表达转化体。以及编码所述硝基还原酶突变体的DNA序列的基因工程菌或转基因细胞 系。
[0011] 本发明的另一目的是提供一种重组硝基还原酶的制备方法，其步骤包括：培养上 述含有该突变型硝基还原酶基因的重组表达转化体，从培养物中纯化得到突变型细菌硝基 还原酶的蛋白。
[0012] 上文所述的制备方法，其更具体的技术方案如下：根据大肠杆菌（Escherichia coli)硝基还原酶NfsB基因 NCBI编码：NC_000913,设计定点突变的突变引物，以携带硝基 还原酶基因的克隆载体为模板进行定点突变构建突变体；以pET-28a或能表达该酶的载体 为表达载体，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞或能表达该酶的宿主细胞，挑选 验证后的阳性单克隆进行发酵培养。经融合表达纯化得到突变型硝基还原酶蛋白。
[0013] 本发明的另一目的是提供上述技术方案中所述的突变型硝基还原酶基因编码 的蛋白或重组表达转化体，二者作为催化剂在催化硝基还原，在药物激活剂代谢、芳香羟 胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物代谢等领域的应用。组合突变体T41L/ 阶15作1241可高效还原重要的工业原材料2,4-二硝基甲苯（240阶')和2,4-二硝基甲醚 (24DNAN)，可专一选择性生成2-NH0H产物。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1. HPLC分析比较野生型及突变体NfsB-T41L/N71S/F124W蛋白对2, 4-二硝基 甲苯（24DNT)还原的区域选择性。由图中所示内容可知，突变体NfsB-T41L/N71S/F124W对 底物24DNT还原的区位选择性与野生型NfsB不同，该突变体在24DNT还原中由4位硝基 选择性转为2位硝基基团，生成2-羟氨-4-硝基甲苯（2HANT)。因此，突变体NfsB-T41L/ N71S/F124W可作为生物催化剂用于羟氨化合物的生物合成。
[0015] 图2. HPLC分析比较野生型及突变体NfsB-T41L/N71S/F124W蛋白对2, 4-二硝基 苯甲醚（24DNAN)还原的区域选择性。由图中所示内容可知，突变体NfsB-T41L/N71S/F124W 对底物24DNAN还原的区位选择性与野生型NfsB不同，该突变体可专一性还原底物中的2 位硝基基团，生成2-羟氨-4-硝基苯甲醚（2HANAN)。因此，突变体NfsB-T41L/N71S/F124W 可作为生物催化剂用于羟氨化合物的生物合成。
【具体实施方式】
[0016] 下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。
[0017] 本发明中设计使用的重叠延伸PCR引物序列：
[0018] nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3, ；SEQ ID NO:3
[0019] nfsB-WT-R ：5, ~GGAATTCTTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT~3, ；SEQ ID NO:4
[0020] nfsB-T41L-F :5, -AGCCCATCCAGCCTGAACTCCCAGCCGTGGCAT-3, ；SEQ ID N0:5
[0021] nfsB-T41L-R :5' -CTGGGAGTTCAGGCTGGATGGGCTGTATTGCA-3' SEQ ID N0:6
[0022] nfsB-N71S-F ：5, -ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG-3, ；SEQ ID NO:7
[0023] nfsB-N71S-R :5' -ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG-3' SEQ ID N0:8
[0024] nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAGTTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3' ；SEQ ID N0:9
[0025] nfsB-F124W-R :5' -TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' SEQ ID N0:10
[0026] 实施例1突变型细菌还原酶NfsB-T41L/N71S/F124W基因获取及表达载体构建
[0027] 1.野生型nfsB基因的克隆与克隆载体构建
[0028] 根据NCBI提供的E. coli K12菌株（Invitrogen)中nfsB基因序列，设计引物 (nfsB-WT-F ：5, ~GGAATTCCATATGGATATCATTTCTGTCGCCTTAAAG~3,, nfsB-ffT-R ：5, -GGAATT ￡TTACACTTCGGTTAAGGTGATGTT-3'），其中下划线部分表示酶切位点对应的基因序列。利用 提取的E. coli K12基因组DNA为模版，进行PCR扩增。取10μ1 PCR反应产物跑琼脂糖 凝胶电泳验证，电泳条带约650bp与nfsB基因大小一致。使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切胶回收上述电泳目的条带，然后用EcoR I/Nde I双酶切处理 回收产物，使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 将其纯化，之后使用 DNA Ligation Kit Ver. 3.0中的连接酶，将纯化后得到的目的产物与经EcoR I/Nde I双酶切处 理的pET28a(+)空载体连接后，热激转化至E. coli DH5a感受态细胞中，涂布平板，37°C过 夜培养。挑选阳性菌落过夜37°C培养后提取质粒并送TaKaRa测序确认与nfsB基因 （Gene ID:945778)序列一致，验证基因克隆成功，并将其命名为野生型nfsB基因，并将其对应的 阳性菌落和重组质粒分别命名为克隆菌E. coliDH5 a -nfsB-WT和质粒pET28a-nfsB-WT。
[0029] 2.突变型NfsB-T41L/N71S/F124W的基因获取及表达载体构建
[0030] 过夜培养E. coliDH5 a -nfsB-WT克隆菌，提取pET28a-nfsB_WT重组质粒，以此为 模板构建突变体载体 pET28a-nfsB-T41L/N71S/F124W。
[0031] (1)首先以质粒 pET28a-nfsB-WT 为模板，使用引物 nfsB-WT-F 和 nfsB-F124W-R : 5' -TATCAGCCCAGAACTTGCGACCTTTATCGTTCG-3' 进行一次 PCR 反应，命名为 nfsB-F124W_l。 同样以质粒 pET28a-nfsB-WT 为模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-F124W-F :5' -TCGCAAG TTCTGGGCTGATATGCACCGTAAAGATC-3'进行二次 PCR 反应，命名为 nf sB_F124W_2。其中引物 nfsB-F124W-F和nfsB-F124W-R中下划线标记的为124位氨基酸突变位点对应的基因序列。 使用 TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,对于两次 PCR 产物切胶 回收纯化。以回收产物nfsB-F124W-l和nfsB-F124W-2作为模板，使用引物nfsB-WT-F和 nfsB-WT-R进行第三次重叠延伸 PCR，PCR产物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3. 0回收纯化，其命名为nfsB-F124W。
[0032] (2)以步骤⑴获得的nfsB-F124W为模板，使用引物nfsB-WT-F和nfsB-T41L-R : 5' -CTGGGAGTTCAGGCTGGATGGGCTGTATTGCA-3' 进行一次 PCR 反应，命名为 nfsB_T41L/ F124W-1。同样以 nfsB-F124W 为模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-T41L-F :5' -AGCCCAT CCAGCCTGAACTCCCAGCCGTGGCAT-3，进行二次 PCR 反应，命名为 nfsB-T41L/F124W_2。其中 引物nfsB-T41L-F和nfsB-T41L-R中下划线标记的为41位氨基酸突变位点对应的基因序 列。使用 TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0,对于两次 PCR 产物 切胶回收纯化。以回收产物nfsB-T41L/F124W-l和nfsB-T41L/F124W-2作为模板，使用引 物nfsB-WT-F和nfsB-WT-R进行第三次重叠延伸PCR，PCR产物使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3.0 回收纯化，其命名为 nfsB-T41L/F124W。
[0033] (3)以步骤（2)获得的nfsB-T41L/F124W为模板，使用引物nfsB-WT-F和 nfsB-N71S-R ：5, ~ATTTTACGTTCGCTGAACACATAATTACCGGCAG~3,进行一次 PCR 反应，命名 为 nfsB-T41L/N71S/F124W-l。同样以 nfsB-T41L/F124W 为模板，使用引物 nfsB-WT-R 和 nfsB-N71S-F :5' ~ATGTGTTCAGCGAACGTAAAATGCTTGATG~3,进行二次 PCR 反应，命名为 nfsB-T41L/N71S/F124W-2。其中引物 nfsB-N71S-F 和 nfsB-N71S-R 中下划线标记的为 71 位氨基酸突变位点对应的基因序列。使用TaKaRaMiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0,对于两次PCR产物切胶回收纯化。以回收产物nfsB-T41L/N71S/F124W-l和 nfsB-T41L/N71S/F124W-2作为模板，使用引物nfsB-WT-F和nfsB-WT-R进行第三次重叠延 伸 PCR，PCR 产物使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver. 3. 0 回收纯化，获得突 变体基因，其命名为nfsB-T41L/N71S/F124W基因，其序列信息为SEQ ID N0:1。
[0034] (4)将获得的突变体基因 SEQ ID N0:1和pET28a(+)空载使用Nde I /EcoR I分 别进行双酶切，使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver. 3.0切胶回收上述电 泳目的条带，之后使用DNA Ligation Kit Ver. 3. 0中的连接酶，将纯化后得到的目的产物 与经EcoR I/Nde I双酶切处理的pET28a(+)载体连接后，热激转化至E. coli DH5a感受 态细胞中，涂布平板，37°C过夜培养。挑选阳性菌落过夜37°C培养后提取质粒并送TaKaRa 测序确认与SEQ ID NO: 1序列一致，验证表达载体构建成功，并将其对应的阳性菌落和重组 质粒命名为克隆菌 E. coliDH5 a -nfsB-T41L/N71S/F124W 和质粒 pET28a-nfsB-T41L/N71S/ F124W。
[0035] 实施例2.细菌硝基还原酶突变体NfsB-T41L/N71S/F124W的表达纯化
[0036] 1.硝基还原酶突变体NfsB-T41L/N71S/F124W的诱导表达
[0037] 将重组质粒pET28a-nfsB-T41L/N71S/F124W热激转化到大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞（Invitrogen)中，涂布平板，37°C过夜培养。挑取阳性克隆，并将其 命名为表达菌E. coliBL21 (DE3) -nfsB-T41L/N71S/F124W，再接种于LB液体培养基中（含 50yg/ml Kana)，37°C振荡过夜。将种子培养液以1%接种量转接至100ml LB扩大培养基 中（含5(^8/!1111(&11&)，371：摇床培养至00 6(|(|在0.4-0.6。加入终浓度为0.511111?了6于 30°C下诱导表达6h。培养结束后，发酵液于5000r/min离心lOmin收集菌体。
[0038] 2.硝基还原酶突变体NfsB_T41L/N71S/F124W的纯化
[0039] 收集菌体用20mM磷酸盐缓冲液（pH7. 4,含有500mMNaCl)进行重悬，利用高压匀浆 破碎仪在低温下进行破碎，12000r/min离心5min收集上清。
[0040] 样品分离纯化均使用AKTA purifier蛋白质快速层析系统（GE Healthcare)完 成，采用GE Healthcare FF HisTrap层析柱（即Ni柱）。首先用缓冲液A(20mM NaH2P04， 0. 5MNaCl，pH7.4)平衡Ni柱，将破碎后收集的蛋白上清样品以lml/min的流速通过Ni 柱，使目的蛋白结合于Ni柱。待紫外基线平稳后，使用缓冲液B(elution buffer:20mM NaH2P04,0. 5MNaCl，250mM 咪唑，ρΗ7· 4)洗脱，洗脱梯度依次为 20mM，100mM，250mM 咪唑，每 个洗脱梯度洗脱体积为20个柱体积。分管收集每个梯度洗脱的流出液，对每管样品分别进 行蛋白含量、活力以及SDS-PAGE分析。
[0041] 3.硝基还原酶突变体NfsB-T41L/N71S/F124W的SDS-PAGE电泳分析及 Western-Blotting 验证
[0042] 利用SDS-PAGE电泳分析突变型硝基还原酶NfsB-T41L/N71S/F124W的分子量及其 纯度，对照Marker选用低分子量标准蛋白。待电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色3小 时以上，用脱色液（以乙醇：醋酸：水的体积比为1 :2 :17配制而成）震荡脱色，观察电泳结 果。
[0043] 电泳结果发现在分子量27kDa左右有一条明显的诱导条带。同时诱导条带对应 蛋白在250mM咪唑洗脱组分得到富集，初步判断该蛋白为突变体蛋白Nf sB-T41L/N71S/ F124W，其序列信息为SEQ ID N0:2。
[0044] 针对转膜仪，采用半干法转膜，转膜缓冲液为48禮1^8,391111甘氨酸，20 (%甲醇， 0. 037% SDS，具体步骤如下：
[0045] 将SDS聚丙烯酰胺凝胶取下，置于转膜缓冲液中平衡，剪裁一块大小相同的PVDF 膜，将其放置于100%甲醇中激活10s，然后将膜用去离子水清洗掉膜上残余的甲醇，置于 转膜缓冲液中；按滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸，自下而上顺序组装，准备转膜；将转膜仪组装 完毕，设置恒压18V，转膜2个小时；
[0046] 封闭：将转完的PVDF膜浸泡在含有5 %的脱脂奶粉的TBST缓冲液中 (20mMTris-HCl，150mMNaCl，0. 05% 的 Tween20)中封闭 lh ;
[0047] 一抗包被：将封闭好的PVDF膜浸泡于含一抗TBST包被液中（含anti-His antibody, 1:3000, Invitrogen，3%脱脂奶粉）1小时；用TBST缓冲液每隔lOmin洗漆一次， 洗6次，去除非特异性结合抗体；
[0048] 二抗包被：将上步中的PVDF膜浸泡在含有山羊抗鼠 IgG/辣根酶标记抗体和3% 的脱脂奶粉的的TBST缓冲液中，振荡1小时；用TBST缓冲液每隔lOmin洗涤一次，洗6次，， 去除非特异性结合的二抗；
[0049] 用TBST缓冲液每隔lOmin洗涤一次，洗6次，加入发色底物反应3-5min，曝光，显 影，定影。
[0050] Western-Blotting结果显示IPTG诱导组分中分子量27kDa处蛋白条带为目的蛋 白条带，且该蛋白经Ni柱分离纯化后于250mM咪唑下中得到富集分离，纯度达90%以上。
[0051] 实施例3.细菌硝基还原酶突变体NfsB-T41L/N71S/F124W的活性测定
[0052] 将250mM咪唑洗脱下来的重组蛋白，按照摩尔浓度比蛋白：FMN = 1 :10的比例混 匀，放置4°C冰箱中孵育2个小时。孵育结束后，将重组蛋白脱盐至20mMTris-HCl缓冲液 (PH7.0)中，以进行后续蛋白活性检测等实验。
[0053] 1. HPLC分析突变体NfsB-T41L/N71S/F124W还原24DNT的区域选择性用高效液相 色谱（HPLC)安捷伦1200分析突变体对24DNT的还原产物。以24DNT为底物，检测突变体 的还原效率和还原产物比例。HPLC酶催化反应体系中含有：0. lmM24DNT，0. 2mM NADH，200nM 突变体酶，反应缓冲液为20mMTris-HCl pH7. 0,室温反应5-15分钟。由于24DNT及其反应产 物加热不稳定，所以用等体积乙酸乙酯萃取以终止反应，12000Xg离心lOmin。取上层乙酸 乙酯相用于HPLC分析。HPLC分析柱选用C18反相疏水层析柱，粒径5 μ m，4. 6mmX 250mm，流 动相组成为甲醇和水体系，流速为〇.8ml/min，进样体积为10μ 1，用紫外检测器检测。HPLC 分析体系为20%甲醇平衡，进样后经50%甲醇等梯度洗脱15min，50 % -90%的甲醇lOmin 线性洗脱，检测波长为254nm，柱温20°C。两种羟氨产物保留时间分别为= 13. 8min， R2-NH0H - 14. lrnin〇
[0054] 实验结果如图1所示，突变体NfsB-T41L/N71S/F124W对重要工业原材料2, 4-二 硝基甲苯（24DNT)的还原由4-NH0H产物转为2-NH0H产物。
[0055] 2. HPLC分析突变体NfsB-T41L/N71S/F124W还原24DNAN的区域选择性用高效液相 色谱（HPLC)安捷伦1200分析突变体对24DNAN的还原产物。以24DNAN为底物，检测突变 体的还原效率和还原产物比例。HPLC酶催化反应体系中含有：0. lmM24DNAN，0. 2mM NADH， 200nM突变体酶，反应缓冲液为20mMTris-HCl pH7. 0,室温反应15-30分钟，用等体积乙酸 乙酯萃取以终止反应，12000Xg离心lOmin。取上层乙酸乙酯相用于HPLC分析。HPLC分析 柱选用C18反相疏水层析柱，粒径5 μ m，4. 6mmX 250mm，流动相组成为乙腈和水体系，流速 为0. 8ml/min，进样体积为10 μ 1，用紫外检测器检测。HPLC分析体系为20 %乙腈平衡，进 样后40% -80%的乙腈20min线性洗脱，检测波长为263nm，柱温20°C。两种羟氨产物保留 时间分别为：R4- NHQH = 7. lmin，R2_NHra = 8. 6min。
[0056] 实验结果如图2所示，突变体NfsB_T41L/N71S/F124W可实现对重要工业原材料 2,4-二硝基苯甲醚（240隱的的专一性还原，还原产物由4-順0!1产物转为2-順0!1产物。
[0057] 3.硝基还原酶突变体的动力学测定
[0058] 所有的动力学常数都是用全波长扫描突光酶标仪（Varioskan?，Thermo Fisher Scientific)用连续测点的方法于37°C恒温检测。硝基还原酶动力学检测体系：总体积 200 μ 1，20mMTris-HCl (pH7. 0)的缓冲液中含有60 μ M NADH，一系列不同浓度的待测底物和 适量的酶。随反应进行，通过检测340nm下NADH的消耗量，进而计算底物消耗反应速率。每 还原lmol硝基基团，需要消耗2mol的NADH分子。所有的动力学实验至少重复3次，数据 用非线性拟合软件Origins. 5处理得出数据以及误差范围。
[0059] 表1.野生型及突变体NfsB-T41L/N71S/F124W对底物2, 4-二硝基甲苯（24DNT) 和2, 4-二硝基苯甲醚（24DNAN)的动力学常数。
[0060]
【权利要求】
1. 一种区位选择性细菌硝基还原突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 如权利要求1所述的区位选择性细菌硝基还原突变体基因所编码的蛋白质，具有 SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3. -种包含如权利要求1所述基因的重组表达载体。
4. 一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。
5. -种区位选择性细菌硝基还原酶的制备方法，其特征在于：培养如权利要求4所述 的重组表达转化体，从培养物中纯化得到突变型细菌硝基还原酶的蛋白。
6. 如权利要求2所述的蛋白质或如权利要求4所述的重组表达转化体作为催化剂在催 化硝基还原，在药物激活剂代谢、芳香羟胺化合物的生物合成以及硝基类环境污染物生物 代谢领域的应用。
【文档编号】C12N9/02GK104099353SQ201410337184
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】杨君, 白敬, 刘培瑜, 姜熙, 杨青 申请人:大连理工大学