一种烟草疫霉菌lamp检测引物及其快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于烟草疫霉菌特异检测。根据烟草疫霉ITS基因序列设计出了一种烟草疫霉菌的LAMP引物。经过恒温扩增和加入SYBR green I显色剂或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特异性的梯形带。所述的LAMP引物及其快速检测方法可在生产实践中对烟草疫霉菌感染的植株和土壤中烟草疫霉菌进行快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，并且操作简便易行。
【专利说明】一种烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种烟草疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于烟草疫霉高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间烟草黑胫病的早期诊断，属于农作物病害检测、鉴定及防治【技术领域】。
【背景技术】
[0002]烟草疫霉菌(Phytophthoraparasitica = Phytophthora nicotianae)侵染烟草引起的烟草黑胫病是烟草生产上的毁灭性病害之一，烟草黑胫病是威胁世界烟草生产的主要病害，同时也是我国烟草生产中危害严重的病害之一。可危害烤烟、晒烟、晾烟、香料烟、白肋烟等所有栽培烟草，主要侵染烟草根部和茎基部，其初侵染来源为带菌土壤及病残体。烟株发病后其根系和茎基部变黑腐烂，并很快萎蔫死亡，有极强的破坏性，对烟叶的产量和品质影响极大。烟草黑胫病菌在自然条件下还可以侵染草莓、茄子等其它重要经济作物。烟草黑胫病在生产中常常与烟草根黑腐病及烟草青枯病等根茎类病害混合发生，给病害的诊断造成困难。病原菌本身的形态学和生物学性状具有较大的变异性，因而菌种鉴定也较为困难。因此建立烟草疫霉菌快速检测体系，早期对发病植株及土壤进行疫霉菌快速准确检测，对病害的预测预报及其传播和流行的控制均有重要的理论和实际意义。
[0003]目前对烟草疫霉菌的检测技术与方法主要包括常规检测方法和普通PCR法等。常规的检测方法通过病原菌的生物学培养、形态学观察及柯赫氏法则来判断其种类。传统方法在烟草疫霉菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力，而且要求操作者具备一定的病原菌分离、形态学鉴定等方面的专业知识。形态学特征为基础的常规病害诊断技术，耗时长、效率低，较难满足对烟草疫霉病诊断的实际生产需要，很容易错过病害防治的最佳时期。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测烟草疫霉菌，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概3-4h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。因此，建立一套快速准确的检测方法来对烟草疫霉菌进行检测。
[0004]环介导等温扩增技术(LOOP-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的样报的核酸扩增技术。其特点是针对靶基因的6个区域设计4个特异引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65°C范围保温60min内，即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色后在紫外灯下即可清晰的观察到反应结果。
[0005]由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应具有简单、高效、快速、经济等特征，因而应用前景极为广泛。目前LAMP检测主要应用于人、动物病原物、食品安全等的检测，在植物病原菌检测中也有报道，但有关烟草疫霉菌的LAMP检测国内还未见报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种用于烟草疫霉菌快速检测的LAMP引物组。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种烟草疫霉菌的LAMP快速检测方法。该方法用于快速检测烟草疫霉病菌，通过该方法可以快速诊断出疑似病株是否受烟草疫霉病菌侵染。
[0008]实现本发明的技术方案如下:
[0009]一种烟草疫霉菌LAMP检测引物序列如下:
[0010]外侧引物F3:5 ’ -CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3 ’
[0011]B3:5，-CCACCCTACTTCGCAACAG-3，
[0012]内侧引物 FIP: 5 ’ -AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGTTTGTCT-3，
[0013]BIP:5’ -TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’
[0014]一种烟草疫霉菌的LAMP检测体系的建立:
[0015]LAMP 检测=LAMP 反应体系 25 μ L，其中 F3 与 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，FIP 与 BIP各 I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L,Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在60-65°C温育60min，80°C保温lOmin。更优选的温育温度为63°C温育 60min。
[0016]所述的检测方法为荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法。所述荧光染料目测观察法:在LAMP反应的最终扩增产物中加入I μ L显色剂，显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。所述琼脂糖凝胶电泳法:取3μ LPCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，即可判断所述的烟草组织或土壤中存在烟草疫疫霉菌。没有出现扩增条带判断为阴性，即所述的烟草组织或土壤中未存在烟草疫霉菌。
[0017]本发明建立了烟草疫霉菌快速、特异性强、灵敏度高的检测技术体系，对于烟草疫霉菌引物病害显症之前的早期监测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势:
[0018]1、结果可靠:本发明所设计出的LAMP检测引物，对来源不同的49种不同真菌与卵菌，以及带烟草疫霉菌的组织和土壤进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；
[0019]2、特异性强:本发明所采用的LAMP引物是针对烟草疫霉菌ITS序列中6个不同区域设计出4条特异性引物，6个区域中任何区域与引物不匹配增色不能进行核酸扩增，故特异性高；
[0020]3、灵敏度高:LAMP对烟草疫霉菌的检测灵敏度高，在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测高1000倍；
[0021]4、实用性好:本发明所设计出的LAMP引物，可用于带烟草疫霉菌的组织和土壤快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织和土壤中存在的烟草疫霉菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
[0022]5、操作简便快速:应用本发明方法，对带烟草疫霉菌的组织和土壤进行检测可在I小时内完成，且LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明烟草疫霉菌的LAMP特异性检测结果图。其中:泳道M为marker，泳道I为阳性对照，泳道2为阴性对照，泳道3-10为烟草疫霉菌，泳道11-20为其它卵菌和真菌菌株。
[0024]图2为本发明烟草疫霉菌的LAMP灵敏性检测结果图。其中:泳道M为marker，泳道 1-10 模板浓度分别为 1ng, lng, 10pg, 1pg, lpg, 10fg, 1fg 和 Ifg0
[0025]图3为本发明对发病植株的检测结果图。其中:泳道M为marker，泳道I为阳性对照，泳道2为阴性对照,泳道3为发病组织,泳道4为发病土壤,泳道5为健康组织。
【具体实施方式】
[0026]本发明的技术内容包括烟草疫霉菌的LAMP检测引物，LAMP引物序列分别为:
[0027]外侧引物F3:5 ’ -CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3 ’
[0028]B3:5， -CCACCCTACTTCGCAACAG-3’
[0029]内侧引物 FIP: 5，-AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGTTTGTCT-3，
[0030]BTP:5，-TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’
[0031]利用LAMP引物检测烟草疫霉菌结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带。
[0032]主要试剂:Bst DNA聚合酶大片段购自美国New England B1labs司；其余试剂均购自上海生工生物技术有限公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
[0033]实施例1:LAMP弓I物对烟草疫霉菌的特异性扩增及引物序列的验证
[0034]本发明的关键性技术是烟草疫霉菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证烟草疫霉菌的特异引物序列，本发明以四川、安徽等省的26株烟草疫霉菌和23种其它植物病原菌为供试材料，采用CTAB法提取组织中烟草疫霉菌的DNA。具体方法如下:取0.5克干燥菌丝，加液氮研磨成粉末状,迅速移入1.5ml Eppendorf管中；加入800 μ I的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65°C水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min后12000r/min,离心15min ;小心吸取上清液,加入等体积的酹:氯仿(各400 μ I)溶液,混勻，4°C, 12000r/min,离心1min ;小心吸取上清液,加入等体积的氯仿,混勻,4°C, 12000r/min,离心lOmin。重复步骤(4) 1_2次，以蛋白层不出现为止；取上清，-20°C沉淀lh,4°C,12000r/min，离心1min ;弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后(一般干燥5-1511^11)，溶于30-5(^1 DEPC去离子水中，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/ μ I,于-20°C下保存备用。
[0035]对23株其它植物病原菌菌株和26个烟草疫霉菌菌株进行LAMP检测，验证LAMP方法的特异性。
[0036]①LAMP 反应体系 25 μ 1:包含 F3 与 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，FIP 与 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育60min,80°C保温lOmin。
[0037]②在LAMP反应的最终扩增产物中加入I μ L显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光，判断为阳性，橙色判断为阴性。或取3μ L扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
[0038]2.检测结果:除了烟草疫霉菌显色结果可观察到绿色荧光或琼脂凝胶电泳检测出现LAMP特征性的梯形带外，检测了 23种其它植物病原菌菌株显色结果为橙色或琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带(部分结果见图1)。这说明该引物具有很强的特异性，可被用于生产实践中发病组织及土壤中烟草疫霉菌快速可靠的检测和鉴定。
[0039]实施例2 =LAMP引物对烟草疫霉菌的灵敏性检测
[0040]1.烟草疫霉菌的LAMP灵敏性检测
[0041]采用10倍浓度系列稀释法将提取的烟草疫霉菌DNA稀释成1000ng、100ng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、0.lpg、0.01pg、0.0Olpg 共 10 个不同浓度梯度。
[0042]①LAMP 反应体系 25 μ 1:包含 F3 与 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，FIP 与 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L，不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育60min,80°C保温lOmin。
[0043]②在LAMP反应的最终扩增产物中加入I μ L显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光，判断为阳性，橙色判断为阴性。或取3μ L扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
[0044]2.检测结果:烟草疫霉菌的LAMP灵敏性检测，结果可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带,检测灵敏度可达0.1pg0
[0045]实施例3:发病组织或土壤中烟草疫霉菌的检测
[0046]1.样品采集:植物组织样品采自四川省凉山州西昌烟草生产区；土壤样品采自四川省凉山州德昌烟草生产区。
[0047]2.DNA提取及检测
[0048]发病植物组织采用NaOH快速裂解法提取烟草疫霉菌的DNA，具体过程如下:(I)将烟草病茎洗净、晾干，剪发病部位；(2)按Img病叶加入10yL(0.5mol/L Na0H,0.5% PVP)计量，将组织充分磨碎成糊，在12000g离心机中离心5min ； (3)取上清20 μ L与等体积的
0.lmol/LTris-HCL(pH8.0)混合；(4)稀释 10 倍、100 倍、1000 倍液，分别取 I μ L 原液、10倍、100倍、1000倍液作为PCR模板进行扩增。
[0049]发病土壤采用土壤DNA提取法提取土壤中烟草疫霉菌的DNA。具体方法如下:取过过筛的土壤冷冻抽干24-48h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 μ L0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀。12000rpm离心15min。取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为10 μ g/ml蛋白酶K，55°C水浴l_3h。水浴结束后，加入1/2体积的7.5M NH4AC溶液,上下颠倒混勻。12000rpm离心15min。吸上清加2倍体积无水乙醇_20°C沉淀(沉淀时间1.5h)。沉淀结束后，12000rpm离心15min。用70%乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用1yL TE (或无菌超纯水)溶解，-20°C保存备用。
[0050]①LAMP 反应体系 25 μ 1:包含 F3 与 B3 各 0.25 μ L (20 μ mol/L)，FIP 与 BIP 各I μ L(20 μ mol/L)，10XThermoPol React1n buffer2.5 μ L, Betaine5μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在63°C温育60min,80°C保温lOmin。
[0051]②在LAMP反应的最终扩增产物中加入I μ L显色剂，所述显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光，判断为阳性，橙色判断为阴性。或取3μ L扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带，即可判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
[0052]3.检测结果
[0053]如图3所示，发病组织或土壤中感染烟草疫霉菌，紫外灯下可观察到绿色荧光或琼脂糖凝胶电泳出现LAMP特征性的梯形带，健康组织则可观察到橙色荧光或琼脂糖凝胶电泳不出现LAMP特征性的梯形带。
【权利要求】
1.一种烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，其特征在于:所述的烟草疫霉菌LAMP检测引物为: 外侧引物 F3:5，-CTGGTTGTGAAGGCTGCTAT-3，
B3:5’ -CCACCCTACTTCGCAACAG-3’
内侧引物 FIP:5’ -AGCCGAAGCCAACCATACCACATTGGCGACTGGITTGTCT-3’
BIP:5’ -TGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCAAAAGCCAAGCCACCGAG-3’。
2.如权利要求1所述的烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，其特征在于:所述LAMP的检测体系为:LAMP反应体系25 μ L，其中F3与B3各0.25 μ L (20 μ mol/L)，FIP与BIP各I μ L(20 μ mol/L)，10 X ThermoPol React1n buffer2.5 μ L，Betaine5 μ L(10 μ mol/L)，dNTPsl μ L(10mmol/L)，BstDNA 聚和酶 I μ L (8U/ μ L)，DNA 模板 0.5 μ L,不足部分用无菌双蒸水补足；LAMP反应条件为在60-65°C温育60min，80°C保温lOmin。
3.如权利要求2所述的烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，其特征在于:所述的LAMP反应温育温度为63°C温育60min。
4.如权利要求1所述的烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，其特征在于:所述的检测方法为荧光染料目测观察法，在LAMP反应的最终扩增产物中加入I μ L显色剂，显色剂为SYBR green I，显色结果观察到绿色荧光判断为阳性，橙色判断为阴性。
5.如权利要求1所述的烟草疫霉菌LAMP检测引物及其快速检测方法，其特征在于:所述的检测方法为，取3 μ LPCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，如果出现LAMP特征性的梯形带判断为阳性，没有出现扩增条带判断为阴性。
【文档编号】C12Q1/04GK104232755SQ201410350133
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】王勇, 张海珊, 高正良, 许大凤, 刘东阳, 卢军, 周本国, 章东方, 严丹侃, 王芳 申请人:四川省烟草公司凉山州公司, 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所, 安徽省农业科学院烟草研究所