一种增强植物耐盐性的拟南芥AtPGK2基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明克隆了一种增强植物耐盐性的拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因AtPGK2，并公开了其应用。该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，也包括与SEQIDNO:1核苷酸序列同源性在90～100%之间的基因。本发明同时还提供了重组载体的构建和转基因的方法以应用上述基因，可培育耐盐性更强的转基因植物新品种，具有广泛的应用价值。
【专利说明】-种增强植物耐盐性的拟南芥基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，具体说是利用分子生物学技术获得一种能够增强 植物耐盐性的基因及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化在全世界都十分严重，盐胁迫是影响全球农作物产量的重要非生物胁 迫之一（Parvaiz and Satyawati, 2008)。我国盐渍土面积大、分布广、类型多，约占国土 面积的10%，而且每年盐碱化和次生盐碱化都在不断加重，使农业生产的可持续发展受到威 胁，严重影响植物的生长发育和经济作物的产量与品质(孙建昌等，2008)。因此，培育耐盐 性增强的转基因农作物新品种是一项十分迫切的任务。
[0003] 植物基因工程是指在生物体外，利用工具酶对DNA分子进行"剪接"和"拼接"形 成重组的DNA分子，将其转化植物细胞并使其表达。目前，利用植物基因工程培育耐盐性 增强的转基因植物新品种已取得一定的进展。许多研究表明，将植物的耐盐相关基因导入 自身或者其他物种的细胞并产生转基因植株，可以显著增强转基因植物的耐盐能力。如在 拟南芥中过量表达玉米的基因能够提高转基因植株在萌发期和幼苗期对盐胁迫的 耐受性（Wang et al.，2007);Chen等（2008)利用组成型启动子dKJ仍驱动拟南芥 基因在荞麦中过量表达，转基因荞麦植株中主要营养成分的含量未受高盐胁迫的影 响；Liang等（1997)利用dK J仍启动子驱动菠菜的似Μ基因在烟草植株中过量表达， 转基因烟草的耐盐性显著提高。
[0004] 植物的3_磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase, PGK)作为重要的酶催 化3-磷酸甘油酸和1，3-二磷酸甘油酸之间的互变，在碳固定、糖酵解和糖异生代谢中具 有重要功能（Blake and Rice, 1981; Watson et al·，1982)。目前，许多编码 PGKs 的 基因在植物、动物和微生物中被克隆（Watson and Littlechild，1990)。在植物中，如豌 豆（Pacold and Anderson, 1975)、小麦（Longstaff et al·，1989)、大麦（McMorrow and Bradbeer, 1990)、疲菜（Kopke-Secundo et al·，1990)和番爺（Rao et al·，1995)等 的PGKs先后被分离和克隆，并且其编码的蛋白多数被纯化用于酶活性研究。序列分析表 明，高等植物的PGKs由两个细胞核基因编码，其编码蛋白的氨基酸序列具有较高的同源 性，其中，一个基因编码的氨基酸序列在N-末端有一段大约由70个氨基酸组成的定位于 叶绿体的转运肽，相反，另一个基因编码的氨基酸序列在N-末端并无转运肽序列。因此， 推测由高等植物细胞核编码的两个PGKs分别定位于叶绿体和细胞质（Longstaff et al.， 1989; Kitayama and Togasaki, 1995)。以上所述对高等植物PGKs基因的分离、克隆、序 列分析和其编码蛋白的酶活性研究多数集中在上世纪后期。进入本世纪，虽然近期有研究 表明在盐胁迫条件下，植物体内PGK蛋白的含量显著增加 （Kosova et al.，2011; Wang et al.，2013)，但是对于其生理功能特别是参与植物响应盐胁迫的功能尚不清楚。
[0005] 植物为适应盐胁迫，以最大限度减少盐胁迫对自身的伤害，从对盐胁迫信号的感 知、胞间信号传递和胞内信号转导到最终调控胁迫响应基因的表达，使植物产生一系列形 态、生理和生化的变化来抵御盐胁迫（Zhu, 2002; Jiang and Deyholos, 2006; Radi et al.，2013)。为了挖掘植物耐盐基因并培育耐盐性增强的转基因植物，本发明克隆了拟南 芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因将该基因转化模式植物拟南芥，发现转基因拟南芥 植株对盐胁迫的耐受性明显增强。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是分离和克隆植物的耐盐基因，并对其参与盐胁迫响应的功能进行鉴 定，提供一种分子生物学模式植物拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因及其在转基因植 物中的应用。
[0007] 本发明提供了一种新的、1437 bp的拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因序列， 该基因的核酸序列选自： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之间的同源性核苷酸序列。作为具体应 用的实例，本发明提供了一种拟南芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆方法，具体 操作步骤如下： (1) 提取拟南芥植株的总RNA并反转录为cDNA ; (2) 以cDNA为模板，用PCR方法扩增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR扩增产物。
[0008] 本发明同时提供了拟南芥3-磷酸甘油酸激酶基因植物耐盐性胁迫的应 用，即：利用克隆的基因的CDS序列，构建的融合基因，进行植 物转化，从而获得在拟南芥中组成型表达目的基因的转基因植物。其中所述的融合 基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者农作物耐盐性状改良需 要的目的基因。
[0009] 作为具体应用的实例，本发明提供了一种"dK "融合基因的构建及 其在转基因拟南芥参与盐胁迫的应用。具体操作过程如下： (1) 用Afco I/fc仿11双酶切通过PCR扩增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II双酶切pCAMBIA 1301 (购自CAMBIA公司）质粒，回收大的载体 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的"dK "融合基因的构建。
[0010] 其中所设计的J 基因的⑶S序列的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位点，下游引物引入了 仿II酶切位点： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3，。
[0011] 所述应用中的"dK "融合基因的构建在转基因拟南芥中组成型表达 表达，操作过程如下： 拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法（Clough and Bent, 1998)，获得的种子经过50 mg Γ1潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用50 mg Γ1的潮霉素进行抗性筛选获得转化4^6尤?基因的纯合转基因拟南芥株系，然后检测转 基因拟南芥株系的耐盐性。
[0012] 本发明的积极效果： 试验结果表明，将克隆的编码3-磷酸甘油酸激酶基因转化模式植物拟南芥，可 以显著提高转基因植株的耐盐性。本发明的融合基因构建"dK "可作为基因 资源在农业生产上使用或选育转基因植物以提高耐盐性，具有广泛的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1是转化"dK 融合基因的转基因拟南芥株系中目的基因 的表达分析，#P < 0. 01。
[0014] 图2是转化"dK "融合基因的转基因拟南芥株系幼苗期的耐盐性 分析。
[0015] 图3是转化"dK J"融合基因的转基因拟南芥株系成苗期的耐盐性 分析。*Ρ < 0.05。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1 :拟南芥编码3-磷酸甘油酸激酶基因的克隆 (1)利用异硫酸腈胍-酚法提取拟南芥植株的总RNA，药品的使用、配制以及具体操作 步骤参考黄培堂等（2002)的方法。
[0017] (2 )根据已知的拟南芥J 基因的⑶S序列设计特异引物，在上游引物中引入 Afco I酶切位点，在下游引物中引入仿11酶切位点。
[0018] h游引物：5' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3' (引入 Afco I 酶切位点） 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' (引入仿 II 酶切位点） (3)取1 mg RNA作反转录的模板，以P2853为引物利用Promega的反转录酶ImProm-II ?进行反转录，P2853引物序列、反转录程序和反转录体系如下。
[0019] P2853 引物序列：5' -GCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' 反转录程序： 72°C 5分钟；25°C 5分钟；42°C 60分钟；80°C 20分钟；4°C保温。
[0020] 反转录体系：
【权利要求】
1. 一种增强植物耐盐性的拟南芥基因，其特征在于，是下列核苷酸序列之一： (a) 如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； (b) 在（a)限定的核酸序列中具有90?100%之间的同源性核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述增强植物耐盐性的拟南芥基因的克隆方法，具体操作步骤 如下： (1) 提取拟南芥植株的总RNA并反转录为cDNA ; (2) 以cDNA为模板，用PCR方法扩增Ji/^似基因的⑶S序列； (3) 回收PCR扩增产物。
3. 如权利要求1所述的增强植物耐盐性的拟南芥基因的应用，它是利用克隆 的基因的CDS序列，构建" dK "的融合基因，进行植物转化，从而获 得在拟南芥中组成型表达目的基因的转基因植物，其中所述的融合基因中的目的 基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者农作物耐盐性状改良需要的目的基因； "dK 融合基因的构建及其在转基因拟南芥参与盐胁迫的应用，具体操作过 程如下： (1) 用Afco I/fc仿11双酶切通过PCR扩增的J ?/^尤?基因的⑶S序列片段； (2) 用Afco I/fc仿II双酶切pCAMBIA 1301 (购自CAMBIA公司）质粒，回收大的载体 片段； (3) 混合上述第一步得到的^#6尤?基因的⑶S序列片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的"dK "融合基因的构建； 其中所设计的基因的CDS序列的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了 Afco I酶切位点，下游引物引入了办仿Π 酶切位点： 上游引物：5 ' -CATGCCATGGCTTCCACCGCCGCAACTGCA-3 ' 下游引物：5' -GGGTAACCTTAAACAGTGACTGGCGTTGCT-3' ； 所述应用中的" dK "融合基因的构建在转基因拟南芥中组成型表达，操 作过程如下：拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法，获得的种子 经过50 mg Γ1潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用50 mg Γ1的潮霉素 进行抗性筛选获得转化基因的纯合转基因拟南芥株系，然后检测转基因拟南芥株 系的耐盐性； 所述植物为小麦、大麦、水稻、玉米、大豆、花生、棉花、马铃薯、油菜、番茄、黄瓜、苜蓿或 拟南芥。
【文档编号】C12N15/54GK104120138SQ201410358406
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月26日 优先权日:2014年7月26日
【发明者】刘栋, 李卫春, 马利霞, 程建峰 申请人:江西农业大学