一种核酸显色剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种核酸显色剂，至少含有花青类染料、花青类染料稳定剂和固定化剂；其中，花青类染料稳定剂包括四戊基铵类化合物，固定化剂包括高分子聚合物、糖类或两者的混合物；花青类染料的含量为被预定量的核酸显色剂稀释为100～250X时的量，花青类染料稳定剂在显色剂中的浓度为10～100mM，固定化剂的含量为保持预定量的核酸显色剂经真空干燥后为半固态时的量。该核酸显色剂高温耐受性良好，可以在室温下长期保存，经真空干燥后可以牢牢地粘附在PCR管盖中央，在核酸扩增反应过程中不会因受热融化而滴落到PCR管中，反应结束后，只需要上下颠倒，使反应产物与核酸显色剂混合就可肉眼直接判读反应结果，无需开盖操作，避免了DNA气溶胶污染。
【专利说明】-种核酸显色剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸显色剂领域，尤其涉及一种在室温下可长期保存且可肉眼直接判 读核酸扩增反应产物的阴性或阳性的核酸显色剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 花青类染料，如SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR GolcUGelStar等可用于DNA、 RNA的分析和检测。这类花青类染料单独存在时只能发出微弱的荧光，一旦结合到单链或双 链核酸上以后，能够激发出千倍以上的荧光增量。例如，高浓度的SYBR Green I溶液呈现 出橙黄色或是橘红色，与核酸产物结合后会变为绿色。花青类染料的这种特性可以用来直 接判断核酸扩增反应的结果。但是，花青类染料在液态、常温下是不稳定的，通常需要溶解 在有机溶剂中低温储存，不仅耗费电力能源，运输、使用过程也很不方便。尤其在野外核酸 扩增反应试验中，由于难以实现低温环境，通常无法应用花青类染料。
[0003] 而且，花青类染料，例如，SYBR Green I会抑制DNA聚合酶的反应活性，如果在核 酸扩增反应前即将花青类染料直接加入PCR管中，则会影响扩增反应进行，且扩增反应中 的高温程序使该类花青类染料很容易失去显色稳定性。如果在扩增反应完成后，再开盖加 入该类花青类染料，极易造成DNA污染。因此，实现不开盖直接判读核酸扩增反应产物的结 果，避免产生DNA气溶胶污染是本领域技术人员需要解决的难题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于解决现有的花青类染料难以常温保存的问题，以及解决不开盖 直接判读核酸扩增反应产物的结果的问题。
[0005] 因此，本发明提供了一种核酸显色剂，其特征在于：至少含有花青类染料、花青类 染料稳定剂和固定化剂；其中，所述花青类染料稳定剂包括四戊基铵类化合物，所述固定化 剂包括高分子聚合物、糖类或两者的混合物；所述花青类染料的含量为被预定量的所述核 酸显色剂稀释为1〇〇?250X时的量，所述花青类染料稳定剂在所述核酸显色剂中的浓度为 10?lOOmM，所述糖类的浓度16%?55% (w/v)，所述聚合物的浓度为0. 05%?3% (w/v)。
[0006] 在上述技术方案中，花青类染料稳定剂四戊基铵类化合物混合能够增加花青类染 料在高温下的耐受性，使得所述核酸显色剂在室温下能够长期保存。以SYBR Green I为例， 在没有添加四戊基铵类化合物的情况下，在常温状态下，最多可保存1?2个星期，就会出 现检测灵敏度下降。在添加了四戊基铵类化合物的状态下，SYBR Green I能够在常温甚至 高于常温的条件下长期储存，其稳定储存期达到6个月以上。
[0007] 在上述技术方案中，固定化剂，例如，糖类和高分子聚合物能够增加核酸显色剂的 粘度。当将该核酸显色剂进行真空干燥处理，蒸发掉多余的水分后，可将该核酸显色剂由液 态变为粘稠的半固态，使得该核酸显色剂能够粘附在PCR反应管盖中央，因此，在进行核酸 扩增反应过程中，该核酸显色剂不会因受热融化而滴落到正在进行扩增反应的PCR管中， 从而抑制DNA聚合酶的活性，影响扩增反应进行。在空间上，PCR反应管上方为核酸显色剂， 下方为反应体系，反应结束后，只需要上下颠倒，使反应产物与核酸显色剂混合就可肉眼直 接判读反应结果。无需开盖操作，因此避免了 DNA气溶胶污染，使反应结果更准确可靠。由 于具有固定化剂，一般运输、储存、操作过程中的碰撞、震动均不会导致该核酸显色剂从PCR 管盖中溅出、滴落等。而且，在花青类染料稳定剂和固定化剂存在的条件下，真空干燥处理 后的核酸显色剂具有更加稳定的显色特征，在反应过程中不会因为经受高温而丢失显色特 征。
[0008] 在上述技术方案中，花青类染料的含量为被预定量的总核酸显色剂稀释为100? 250X(100?250倍浓缩）时的量。在花青类染料成品制备过程中，花青类染料都是以1000 (1000倍浓缩）、5000 (5000倍浓缩）、10000 (10000倍浓缩）等形式制备、储存和出售 的，在实际使用时，需要用其他溶液稀释成40?100X的形式，即用肉眼可直接判断显色结 果的稀释度。在本核酸显色剂中，对于不同浓缩度的花青类染料的加入量是不一样的，只需 要保证花青类染料在总核酸显色剂中被稀释为100?250X即可，在核酸扩增反应后，花青 类染料会被核酸扩增反应体系中的溶液进一步稀释成约40?100X。花青类染料稳定剂在 显色剂中的浓度为10?l〇〇mM，实验证明，如果四戊基铵类化合物的浓度低于10mM，四戊基 铵类对花青类染料的保护作用不明显。固定化剂的含量为保持预定量的核酸显色剂经真空 干燥后为半固态时的量，如上所述，固定化剂的作用在于增加核酸显色剂的粘度，使其干燥 后能够粘附在PCR管盖中央，不同的固化剂因其分子量和性能的不同，在核酸显色剂中的 加入量是不同的，在本发明中，只要固化剂的加入量满足真空干燥后的核酸显色剂维持半 固态即可。
[0009] 当然，本发明的核酸显色剂并不限于上述组分，还可能包括本领域公知的其他缓 冲液或缓冲金属离子等。
[0010] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化剂为高分子聚合物和糖类的混合 物，其中糖类的浓度16%?55% (w/v)(质量体积百分比，即每100ml溶液中所含溶质的克 数），所述聚合物的浓度为0.05%?3% (w/v)。固化剂采用该比例范围内的高分子聚合物 和糖类的混合物，核酸显色剂的粘度最佳，干燥成半固态后极易粘附在PCR管盖中央，不会 受到运输或操作过程中外力的影响而滴落下来。
[0011] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述四戊基铵类化合物为四戊基氯化 铵、四戊基溴化铵、四戊基氢氧化铵中的一种或几种的混合物。四戊基铵类化合物 (Tetrapentylammonium)是一种有机化合物，常用于离子对色谱分析，其稳定核酸与核酸染 料的结合的具体机理尚不明了。
[0012] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述花青类染料为SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR GolcUGelStar中的一种或几种的混合物。
[0013] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述花青类染料被溶解在DMS0(二甲基亚 砜）中，DMS0作为花青类染料的溶解溶剂，有助于提高花青类染料的稳定性。DMS0的含量 与花青类染料的浓缩度有关。
[0014] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述固定化试剂中的糖类为海藻糖、蔗糖、聚 蔗糖、葡聚糖中的一种或几种的混合物。这些糖类在合适浓度下，真空蒸发水分后，粘稠不 流动，能够增强核酸染料在PCR管盖中的粘度。其他的糖类，例如二糖，三糖等也可以采用。
[0015] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述高分子聚合物为聚乙二醇、聚乙烯吡咯 烷酮、羧甲基纤维素和聚丙烯酰胺中的一种或几种的混合物。更优选的是，所述高分子聚合 物为聚乙二醇。这些高分子聚合物易溶于水，形成胶状物质，有助于本发明的核酸显色剂直 接牢固地粘附于PCR管盖中，且不与核酸染料发生化学作用。
[0016] 作为对上述技术方案的进一步改进，所述核酸显色剂经过真空干燥处理，为半固 态。本发明的核酸显色剂可能以半固态的形式生产、包装和出售，操作者在使用时直接将其 加在PCR管盖中央。但本发明的核酸显色也可能以液态的形式生产、包装和出售，操作者在 使用时再将其干燥成半固态。
[0017] 本发明还提供了一种PCR管，所述PCR管的管盖中粘附有本发明所述的核酸显色 齐U。操作者在使用本发明的PCR管时，直接将反应体系加入到PCR管中，反应完后，上下颠 倒直接观察反应结果即可，操作非常方便，节省时间，而且无需真空干燥设备，尤其适用于 野外试验。在该技术方案中，对具体PCR管的体积、材质等无任何限制，只要是可进行核酸 扩增反应的PCR管皆可。
[0018] 本发明还提供了一种上述PCR管的制备方法，其特征在于：将5?10 μ L本发明所 述的核酸显色剂滴加在PCR的管盖中央，然后对滴加有所述核酸显色剂的PCR管盖进行真 空干燥处理，蒸发所述核酸显色剂中的水分，使其成为半固态，即可制得所述PCR管。该制 备方法简单易操作，使用者在需要时，可以直接现场制备该PCR管。
[0019] 本发明还提供了上述核酸显色剂的应用，其特征在于：所述核酸显色剂可用于肉 眼判读在其中进行的核酸扩增反应产物的阴性或阳性，其应用机理如上所述。核酸扩增反 应可以是DNA的扩增，也可以是RNA的扩增，且对具体的扩增体系和扩增方式无任何限制。
[0020] 作为对上述应用的优选，所述核酸扩增反应为环介导等温扩增反应（LAMP)。LAMP 是一种简便、快速、精确、低价的基因扩增方法，广泛用于各种病原体的快速检测，尤其适于 在野外操作。将LAMP和本发明的核酸显色剂或PCR管结合起来，更有助于极其快速、准确 地检测各类基因或病原体，尤其适于野外作业。
[0021] 相对于现有技术，本发明的核酸显色剂加入了染料稳定剂四戊基铵类化合物，使 得花青类染料在高温下的耐受性增强，可以在室温下长期保存，不需要低温储存环境，节省 了生产、运输和使用过程中成本，操作也更加方便快捷。而且，本发明的核酸显色剂还加入 了增加核酸显色剂粘度的固定化剂，固定化剂使得该核酸显色剂在真空干燥后可以牢牢地 粘附在PCR管盖中央，使得核酸显色剂在核酸扩增反应过程中不会因受热融化而滴落到正 在进行扩增反应的PCR管中，反应结束后，只需要上下颠倒，使反应产物与核酸显色剂混合 就可肉眼直接判读反应结果，无需开盖操作，因此避免了 DNA气溶胶污染，使反应结果更准 确可靠。由于具有固定化剂，一般运输、储存、操作过程中的碰撞、震动均不会导致该核酸显 色剂从PCR管盖中溅出、滴落等。而且，在花青类染料稳定剂和固定化剂存在的条件下，真 空干燥处理后的核酸显色剂具有更加稳定的显色特征，在反应过程中不会因为经受高温而 丢失显色特征。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明一个实施例中含有本发明核酸显色剂的PCR管盖。
[0023] 图2为本发明一个实施例中应用本发明的核酸显色剂和PCR管对结核分歧杆菌进 行LAMP检测的检测结果。
【具体实施方式】
[0024] 以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进 行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，凡依据本
【发明内容】
所作的等同 变换，均同理包含在本发明的范围内。
[0025] 实施例1
[0026] 制备核酸显色剂
[0027] 溶解在DMS0中的SYBR Green I染料（5000X) 20ul ;海藻糖溶液0· 16g ;四戊基溴 化铵水溶液（l〇〇mM)l〇〇ul ;PEG8000(聚乙二醇8000)水溶液（10% (w/v))30ul，将上述物 质混合均匀，补加去离子水至lOOOul，制得lOOOul本发明的核酸显色剂（100X)。
[0028] 制备含有核酸显色剂的PCR管
[0029] 将上述制备的核酸显色剂滴加到PCR反应管的管盖内侧的中央位置处，在该实施 例中，管盖与PCR管身是可以分离的，每个管盖滴加为10ul。然后将滴加有核酸显色剂的 PCR管盖放入真空干燥器中，使真空干燥器保持0. 05?0. IMPa真空度，干燥时间为1?2 小时，蒸发多余水分，核酸显色剂形成半固体状态的物质，粘稠度增加，牢固地粘附在PCR 管盖中，遮光密封室温保存。含有本实施例半固态核酸显色剂的PCR管盖如图1所示。
[0030] 实施例2
[0031] 制备核酸显色剂
[0032] 溶解在DMS0中的SYBR Gold染料（5000X)50ul ;葡聚糖0. 55g ;四戊基氯化铵水溶 液（1000mM)100ul ;聚乙烯吡咯烷酮水溶液（10% (w/v))5ul，将上述物质混合均勻，补加去 离子水至lOOOul，制得lOOOul本发明的核酸显色剂（250X)。
[0033] 制备含有核酸显色剂的PCR管
[0034] 将上述制备的核酸显色剂滴加到PCR反应管的管盖内侧的中央位置处，在该实施 例中，管盖与PCR管身是可以分离的，每个管盖滴加为5ul。然后将滴加有核酸显色剂的PCR 管盖放入真空干燥器中，使真空干燥器保持0. 05?0. IMPa真空度，干燥时间为1?2小 时，蒸发多余水分，核酸显色剂形成半固体状态的物质，粘稠度增加，牢固地粘附在PCR管 盖中，遮光密封室温保存。
[0035] 实施例3
[0036] 制备核酸显色剂
[0037] 溶解在DMS0中的SYBR Green II染料（5000X) 35ul ;蔗糖0· 4g ;四戊基氢氧化铵 水溶液（500mM) 100ul，将上述物质混合均匀，补加去离子水至lOOOul，制得lOOOul本发明 的核酸显色剂（175X)。
[0038] 制备含有核酸显色剂的PCR管
[0039] 将上述制备的核酸显色剂滴加到PCR反应管的管盖内侧的中央位置处，在该实施 例中，管盖与PCR管身是可以分离的，每个管盖滴加为5ul。然后将滴加有核酸显色剂的PCR 管盖放入真空干燥器中，使真空干燥器保持0. 05?0. IMPa真空度，干燥时间为1?2小 时，蒸发多余水分，核酸显色剂形成半固体状态的物质，粘稠度增加，牢固地粘附在PCR管 盖中，遮光密封室温保存。
[0040] 实施例4
[0041] 制备核酸显色剂
[0042] 溶解在DMS0中的SYBR Green II染料（5000X) 40ul ;四戊基氯化铵水溶液 (100mM)100ul ;PEG8000(聚乙二醇8000)水溶液（10% )30ul，将上述物质混合均匀，补力口 去离子水至lOOOul，制得lOOOul本发明的核酸显色剂（200X)。
[0043] 制备含有核酸显色剂的PCR管
[0044] 将上述制备的核酸显色剂滴加到PCR反应管的管盖内侧的中央位置处，在该实施 例中，管盖与PCR管身是可以分离的，每个管盖滴加为10ul。然后将滴加有核酸显色剂的 PCR管盖放入真空干燥器中，使真空干燥器保持0. 05?0. IMPa真空度，干燥时间为1?2 小时，蒸发多余水分，核酸显色剂形成半固体状态的物质，粘稠度增加，牢固地粘附在PCR 管盖中，遮光密封室温保存。
[0045] 实施例5
[0046] LAMP检测结核分歧杆菌
[0047] 本实施例采用实施例1中所制备的含有核酸显色剂的PCR管盖，用LAMP技术对结 核分歧杆菌进行检测，同时设置阳性对照组和阴性对照组。LAMP所采用的反应体系为冻干 型结核分歧杆菌LAMP检测试剂（由广州华峰生物科技有限公司制备的结核分枝杆菌LAMP 检测试剂）。
[0048] 在各个含有上述PCR管盖的PCR反应管中加入22. 5ul去离子水，然后分别加入阴 性对照品、阳性对照品和待检样品各2. 5ul，使各个管中的样品充分溶解。按照图2所示的 从左到右的顺序，样品依次标号为1?8,其中，1?5为结核杆菌10?100000拷贝样品，6 为阳性对照，7为空白对照，8为阴性对照。将反应管放置于65°C恒温条件下，反应lh。其 中，阳性对照为含有目标检测片段的质粒，阴性对照为不含目标片段的质粒。
[0049] 反应结束后将反应管倒置放置5秒钟，使反应管管盖染料溶解，溶解后的花青染 料的稀释度约为40?100X，然后将PCR管正置甩动1次，使含有核酸显色剂的混合物置于 反应管底。
[0050] 直接肉眼观察反应结果，结果显示，LAMP反应过程中，LAMP工作液与核酸显色剂 密封良好。后期反应显色清晰可辨，显色结果如图2所示。
[0051] 由此可见，本发明的核酸显色剂操作方便快捷，在核酸扩增反应过程中不会因受 热融化而滴落到正在进行扩增反应的PCR管中，反应结束后，只需要上下颠倒，使反应产物 与核酸显色剂混合就可肉眼直接判读反应结果，无需开盖操作，避免了 DNA气溶胶污染，使 反应结果更准确可靠。
[0052] 实施例6
[0053] 稳定性检测
[0054] 将实施例1所制备的含有核酸显色剂的PCR管置于42°C恒温箱中，放置6个月。 然后按照实施例5的步骤进行LAMP检测结核分歧杆菌，其检测结果与实施例5 -致，表明 本发明的核酸显色剂稳定性良好，可以在室温或高于室温下长期保存。
【权利要求】
1. 一种核酸显色剂，其特征在于：至少含有花青类染料、花青类染料稳定剂和固定化 齐IJ;其中，所述花青类染料稳定剂包括四戊基铵类化合物，所述固定化剂包括高分子聚合 物、糖类或两者的混合物； 所述花青类染料的含量为被预定量的所述核酸显色剂稀释为100?250X时的量，所述 花青类染料稳定剂在所述核酸显色剂中的浓度为10?l〇〇mM，所述固定化剂的含量为保持 预定量的核酸显色剂经真空干燥后为半固态时的量。
2. 如权利要求1所述的核酸显色剂，其特征在于：所述固定化剂为糖类和高分子 聚合物的混合物，其中所述糖类的浓度16%?55% (w/v)，所述高分子聚合物的浓度为 0.05(%?3(%(w/v)。
3. 如权利要求1所述的核酸显色剂，其特征在于：所述四戊基铵类化合物为四戊基氯 化铵、四戊基溴化铵、四戊基氢氧化铵中的一种或几种的混合物。
4. 如权利要求1所述的核酸显色剂，其特征在于：所述花青类染料为SYBR Green I、 SYBR Green II、SYBR Gold、GelStar中的一种或几种的混合物。
5. 如权利要求4所述的核酸显色剂，其特征在于：所述花青类染料被溶解在DMS0中。
6. 如权利要求1所述的核酸显色剂，其特征在于：所述固定化试剂中的糖类为海藻糖、 蔗糖、聚蔗糖、葡聚糖中的一种或几种的混合物。
7. 如权利要求1所述的核酸显色剂，其特征在于：所述高分子聚合物为聚乙二醇、聚乙 烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素和聚丙烯酰胺中的一种或几种的混合物。
8. 如权利要求1?7任一所述的核酸显色剂，其特征在于：所述核酸显色剂经过真空 干燥处理，为半固态。
9. 一种PCR管，其特征在于：所述PCR管的管盖中粘附有如权利要求8所述的核酸显 色剂。
10. 如权利要求9所述的PCR管的制备方法，其特征在于：将5?10 μ L如权利要求1? 7任一所述的核酸显色剂滴加在PCR的管盖中央，然后对滴加有所述核酸显色剂的PCR管 盖进行真空干燥处理，蒸发所述核酸显色剂中的水分，使其成为半固态，即可制得所述PCR 管。
11. 如权利要求1?7任一所述的核酸显色剂的应用，其特征在于：所述核酸显色剂可 用于肉眼判读在其中进行的核酸扩增反应产物的阴性或阳性。
12. 如权利要求11所述的核酸显色剂的应用，其特征在于：所述核酸扩增反应为环介 导等温扩增反应。
【文档编号】C12Q1/68GK104099419SQ201410341974
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】黄昱阳, 熊槐, 杜正平, 曹以诚 申请人:广州华峰生物科技有限公司