猪脂肪沉积性状snp遗传标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜遗传标记制备【技术领域】，具体涉及一种猪脂肪沉积性状的SNP遗传标记及应用，从猪OLR1基因中克隆获得一种作为遗传标记应用的猪脂肪沉积性状的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1和图4所示，在图4所示序列的181bp处有一个A/G的碱基突变，该突变导致Pag?Ⅰ-RFLP多态性。本发明还公开了制备猪脂肪沉积性状遗传标记的方法以及制备的遗传标记在猪脂肪沉积性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。
【专利说明】猪脂肪沉积性状SNP遗传标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪的分子标记制备【技术领域】，具体涉及一种猪脂肪沉积性状SNP遗传 标记及应用，该遗传标记从猪基因0LR1中克隆获得。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术的发展，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择 和分子标记渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种技术相结合大大加速了猪育种的进 程。分子标记辅助选择可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基 因型的直接选择，进行分子育种，是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，通过分子 标记的方法，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗；另外，分子标记的多样 性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高（鲁绍熊，吴常信.，2000)。用于 辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称 SNP)标记等。
[0003] SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、 单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。其数量多，多态性丰富。 其检测方法包括PCR-SSCP、PCR-RFLP、测序及SNP芯片等。限制性内切酶片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是根据不同品种（个体）基因组 的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致 酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过琼脂糖电泳进行检测，从而可比较不同品种 (个体）的DNA水平的差异（即多态性）（BeuzenN. D.，et al. 2000)。
[0004] 氧化型低密度脂蛋白受体 1 (oxidized low-density lipoprotein receptorl，0LRl)是一类可以结合氧化低密度脂蛋白（oxLDL)的受体。Sawamura等（1997) 首次在牛内皮细胞上发现了 0LR1基因，并成功克隆了人内皮细胞0LR1基因，随后相继克 隆了大鼠、小鼠及兔子等0LR1基因的cDNA序列（Miki et al.，1998 ;Kume et al.，1998)。 这几个物种中0LR1基因的编码氨基酸序列比较相似。猪0LR1基因有5个内含子和6个外 显子，编码274个氨基酸，与人0LR1基因有79%的相似性，与牛的相似性最高，达到84% (Yamanaka et al.，1998 ;Ming et al.，2001)。0LR1基因被广泛认为与心血管疾病的形成 密切相关，此外在脂肪代谢过程中发挥着重要的作用。Patricia等（2005)首次在脂肪细 胞中研究0LR1的作用，证明0LR1在PPARY和其相关抗糖尿病配体的参与下，在调控脂 代谢，从而潜在地调节胰岛素抵抗方面发挥着重要作用。Juwon A等（2007)研究证明胞外 信号调节激酶（ERK)和c-Jun氨基末端激酶（JNK)通路是0LR1在脂肪细胞中发挥作用的 重要作用通路。孙超等（2009)研究表明0LR1基因在小鼠前体脂肪细胞分化过程中通过 P38MAPK通路发挥作用，对抑制脂肪细胞增殖有一定的作用。李托（2013)在秦川牛群体中 分析0LR1基因遗传多态性与肉质性状的相关性，发现在g. 10497位点存在C>A突变，CC纯 合基因型与秦川牛眼肌面积和眼肌深度有显著相关性。目前，0LR1基因的研究主要集中在 人、小鼠、大鼠和牛等物种，对猪0LR1基因的研究报道较少， 申请人:对该基因在猪中进行了 多态性研究和关联分析，为猪的遗传改良提供了重要的理论依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于获得与脂肪沉积性状相关的SNP分子标记及应用。从猪0LR1 基因克隆得到一个特异的DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与 猪脂肪沉积性状的关系，为猪的标记辅助选择提供一种新的分子标记。
[0006] 本发明通过下列技术方案实现：
[0007] 申请人:通过对猪0LR1基因的分离克隆，发现了一种与猪脂肪沉积性状相关的SNP 分子标记，其核苷酸序列如下所示：
[0008] TCCTCGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTG ATTACATGCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAG MGATGGCAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCr(A/G)TGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGAT CAATTCAGAAATGTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGG TTATCTCTGAGGAAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTA TTCTTTTCCTAATCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCCGCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGA AATTTCTGAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTT CCTTCTTACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGTAG
[0009] 上述序列中的第181bp处的R是A或G，该突变导致Pag I-RFLP多态性。
[0010] 申请人:设计了扩增上述猪0LR1基因片段的引物对（该引物对也是检测本发明的 分子标记的引物对），其DNA序列如下所示：
[0011] 正向引物：5' TCCTCGGTGGAAGAGCAT3'，与 SEQ ID N0 :4 所示的序列对应。
[0012] 反向引物：5' CTACCTTGGGTCAGGCAC3' ；与 SEQ ID N0 :5 所述的序列对应。
[0013] 本发明建立了一种筛选与猪脂肪沉积性状相关的分子标记的方法，其具体步骤如 下：
[0014] 提取猪基因组DNA，根据NCBI中公布的猪0LR1基因序列信息，设计PCR扩增引物 对（其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示），用该引物对进行PCR扩 增，得到589bp的扩增片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1(其第181bp处的r是A 或G，或参见图4,其中：该序列中的r显示碱基突变位置，S卩181bp处的R是A或G)、SEQ ID NO :2(梅山猪：其第181bp处突变的碱基是A)和SEQ ID NO :3(大白猪：其第181bp处的突 变的碱基是G)所示，该突变导致Pag I-RFLP多态性，进而对所获得的PCR产物酶切分型， 进行基因型与猪脂肪沉积性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供一个 新的分子标记。
[0015] 本发明的分子标记可以应用于猪脂肪沉积性状检测中。
[0016] 相应地，本发明设计的引物对也可应用于脂肪沉积状检测中。
[0017] 更详细的技术方案如《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 序列表SEQ ID N0 :1是本发明制备的遗传标记的核苷酸序列。序列长度为589bp， 其中在该序列的第181bp处显示的"r"为等位基因突变，即存在一个A/G替换。该突变导 致导致Pag I-RFLP多态性。
[0019] 序列表SEQ ID NO :2是克隆的中国地方猪品种"梅山猪"的部分核苷酸序列。序 列长度为589bp，其中在该序列的第181bp处存在一个等位基因突变，即碱基A。
[0020] 序列表SEQ ID N0 :3是克隆的国外猪种"大白猪"的部分核苷酸序列。序列长度 为589bp，其中在该序列的第181bp处存在一个等位基因突变，即碱基G。
[0021] 序列表SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5是本发明设计的引物对的核苷酸序列。
[0022] 图1 :分别是大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪0LR1序列比对结果，图中加粗的英 文字母代表SNP位点。
[0023] 图2 :是猪0LR1基因第4内含子的扩增结果。
[0024] 琼脂糖浓度为1. 5%;图中标记说明：泳道M :DL2000Marker ;泳道1 - 4分别为大 白猪、长白猪、梅山猪和清平猪中的扩增片段，片段大小为589bp。
[0025] 图3 :猪0LR1基因 Pag I-RFLP检测结果。
[0026] 琼脂糖浓度为1. 5% ;图中标记说明：泳道Μ为DL2000Marker ;GG基因型，589bp ; AG 基因型，589bp，179bp，410bp ;AA 基因型，179bp，410bp。
[0027] 图4 :是本发明克隆的猪0LR1基因第4内含子的核苷酸序列，其中第181bp处的r 是A或G突变，该突变导致Pag I-RFLP多态性。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1猪0LR1基因片段的获得及多态性检测方法的建立
[0029] 本发明的试验猪品种为大白猪、长白猪（为国外血缘猪品种）、梅山猪和清平猪 (为中国地方猪血缘品种），样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎与分子 育种湖北省重点实验室提供，为常用品种。
[0030] 猪基因组DNA的提取：
[0031] 采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（按该试剂盒说明书 进行操作）提取，具体步骤如下所述：
[0032] (1)采集20_50mg猪的耳组织，用眼科手术剪剪成糊状后放入2ml的离心管中，力口 入200 μ 1裂解液TL，用枪头吹打均匀。
[0033] (2)加入20 μ 1蛋白酶K(20mg/ml)，剧烈颠倒充分混勻，55°C水浴锅中消化过夜。
[0034] (3)加入200μ 1结合液CB(该试剂盒自带），充分颠倒混匀，70°C放置10min。
[0035] (4)冷却后加入100 μ 1异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。
[0036] (5)用lmL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，lOOOOrpm离心30s，倒掉收 集管中的废液。
[0037] (6)加入500uL抑制物去除液IR(该试剂盒自带），12000rpm离心30s，弃废液。
[0038] (7)加入700 μ 1漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。
[0039] (8)重复操作步骤7。
[0040] (9)将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的 乙醇抑制下游反应。
[0041] (10)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加 50-100 μ 1洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心lmin，将溶液收集到离心管中。
[0042] (11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于_20°C下保存备用。
[0043] 根据 0LR1 基因的基因组序列（GenBank 登陆号：NC_010447. 4, http://www. ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/NC_010447. 4)设计以下引物对：
[0044] 正向引物：5' TCCTCGGTGGAAGAGCAT3'，其序列与 SEQ ID N0 :4 对应；
[0045] 反向引物：5' CTACCTTGGGTCAGGCAC3' ；其序列与 SEQ ID N0 :4 对应。
[0046] 利用上述引物在大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪基因组DNA中进行PCR扩增， PCR反应体系25yL，体系中各组分的浓度为lOOng模板DNA、lXTaq buffer2.5mmol/L、 MgCl2l. 5mmol/L、dNTPs2. 5mmol/L、上述正反向引物各 0· 5mmol/L、lU TaqDNA聚合酶，PCR 的 运行程序如下：预变性94°C 4min ;然后94°C 30s，58°C 40s，72°C 50s，34个循环；最后72°C 继续延伸lOmin。
[0047] 对上述四个猪品种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒（购自上海生工生 物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作）纯化、克隆测序（测序委托上海生工生物工 程技术有限公司进行），得到片段的大小为589bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2(梅 山猪）和SEQ ID NO :3(大白猪）所示。经ClusterW软件进行序列比对，发现其中位于该 片段181bp处（第4内含子246bp处）A/G变异引起了 Pag I酶切位点（T丨CATGA)多态 性改变。
[0048] 取5. 5 μ L PCR产物加入限制性内切酶0. 5 μ L(10U/ μ L)，lOXbufferl μ L，(ΜΗ203 μ L，置37°C恒温反应过夜，后经1. 5%的琼脂糖凝胶凝胶电 泳分析，在凝胶成像系统观察并记录酶切分型结果。当181bp处的碱基都为G时Pag I不 识别该位点，记为GG型（589bp)，当突变位点碱基都为A时Pag I酶识别该位点，记为AA 型（179bp+410bp)，当G和A都存在时记为AG型（589bp+179bp+410bp)。猪0LR1基因的 PCR-Pag I-RFLP的酶切分型结果如图3。
[0049] 实施例2本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测验证
[0050] 在两个中国地方猪品种（梅山猪、清平猪）和两个国外猪品种（大白猪、长白猪） 检测猪0LR1基因第4内含子区PCR-Pag I -RFLP多态性分布频率，检测结果如表1所示。 在大白猪、长白猪中G等位基因频率较1?，在梅山猪、清平猪中，AA基因频率占优势，A等位 基因的频率较高，说明国外血缘的猪品种和中国地方猪品种中存在显著的差异。如表1.
[0051] 表1 0LR1基因第4内含子区Pag I酶切多态在不同品种中的分布结果
[0052]
【权利要求】
1. 一种猪脂肪沉积性状SNP遗传标记，其核苷酸序列如下所示： TCCTCGGTGGAAGAGCATTTGTTCGAGATGCAGAGTAGGTACCTGTTTTTTAGTCTGGCCTGGCCACTGATT ACATGCATGTCCTTGGATGGACAGGGTATGGTGGGTCTCTAGGCTCCAGCAGGCATGTCTATAAAACCATCCAGAAG ATGGCAAAGATCCCTTTGGTTCTGTGGCTTCr (A 或 G) TGAATCTAATCTAAGATGTTCACATCAACTCTTTGATC AATTCAGAAATGTTCCTCCCTACAGGAATTCATCCAGCAAACCATCGCCCATTCCAGTTTCCCATTCTGGATGGGGT TATCTCTGAGGAAACCCAACAACTCATGGCTCTGGGAGGACGGTACTCCTTTGATGCCCCACTTGTAAGTTTCCTAT TCTTTTCCTAATCTGCTGGTGAAGTTACTGCCGCATTCCGCAGAGTGTCCTCTTCCTGCTGGAAAGAACCCTGGGAA ATTTCTGAATCTCTCTCCTCAGCCCTCTCATGCAGAGGCTTGCCCCTTGACTCATTCAGACCTTCTCTTGAGTTTTC CTTCTTACATTTATTACTGATTTGAAGCTTTAAGACAAGGCCAAGTGCCTGACCCAAGGTAG 上述序列中的第181bp处的r是A或G，导致Pag I-RFLP多态性。
2. 扩增如权利要求1所述遗传标记的引物对，其DNA序列如下所示： 正向引物：TCCTCGGTGGAAGAGCAT， 反向引物：CTACCTTGGGTCAGGCAC。
3. -种制备猪脂肪沉积性状SNP遗传标记的方法，其特征在于，包括以下步骤： 从猪耳组织中提取基因组DNA，根据猪0LR1基因序列设计引物，其DNA序列如序列表 SEQ ID N0:4和5所示，用序列表SEQ ID N0:4和5所示的引物对在猪基因组DNA中进行 PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
4. 权利要求1所述的遗传标记在猪脂肪沉积性状检测中的应用。
5. 权利要求2所述的引物对在猪脂肪沉积性状检测中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104087582SQ201410344072
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】武华玉, 乔木, 彭先文, 吴俊静, 梅书棋, 郭咪咪, 宋忠旭, 刘贵生, 孙华, 李良华, 张华盖 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所