一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因HbSAG12Hl及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因HbSAG12Hl，具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其cDNA长1524bp，包含一1038bp的开放读码框（0RF)，编码345个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。根据基因序列设计引物，可对基因的表达水平进行定量，其表达丰度与叶片衰老水平的变化趋势一致，可用于评估叶片是否衰老及衰老水平。该基因的获得，为筛选橡胶树衰老叶片及建立橡胶树叶片衰老诱导体系创造了条件，具有重要的理论意义和潜在的商业价值。
【专利说明】-种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAGI2H1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物衰老（senescence)是指植物细胞、组织、器官或整个植株生理功能的逐渐衰 退，是长期进化和自然选择的结果，是一个高度调控的细胞程序性死亡（Progra_ed cell death，P⑶）过程。目前关于植物衰老的研究主要集中在叶片上，且大多集中于拟南芥、水 稻、烟草等模式植物。在叶片的衰老过程中，细胞结构、生理生化代谢以及基因表达调控等 都发生很多变化。在形态上，叶片因叶绿素的降解而呈现为黄色（Ougham H，H0rtensteiner S, Armstead I, et al. The control of chlorophyll catabolism and the status of yellowing as a biomarker of leaf senescence. Plant Biol (Stuttg),Suppl 第 I 期，4-14 页，2008;H0rte.nsteiner S, KrSlltler B. Chlorophyll breakdown in higher plants. Biochim Biophys Acta,第 1807卷，第 8 期，977-988 页，2011)，这一典型特征为相 关研究提供了极大的便利；在分子水平，叶绿素的降解常伴随着一些标记分子如AtSAG12 等半胱氨酸蛋白酶表达水平的显著上升（Lim PO, Kim HJ, Nam HG. Leaf senescence. Annu Rev Plant Biol,第 58 期，115-136 页，2007)。
[0003] 天然橡胶（顺-1，4-聚异戊二烯）是一种重要的工业原料和战略物资，其主要来 源为橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡胶树又叫巴西橡胶树或三叶橡胶树， 是一种隶属于大戟科（Euphorbiaceae)的高大乔木。橡胶树原产于亚马逊河流域，目前作 为一种特种经济作物在东南亚、中国和非洲等部分国家和地区广泛移植。生产上，天然橡胶 通过用胶刀周期性地切割树皮（内含乳管--一类橡胶生物合成与存贮的特异细胞）收集 胶乳而获得。死皮（其主要类型为割面干涸，Tapping Panel Dryness,TPD)是指橡胶树割 胶过程中出现的割线局部或整体不排胶现象。它会造成橡胶树严重减产甚至完全绝收，是 目前生产上影响橡胶树产量的关键因素（邹智，杨礼富，王真辉，等.橡胶树"死皮"及 其防控策略探讨.生物技术通报，第9期，8-15页，2012)。据统计，目前全球因死皮而停 割的橡胶树约占开割树的12-15% ;我国橡胶树的死皮发生率约为25%，部分胶园甚至超 过50%。其中，仅死皮停割率就接近15%，并且每年以1-3%的速度递增，每年造成的经济 损失已超过30亿人民币。细胞和分子生物学证据表明，死皮的发生与植物的细胞程序性死 亡现象非常相似（Li DJ, Deng Z, Chen SC, et al. Identification and characterization of genes associated with tapping panel dryness from Havea brasiliensis latex using suppression subtractive hybridization. BMC Plant Biol,第 10卷，第 I 期，140 页，2010)。虽然如此，由于种种原因，深入开展死皮发生的分子机制研究面临着严峻的挑 战，原因如下：（1)橡胶树为多年生高大乔木，传统育种周期在30年以上；（2)橡胶树的遗 传转化周期在1年以上，且转化技术至今仍不是非常成熟（邹智，杨礼富，王真辉，等.巴 西橡胶树转基因研究现状与展望.中国生物工程杂志，第30卷，第1期，85-92页，2010);
[3] 死皮与橡胶生产紧密相关，只有割胶后才能鉴定其症状，而橡胶树的非生产期一般在8 年左右（邹智，杨礼富，王真辉，等.橡胶树"死皮"及其防控策略探讨.生物技术通报， 第9期，8-15页，2012) ; (4)死皮症状的鉴定需要多年的割胶和数月的跟踪观测，不利于 大批量地获得实验材料；（5)与产排胶相关的乳管组织位于树干的次生韧皮部，诱导获取 实验材料属于破坏性实验，这对生产周期在25年以上的橡胶树来说是莫大的损失；(6)乳 管组织无法分离进行离体培养和诱导；（7)遗传转化体系成熟的模式植物如拟南芥、烟草 等无乳管组织，对死皮相关基因的鉴定主要依赖叶片等组织（Peng SQ，Wu KX，Huang GX，et al. HbMybl, a Myb transcription factor from Hevea brasiliensis, suppresses stress induced cell death in transgenic tobacco. Plant Physiol Biochem,第 49 卷，第 12 期，1429-1435页，2011)，而这无法避免物种不同所带来的差异。因此，在橡胶树上建立一 套高效、可重复的叶片衰老诱导体系成为开展橡胶树死皮相关基因功能鉴定的重要保障。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl及其应用，可用于 评估橡胶树叶片的衰老水平，保障橡胶树叶片衰老诱导体系的顺利进行。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl基因，其cDNA具有如SEQ ID NO : 1所示的核苷酸序列。
[0007] 进一步，所述的橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。
[0008] -种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl的表达水平在叶片衰老水平的 评估方面的应用。
[0009] 进一步，所述的橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl表达丰度与叶
[0010] 片的衰老水平变化趋势一致。
[0011] 本发明所述的一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl，核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。其cDNA长1524bp，包含一 1038bp的开放读码框（ORF)，编码345个氨基 酸，与植物半胱氨酸蛋白酶同源，与拟南芥SAG12 (TAIR登录号为AT5G45890)的相似性为 57. 7 %。ProtParam分析显示，HbSAG12Hl蛋白包含半胱氨酸酶活性所必须的3个活性位点； 与AtSAG12类似，HbSAG12Hl蛋白N端包含一的液泡定位的信号肽。根据序列设计引物，可 对基因的表达水平进行定量。通过对橡胶树不同部位以及叶片不同生长时期HbSAG12Hl基 因的表达特性分析表明，所述的HbSAG12Hl基因仅在衰老叶片中表达，且其表达丰度随着 叶片衰老水平的增加而增加。因此，通过对本发明所述的一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码 基因 HbSAG12Hl表达丰度进行定量分析，可用于评估叶片衰老水平，为筛选橡胶树衰老叶 片创造了条件，同时为建立橡胶树叶片衰老诱导体系的顺利进行提供了保障，具有重要的 理论意义和潜在的商业价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1橡胶树SAG12同源蛋白的进化分析
[0013] 以 AtSAG12 为根的进化树用 MEGA4. 0(Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4:Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)software version4. 0. Mol Biol Evol，第24卷，第8期，1596-1599页，2007)采用邻近法构建而成，bootstrap值 设为1000,标尺表示每个残基的替换率，分支长度表示进化距离，分支节点上的数字表示 bootstrap验证中该支的可信度百分比。
[0014] 图2橡胶树HbSAG12Hl与AtSAG12及其他物种中的同源蛋白的多重比对
[0015] 图3橡胶树HbSAG12Hl基因的表达特性分析
[0016] 图中M :Takara DL2000 ;1 :根；2 :树皮；3 :木质部；4 :芽；5 :叶柄；6 :叶柄胶；7 : 古铜期叶片；8 :变色期叶片；9 :淡绿期叶片；10 :稳定期叶片；11 :衰老早期叶片；12 :衰老 中期叶片；13 :衰老晚期叶片
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施 例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于 本发明保护的范围。
[0018] 实施例1
[0019] 橡胶树AtSAG12同源基因的全基因组鉴定
[0020] 橡胶树品系热研7-33-97的全基因组序列采用454和Illumina测序技术相结合 的方法完成。
[0021] 以拟南芥SAG12蛋白（TAIR登录号为AT5G45890)作为查询序列，采用tBLASTn 程序（Altschul SF，Madden TL, SchSlTer AA，et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res,第 25卷，第17期，3389-3402页，1997)对上述基因组序列进行同源搜索，潜在的基因用 GeneMark(http://exon. gatech. edu/)预测和同源比对相结合的方法界定转录区。这样， 总共获得13条包含同源基因的scaffold。根据序列的相似性，将这些同源基因分别命 名为HbSAG12Hl-HbSAG12H13(图1)。其中，HbSAG12Hl编码345个氨基酸，其氨基酸序列 如SEQ ID NO :2所示，其与拟南芥SAG12 (TAIR登录号为AT5G45890)的相似性最高，约为 57. 7% 〇 ProtParam(http://web. expasy. org/cgi-bin/protparam/protparam)分析显不， HbSAG12Hl 蛋白的理论分子量（Mw)为 38. 20kD，等电点（pi)为 8. ZOoSMARTQittpV/smart. embl-heidelberg. de/)保守结构域分析表明，HbSAG12Hl蛋白含有1个Inhibitor_I29和 1个Peptidase_ClA结构域（其中包含半胱氨酸酶活性所必须的3个活性位点，即Cys活 性位点、His活性位点和Asn活性位点）（图2)。此外，与AtSAG12类似（Otegui MS，Noh YS, Martinez DE,et al. Senescence-associated vacuoles with intense proteolytic activity develop in leaves of Arabidopsis and soybean. Plant J,第 41 卷，第 6 期，831-844页，2005)，HbSAG12Hl的N端包含一液泡定位的信号肽（图2)。
[0022] 实施例2
[0023] 橡胶树成熟与衰老中期叶片的转录组深度测序
[0024] 橡胶树品系为热研7-33-97,叶片总RNA的提取参照文献（Tang C，Huang D,Yang J, et al. The sucrose transporter HbSUT3plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis(para rubber tree) .Plant Cell Environ,第 33卷，第 10 期，1708-1720 页，2010)。
[0025] 为筛选橡胶树衰老叶片特异性表达的HbSAG12H基因，首先，采用 Hiseq2000 (Illumina Inc.，San Diego, CA, USA)对处于成熟期和衰老中期（叶片黄化比例 为成熟期的40-60% )叶片进行了转录深度测序，经过文库构建、测序簇的生成、上机测序， 两库均获得约 5G 的数据。接着，利用 Bowtie2 (Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie2. Nat Methods,第 9 卷，第 4 期，357-359 页，2012)将测序获得 的原始read比对到实施例1中获得的13个HbSAG12H基因上（如无特别说明，Bowtie2均 默认参数），发现只有HbSAG12Hl在两库中有比对上的read，其数量分别为成熟期16条，衰 老中期3536 条，若以 RPKM(Reads Per kb per Million reads)值（Mortazavi A, Williams BA, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods,第5卷，第7期，621-628页，2008)表示基因的表达丰度，HbSAG12Hl在衰 老中期叶片中的表达水平是成熟期的5051倍以上。
[0026] 实施例3
[0027] 橡胶树HbSAG12Hl基因全长cDNA的克隆
[0028] 通过米用 Bowtie2 (Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie2. Nat Methods,第9卷，第4期，357-359页，2012)将实施例2中获得的转录组数 据比对到基因组上，界定HbSAG12Hl的全长cDNA为1524bp。
[0029] 根据上述序列信息，设计引物对 HbSAG12HlF (5'-CTG TGC CAT TTC AAA GAT TCA CTT CAA CG-3'）和 HbSAG12HlR(5'-CAA AAA CCC TGG AAG CTG TCA CTT GAG-3'）。
[0030] 米用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒将实施 例2中获得的衰老中期叶片的总RNA反转录成cDNA，具体操作详见试剂盒说明书。
[0031] 以衰老中期叶片反转录获得的cDNA为模板，HbSAG12HlF和HbSAG12HlR为引物 进行 PCR 扩增，反应体系如下：L 0 μ L 模板 cDNA，5. 0 μ LlO X PCR buffer，5. 0 μ L25mmol/L MgS04,8. 0μ L2. 5mmol/L dNTP, 0. 5 μ L20 μ mol/L HbSAG12HlF, 0. 5 μ L20 μ M HbSAG12HlR, I. 0 μ Llu/ μ L Taq (TaKaRa)，加双蒸水至 50 μ L。
[0032] 用Eppendorf5331PCR仪进行PCR反应，反应条件如下：94°C预变性3min，然后 941：3〇8,581：3〇8,721：9〇8,35个循环，最后721：延伸5111丨11。吸取2.5以1^?0?产物与 2.5yL溴酚蓝混匀后用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳后，经溴化乙锭（EB)染色，再紫外成像 检测。PCR产物挖胶回收后连接到pMD18-T上，用热击法导入JM109感受态细胞后，进行蓝 白斑筛选、PCR验证、质粒酶切电泳后，取处于对数生长期的阳性菌液ImL用400 μ L4°C预冷 的50%甘油保存，委托北京三博远志生物有限责任公司用M13+/M13-进行双向测序。这样， 我们成功获得HbSAG12H11524bp的全长cDNA。
[0033] 实施例4
[0034] 橡胶树HbSAG12Hl基因的表达特性分析
[0035] 根据实施例3的测序结果，设计引物对HbSAG12HlFq (5'-TGG ATT GGA GAA AGG CAG G-3，）和 HbSAG12HlRq(5，-CTT CAC AAC CTT CGT TCC CA-3，）。
[0036] 橡胶树品系热研7-33-97组培苗根、树皮、木质部、芽、叶柄、古铜期叶片、变色期 叶片、淡绿期叶片、稳定期叶片、衰老早期叶片、衰老中期叶片、衰老晚期叶片总RNA的提 取参照文献（Tang C, Huang D, Yang J，et al. The sucrose transporter HbSUT3plays an active role in sucrose loading to laticifer and rubber productivity in exploited trees of Hevea brasiliensis(para rubber tree). Plant Cell Environ,第 33卷，第10期，1708-1720页，2010)，叶柄胶总RNA的提取参照文献（Tang C，Qi J，Li H, et al. A convenient and efficient protocol for isolating high-quality RNA from latex of Hevea brasiliensis(para rubber tree). J Biochem Biophys Methods,第 70 卷，第 5 期，749-754 页，2007)，然后采用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒将总RNA反转录成cDNA，具体操作详见试剂盒说明书。
[0037] 分别以上述合成的cDNA为模板，上述HbSAG12HlFq和HbSAG12HlRq为引物进行半 定量 RT-PCR(内参为 18S rRNA，引物为 18SF:5'-GCT CGA AGACGA TCA GAT ACC-3' ；18SR: 5'-TTC AGC CTT GCG ACC ATA C-3'），反应体系如下：1. OyL 模板 cDNA，5. OyLlOXPCR buffer,5· 0 μ L25 mmol/L MgSO4,8· 0 μ L2. 5mmol/L dNTP，0· 5 μ L20μ mol/L HbSAG12HlFq 或 18SF，0· 5 μ L20 μ MHbSAG12HlRq 或 18SR，I. 0 μ Llu/μ L Taq(TaKaRa)，力口 双蒸水至 50 μ L，每样至少重复3次。
[0038] 用Eppendorf5331PCR仪进行PCR反应，反应条件如下：94°C预变性3min，然后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 20s，18S rRNA 扩增 18 个循环，HbSAG12Hl 扩增 35 个循环，最后 72°C延伸5min。吸取2. 5 μ L PCR产物与2. 5 μ L溴酚蓝混匀后用1. 5%琼脂糖凝胶进行电 泳后，经溴化乙锭（EB)染色，再紫外成像检测。
[0039] 半定量RT-PCR分析结果显示，内参基因18S rRNA在对照上述组织中的表达丰度 相对稳定（图3,下）；而HbSAG12Hl仅在衰老叶片中被检测，并且随着叶片衰老水平的增加 而增加（图3,上）。
[0040] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl，其CDNA具有如SEQIDN0:l所示 的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl，编码的氨基 酸序列如SEQ ID NO :2所示。
3. 如权利要求1至2任一项所述的一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl在 评估叶片衰老水平方面的应用。
4. 如权利要求3所述的一种橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl在评估叶片衰 老水平方面的应用，其特征在于：所述的橡胶树半胱氨酸蛋白酶编码基因 HbSAG12Hl的表 达丰度与叶片的衰老水平变化趋势一致。
【文档编号】C12Q1/68GK104212824SQ201410356280
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】邹智, 龚俊, 杨礼富 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所