神经元与神经胶质细胞有序共培养装置、制备方法及神经元与神经胶质细胞有序共培养方法
【专利摘要】本发明涉及细胞生物学领域，公开了一种神经元细胞和神经胶质细胞有序共培养装置及其制备方法和应用。该装置包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地复合在所述基底上；所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距离为500μm～2000μm。本发明通过垂直于基底的第一通孔和第二通孔接种神经元细胞和神经胶质细胞，两种细胞在各自区域接种时均匀性易于控制，可使用的细胞量增大，群体效应明显，利于观察研究。
【专利说明】神经元与神经胶质细胞有序共培养装置、制备方法及神经元与神经胶质细胞有序共培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置、其制备方法及神经元与神经胶质细胞有序共培养的方法。
【背景技术】
[0002]近年来的研究结果表明，神经元与神经胶质细胞不仅存在物质交换，也存在信息交换。神经元与胶质细胞之间相互作用方式如何影响其物质、信息交流，以及它们相互作用方式的改变与多种脑部疾病如阿尔兹海默症、帕金森综合症等相关性研究成为神经科学的又一研究热点。
[0003]目前可用于研究神经元与胶质细胞相互作用体外共培养体系是Banker等于20世纪90年代建立起来的以培养神经元细胞为目的的培养方法，有学者在此基础上进行改良，成功建立了神经元与胶质细胞的共培养方法。但是上述方法是以胶质细胞为滋养层，在其表面接种上神经元细胞，两种细胞无序错落生长，难以用于研究神经元与胶质细胞相互作用研究。
[0004]专利号为200710117815.8和200710119997.2的发明专利基于微流控技术建立了在金表面多种细胞共培养装置及方法，此两种粘附和操纵多种细胞的方法所用基底均采用在玻璃表面蒸镀一层金的方法制备，这种基底需要在超净间利用高真空设备制备，价格较贵，并且金层性质不稳定，不可以长期保存，不利于在生物实验室推广。
[0005]专利号为201010105018.X的发明专利公开了一种基于微流控技术建立了在玻璃表面研究多种细胞相互作用的装置及其制备方法和用途，这种方法将多种细胞分别接种于不同的微流孔道中待其在基底粘附后，除去微流孔道，实现多种细胞相互作用。但是这种装置用于神经元和神经胶质细胞有序共培养时存在很多不足，第一，在微流孔道中接种细胞，细胞在狭长的孔道中分布不均匀；第二，细胞在微流孔道中由于培养基量少，细胞生存时间很短，而较短的时间并不能保证神经元与胶质细胞同时处于培养好的时间段；如果要不停的更换培养基，易使细胞漂浮，最终不稳定死亡；第三，微流孔道中细胞容量少，用于研究两种胞相互作用的群体效应不明显，不利于观察研究。另外，由于神经元细胞不能传代培养，而上述装置要求各种细胞接种时间不宜间隔过长，因此，上述装置难以用于神经元与神经胶质细胞相互作用研究。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置及其制备方法及神经元与神经胶质细胞有序共培养的方法，使得本发明所述装置在接种神经元细胞与胶质细胞时易于控制细胞均匀性，并可以延长两种细胞接种间隔时间，实现神经元与神经胶质细胞的有序共培养，增加可使用细胞量。
[0007]为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案:
[0008]一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置，包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地复合在所述基底上；
[0009]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；
[0010]所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m。
[0011]为了便于理解本发明所述装置的发明原理，可参见图1，需要说明的是，本发明附图不对其中的形状、尺寸、材质进行限定，其只是为了便于在本发明权利要求描述的基础上理解本发明装置核心技术，本领域技术人员能够在本发明附图的基础上，合理预料到本发明限定的各种形状、尺寸和材质的其他不脱离本发明发明原理的装置。
[0012]针对现有专利201010105018.X基于微流控技术建立的在玻璃表面研究多种细胞相互作用的装置的缺陷，本发明以成本低廉、简单易操作的新型细胞共培养装置，解决了其接种细胞均匀性不易控制、两种细胞接种间隔时间短，可使用细胞量较少的问题，尤其适用于神经元与神经胶质细胞有序共培养。
[0013]本发明提供的用于神经元与神经胶质细胞有序培养的装置包括基底，所述基底优选具有平整表面，以便与聚二甲基硅氧烷印章紧密结合，防止漏液。所述基底可以为任意能够用于培养细胞的盖玻片、载玻片、细胞培养皿等，本发明对此并无特殊限制。所述基底表面可以孵育有细胞外基质，也可以在使用时，即用于神经元与神经胶质细胞培养时再孵育细胞外基质。作为优选，所述细胞外基质为多聚赖氨酸，更优选为左旋多聚赖氨酸。
[0014]所述基底上可移除地复合有聚二甲基硅氧烷印章，即聚二甲基硅氧烷印章可从基底上移除。所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距离为 500 μ m ~2000 μ m。
[0015]作为优选，所述聚二甲基硅氧烷为(CH3O)3Si(CH2)CN(OCH2OCH2)nCH3或(CH3CH2O)3Si (CH2) CN(OCH2OCH2)nCH3,其中，η 为 3、6、17 或 100。
[0016]作为优选，所述聚二甲基硅氧烷印章为带有微通孔的六面体，如正方体或长方体，其长宽高规格可根据实际试验的需要具体制定，本发明不做具体限定。
[0017]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔。第一通孔和第二通孔依次排列，且分别垂直于基底，即通孔是竖直通孔。本发明所述第一通孔和第二通孔的横截面可以为任何适宜的形状，作为优选，所述第一通孔和第二通孔的横截面均为长方形。更优选地，所述第一通孔的长为1.0cm~2.0cm,宽为0.5cm~2.0cm,其高度(或称为厚度、深度)视聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)确定；并列更优选地，所述第二通孔的长为1.0cm~2.0cm,宽为0.5cm~2.0cm,其高度(或称为厚度、深度)视聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)确定。作为优选，所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m,更优选为1000 μ m~1500 μ m。
[0018]作为优选，所述微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔。第三通孔的横截面优选为长方形，更优选的，所述第三通孔的长为1.0cm~2.0cm,宽为0.5cm~2.0cm,其高度(或称为厚度、深度)视聚二甲基硅氧烷印章高度(或厚度或深度)确定。所述第三通孔与所述第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m,更优选为1000 μ m~1500 μ m。
[0019]所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，可以根据聚二甲基硅氧烷印章的大小以及使用需要包含两个、三个甚至十个微孔单元；所述各微孔单元之间的距离优选为2.0cm~3.0cm。所述微孔单元包括至少一个第一通孔和至少一个第二通孔,可以使用需要包含两个、三个甚至十个通孔。
[0020]聚二甲基硅氧烷印章复合于基底上时，第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽，即基底将第一通孔和第二通孔的一端封端。
[0021]本发明还提供了一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置的制备方法，包括:
[0022]制备聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m ；
[0023]将所述聚二甲基硅氧烷印章贴附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽。
[0024]本发明首先制备聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章与上述技术方案中相同，本发明在此不再赘述。
[0025]作为优选，所述聚二甲基硅氧烷印章按照以下方法制备:
[0026]采用微机械加工技术在模板上制备至少一个凹形线型微结构单元，所述凹形线型微结构单元包含依次排列的、至少一个第一凹形条和至少一个第二凹型条，所述第一凹型条和第二凹型条的距离为500 μ m~2000 μ m ；
[0027]用聚二甲基硅氧烷对所述模板上的凹形线型微结构单元进行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷I旲板；
[0028]去除所述聚二甲基硅氧烷模板上第一凹型条和第二凹型条的底面，得到聚二甲基硅氧烷印章。
[0029]首先采用微机械加工技术在模板上制备至少一个凹形线型微结构单元，所述凹形线型微结构单元包含依次排列的、至少一个第一凹形条和至少一个第二凹型条，所述第一凹型条和第二凹型条的距离为500μπι~2000μπι。在本发明中，所述第一凹型条的横截面为长方形，长为1.0~2.0cm,宽为0.5~2.0cm ;所述第二凹型条的横截面为长方形，长为1.0~2.0cm,宽为0.5~2.0cm0所述第一凹型条和第二凹型条的距离为500 μ m~2000 μ m，优选为100ym~1500 μ m。本发明对所述第一凹型条和第二凹型条的高度没有特殊限制，可以根据需要自行选择。
[0030]然后用聚二甲基硅氧烷对所述模板上的凹形线型微结构单元进行二次翻膜，第一步翻模得到凸型条，第二翻模得到凹形槽；经过二次翻模后，得到聚二甲基硅氧烷模板，聚二甲基硅氧烷模板与初始模板结构相同，即包括至少一个凹形线型微结构单元，所述凹形线型微结构单元包含依次排列的、至少一个第一凹形条和至少一个第二凹型条，所述第一凹型条和第二凹型条的距离为500 μ m~2000 μ m。
[0031]得到聚二甲基硅氧烷模板后，去除第一凹型条和第二凹型条的底面，使第一凹型条和第二凹形条成为通孔，即可得到聚二甲基硅氧烷印章。
[0032]作为优选，在模板上制备凹形线型微结构单元时，所述凹形线型微结构单元包括与第一凹型条和第二凹型条依次排列的第三凹型条，经过二次翻模、去除底面后得到的聚二甲基硅氧烷印章上包括第三通孔。对此，本领域技术人员可以参照上文所述，本发明在此不再赘述。
[0033]得到述聚二甲基硅氧烷印章后，将其贴附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽，即可得到用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置。其中，所述基底表面优选孵育有细胞外基质，方法如下:
[0034]将基底表面进行预处理；
[0035]向预处理后的基底表面滴加细胞外基质进行孵育。
[0036]首先用飞虎酸溶液(浓硫酸:双氧水=3:1)浸泡玻璃类基底，浸泡时间为20~60min ;然后用双蒸水洗涤至中性，干燥后即完成对基底的处理。
[0037]然后向基底表面滴加细胞外基质，所述细胞外基质的浓度优选为0.1%，孵育
0.5h~lh，将剩余溶液吸去，再用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤I~3次，晾干即可。
[0038]本发明还提供了一种神经元细胞与胶质细胞有序共培养的方法，包括:
[0039]在基底上孵育细胞外基质；
[0040]将聚二甲基硅氧烷印章连接在孵育有细胞外基质的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距离为500μπι-2000μπι ;
[0041]分别向所述第二通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液和第一通孔中加入神经元原代细胞悬浮液，进行培养；
[0042]待两种细胞粘附于基底后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将表面粘附有神经胶质细胞和神经元细胞的基底浸泡于两种细胞混合培养基中，进行神经胶质细胞和神经元细胞的共培养。
[0043]本发明首先在基底上孵育细胞外基质，方法如上文所述，本发明在此不再赘述。
[0044]然后将聚二甲基硅氧烷印章连接在孵育有细胞外基质的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章的结构及其制备方法如上文所述，本发明在此不再赘述。
[0045]本发明分别向所述第二通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液和第一通孔中加入神经元原代细胞悬浮液，进行培养；待两种细胞粘附于基底后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将有序粘附于同一基底的神经胶质细胞和神经元细胞进行共培养。
[0046]本发明首先将神经胶质细胞和神经元细胞设置在各自独立的凹槽中分别培养，此时，神经胶质细胞和神经元细胞分别在各自限定的区域内生长，待其分别粘附在基底上后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将基底上的神经胶质细胞和神经元细胞进行共培养，实现神经胶质细胞和神经元细胞的有序生长。在本发明中，神经胶质细胞和神经元细胞的接种间隔可以为Imin~10天，当神经胶质细胞和神经元细胞接种间隔时间较长，例如超过Ih时，接种神经胶质细胞后，为防止污染、防止细胞死亡，优选进行第一步培养，即将其放入培养箱中进行培养至神经胶质细胞粘附在基底表面；然后再接种神经元细胞进行第二步培养，即再次将其放入培养箱中进行培养至神经元细胞粘附在基底表面。作为优选，本发明首先加入神经胶质细胞悬浮溶液，进行第一步培养至神经胶质细胞粘附在基底表面；然后加入神经元原代细胞悬浮液，进行第二步培养至神经元细胞粘附在基底表面。
[0047]具体而言，当聚二甲基硅氧烷印章上的微孔单元仅包括第一通孔和第二通孔时，培养方法如下:
[0048]向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液进行第一步培养至神经胶质细胞粘附在基底表面。其中，所述神经胶质细胞悬浮溶液的细胞密度为15~17个/mL ;第一步培养的温度为37°C，二氧化碳体积浓度为5 %，培养时间优选为0.5h~Ih0
[0049]第一步培养后，向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔中加入神经元原代细胞悬浮液进行第二步培养至神经元细胞粘附在基底表面。其中，所述神经元原代细胞悬浮溶液的细胞密度为14~16个/mL ;第二步培养的温度为37°C，二氧化碳体积浓度为5%，培养时间优选为0.5h~1.5h。
[0050]作为优选，在第一步培养和第二步培养时间可以有较大的时间间隔，如Ih~7天甚至10天等，本发明对此并无特殊限制。
[0051]第二步培养后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将表面粘附有神经胶质细胞和神经元细胞的基底浸泡于两种细胞混合培养基中，进行神经胶质细胞和神经元细胞的共培养，即可使神经胶质细胞和神经元细胞有序生长。在共培养过程中，神经胶质细胞和神经元细胞首先在各自限定区域内生长，完成两种细胞有序粘附在同一基底上；然后，神经胶质细胞向神经元细胞方向移动，神经元细胞向各个方向生长出突出，其突出与胶质细胞接触形成神经胶质细胞和神经元细胞接触的界面，可以用于研究二者的相互作用。在共培养中，培养基为体积比为1:1的两种细胞培养基的混合培养基，其中，两种细胞培养基分别为:含有2%(体积比)神经营养因子B27的Neurobasal培养基和含有10%血清的DMEM/F12培养基。所述共培养的温度为37°C，二氧化碳体积浓度为5%，本发明对所述共培养的时间没有特殊要求，根据需要控制即可。
[0052]当聚二甲基硅氧烷印章上的微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔时，其培养方法如下:
[0053]向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液进行第一步培养至神经胶质细胞粘附在基底表面；
[0054]第一步培养后，向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔和第三通孔中加入神经元原代细胞悬浮液进行第二步培养至神经元细胞粘附在基底表面；
[0055]第二步培养后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将表面粘附有神经胶质细胞和神经元细胞的基底进行共培养，即可使神经胶质细胞和神经元细胞有序生长。
[0056]也可以按照以下方法进行培养:
[0057]当聚二甲基硅氧烷印章上的微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔时，其培养方法如下:
[0058]向聚二甲基硅氧烷印章的第一通孔和第三通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液进行第一步培养至神经胶质细胞粘附在基底表面；
[0059] 第一步培养后，向聚二甲基硅氧烷印章的第二通孔中加入神经元原代细胞悬浮液进行第二步培养至神经元细胞粘附在基底表面；
[0060]第二步培养后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将表面粘附有神经胶质细胞和神经元细胞的基底进行共培养，即可使神经胶质细胞和神经元细胞有序生长。
[0061]本发明通过垂直于基底的第一通孔和第二通孔接种神经元细胞和神经胶质细胞，两种细胞在各自区域接种时均匀性易于控制，可使用的细胞量增大，群体效应明显，利于观察研究。更重要的是，神经元细胞和神经胶质细胞的接种时间间隔可以延长至数天，从而更有利于在同一平面上获得较大面积的神经元细胞和神经胶质细胞的接触界面，更有利于研究两种细胞间的相互作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0062]图1所示为本发明所述装置示意图；
[0063]图2为本发明提供的神经元细胞与胶质细胞生长的界面。
【具体实施方式】
[0064]本发明公开了一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述装置、制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0065]实施例1
[0066]I)取3*3厘米盖玻片，表面首先用飞虎酸溶液(浓硫酸:双氧水=3:1)浸泡40分钟，然后用双蒸水清洗至中性，干燥，在其表面滴加0.8毫升0.1 %的多聚赖氨酸，孵育1.0小时，将剩余溶液吸去，在用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，晾干，待用；
[0067]2)使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备一组凹型线型微结构单元，该凹型线型微结构单元由从左至右依次排列的两个凹槽组成，其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.0厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.0厘米，宽度为1.0厘米；左侧凹槽与右侧凹槽间距离为2000微米；
[0068]3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有一组凹型线型微结构单元的有机玻璃板进行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，该聚二甲基硅氧烷模板下表面上有微凹槽单元，该微凹槽单元由从左至右依次排列的两条凹槽组成；其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.0厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.0厘米，宽度为1.0厘米；左侧凹槽与右侧凹槽间距离为2000微米；
[0069]分别去除两条凹槽的底面，形成两个横截面为长方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章，其中，所述左侧通孔长度为1.0厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧通孔长度为1.0厘米，宽度为1.0厘米；所述两条微孔洞之间的间距为2000微米；所述两个通孔构成微孔单元，所述微孔单元的长度为2.0厘米，宽度为2.8厘米；
[0070]然后把聚二甲基硅氧烷印章高压消毒；
[0071]4)将步骤3)经高压消毒后的无菌聚二甲基硅氧烷印章与步骤I)所述玻璃基底进行接触性连接，使左侧通孔和右侧通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；
[0072]5)制备胶质细胞的悬浮溶液，细胞密度为16个/ml，然后把胶质细胞滴加入右侧凹槽中；
[0073]6)制备神经元的原代细胞悬浮液，细胞密度为15个/ml ;把神经元细胞滴加入步骤5)装置的左侧凹槽中，注意用移液器将细胞吹散，使神经元细胞均匀分布，左侧凹槽加入神经元细胞培养基，并注意使其不与胶质细胞培养基混合，装置放入细胞培养箱，在37°C，二氧化碳体积浓度5%，培养I小时，使神经元细胞粘附在基底上；
[0074]7)待胶质细胞和神经元细胞完全粘附于基底后，揭掉聚二甲基硅氧烷印章，加入体积比1:1混合的两种细胞培养液，在37°c，二氧化碳体积浓度5%的细胞培养箱中进行两种细胞共培养，其中，两种细胞培养液分别为:含有2% (体积比)神经营养因子B27的Neurobasal培养基和含有10%血清的DMEM/F12培养基，两种细胞首先在各自限定区域内生长，实现两种细胞有序粘附于同一基底上；
[0075]然后，胶质细胞开始向神经元细胞方向移动，神经元细胞向各个方向生长出突处，其突处与胶质接触形成两种细胞接触长度不小于1.0厘米的界面，可以用于观察神经元与胶质细胞相互作用的研究，参见图2，图2为本发明提供的神经元细胞与胶质细胞生长的界面。由图2可知，本发明提供的方法获得的神经元细胞与胶质细胞有序生长状态良好。
[0076]实施例2
[0077]I)取直径25毫米的细胞培养皿，在其底面滴加1.0毫升0.1 %的左旋多聚赖氨酸，孵育1.0小时,将剩余溶液吸去,在用磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤3次，晾干,待用；
[0078]2)使用微机械加工技术，在一有机玻璃板上制备至少一组凹型线型微结构单元，该凹型线型微结构单元由从左至右依次排列的三个凹槽组成；其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述中间凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为1.1厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；左侧凹槽和中间凹槽、中间凹槽和右侧凹槽的距离均为1000微米；
[0079]3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有至少一组凹型线型微结构单元的有机玻璃板进行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，该聚二甲基硅氧烷印章下表面上有微凹槽单元，该微凹槽单元由从左至右依次排列的三条凹槽组成:其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述中间凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为1.1厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；左侧凹槽和中间凹槽、中间凹槽和右侧凹槽的距离均为1000微米；
[0080]分别去除所述三条凹槽的底面，形成三个横截面为长方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章；其中，所述左侧通孔的长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述中间通孔的长度为1.8厘米，宽度为1.1厘米；所述右侧通孔的长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；第一通孔和第二通孔、第二通孔和第三通孔间的距离均为1000微米；所述三个通孔构成微孔单元，所述微孔单元的长度为2.0厘米，宽度为2.3厘米；
[0081]然后把聚二甲基硅氧烷印章高压消毒；
[0082]4)将步骤3)经高压消毒后的无菌聚二甲基硅氧烷印章与步骤I)所述玻璃基底进行接触并紧密连接，使左侧通孔、中间通孔和右侧通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；
[0083]5)制备胶质细胞的悬浮溶液，细胞密度为16个/ml，然后把胶质细胞滴加入中间通孔中，注意用移液器将细胞吹散，使胶质细胞均匀分布，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的培养箱中培养，使胶质细胞粘附在基底上，每天使用胶质细胞培养基换液一次；
[0084]6)制备神经元的原代细胞悬浮液，细胞密度为15个/ml，第一步培养间隔2天后把神经元细胞滴加入左右两侧通孔中，注意用移液器将细胞吹散，使神经元细胞均匀分布，两侧凹槽加入神经元细胞培养基，并注意使其不与胶质细胞培养基混合，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的细胞培养箱中培养I小时，使神经元细胞粘附在基底上；
[0085]7)揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将粘附有神经元和胶质细胞的培养皿中加入体积比I: I混合的两种细胞培养基，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的细胞培养箱中进行两种细胞共培养，其中，两种细胞培养液分别为:含有2% (体积比)神经营养因子B27的Neurobasal培养基和含有10%血清的DMEM/F12培养基，细胞首先在各自限定区域内生长，完成两种细胞有序粘附于同一基底上；
[0086]然后，胶质细胞开始向两侧神经元细胞方向移动，两侧神经元细胞向各个方向生长出突处，其突处与中间条带的胶质接触形成两条两种细胞接触长度不小于1.8厘米的界面。
[0087]实施例3
[0088]I)取直径25毫米细胞培养皿，在其底面滴加1.0毫升0.1 %的多聚赖氨酸，孵育1.0小时，将剩余溶液吸去，在用磷酸盐缓冲液(PH7.4)洗涤3次，晾干，待用；
[0089]2)使用微机械加工技术，在有机玻璃板上制备至少一组凹型线型微结构单元，该凹型线型微结构单元由从左至右依次排列的三个凹槽组成；其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；所述中间凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；左侧凹槽和中间凹槽、中间凹槽和右侧凹槽的距离均为500微米；
[0090]3)用聚二甲基硅氧烷对步骤2)得到的具有至少一组凹型线型微结构单元的有机玻璃板进行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板，该聚二甲基硅氧烷印章下表面上有微凹槽单元，该微凹槽单元由从左至右依次排列的两条凹槽组成；其中，所述左侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；所述中间凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧凹槽的横截面为长方形，长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；左侧凹槽和中间凹槽、中间凹槽和右侧凹槽的距离均为500微米；
[0091]去除所述三条凹槽的底面，形成三个横截面为长方形的通孔，得到聚二甲基硅氧烷印章；其中所述左侧通孔的长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；所述中间通孔的长度为
1.8厘米，宽度为0.5厘米；所述右侧通孔的长度为1.8厘米，宽度为0.8厘米；左侧通孔和中间通孔、中间通孔和右侧通孔的距离均为500微米；所述三个通孔构成微孔单元，所述微孔单元的长度为1.8厘米，宽度2.2厘米；
[0092]然后把聚二甲基硅氧烷印章高压消毒；
[0093]4)将步骤3)经高压消毒后的无菌聚二甲基硅氧烷印章与步骤I)所述玻璃基底进行接触性连接，使左侧通孔、中间通孔和右侧通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；
[0094]5)制备胶质细胞的悬浮溶液，细胞密度为16个/ml，然后把胶质细胞滴加入左右两侧通孔中，注意用移液器将细胞吹散，使胶质细胞均匀分布，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的培养箱中培养，使胶质细胞粘附在基底上，每天使用胶质细胞培养基换液一次；；
[0095]6)制备神经元的原代细胞悬浮液，细胞密度为15个/ml，第一步培养间隔5天后把神经元细胞滴加入中间微凹槽中，注意用移液器将细胞吹散，使神经元细胞均匀分布，两侧凹槽加入神经元细胞培养基，并注意使其不与胶质细胞培养基混合，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的细胞培养箱中培养I小时，使神经元细胞粘附在基底上；
[0096]7)揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将粘附有神经元和胶质细胞的培养皿中加入体积比I: I混合的两种细胞培养基，在37°C，二氧化碳体积浓度5%的细胞培养箱中进行两种细胞共培养，其中，两种细胞培养液分别为:含有2% (体积比)神经营养因子B27的Neurobasal培养基和含有10%血清的DMEM/F12培养基，细胞首先在各自限定区域内生长，完成两种细胞有序粘附于同一基底上；
[0097]然后，胶质细胞开始向神经元细胞方向移动，神经元细胞向各个方向生长出突处，其突处与胶质接触形成两条两种细胞接触长度不小于1.8厘米的界面。
[0098]比较例I
[0099]按照中国专利CN201010105018.X中实施例1步骤I~6公开的方法制备用于细胞有序共培养的装置，然后分别制备细胞密度为16个/ml的胶质细胞的悬浮溶液和细胞密度为15个/ml的神经元细胞悬浮液，分别加入第二条微流孔道和第五条微流孔道，将装置置于细胞培养箱中，37°C、二氧化碳体积浓度5%的条件下培养Ih ；
[0100]揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有神经元和胶质细胞的玻璃表面放入体积比1:1混合的两种细胞培养液中，实验结果表明，在第二条孔道的出口和入口处胶质细胞密集堆积，在第二条孔道中间部位胶质细胞比较稀疏，并且细胞分布不够均匀；在第五条孔道的出口和入口处神经元细胞密集堆积，在第五条孔道中间部位胶质细胞比较稀疏，并且细胞分布不够均匀。
[0101]比较例2
[0102]按照中国专利CN201010105018.X中实施例1步骤I~6公开的方法制备用于细胞有序共培养的装置，然后分别制备细胞密度为16个/ml的胶质细胞的悬浮溶液加入第二条微流孔道后将装置置于细胞培养箱中进行第一步培养，37°C、二氧化碳体积浓度5%的条件下培养每天换液4-5次；培养胶质细胞2天后，将神经元细胞加入到第五条微流孔道，置于细胞培养箱中37°C、二氧化碳体积浓度5%的条件下Ih ；
[0103]揭掉聚二甲基硅氧烷印章，将生长有神经元和胶质细胞的玻璃表面放入体积比I: I混合的两种细胞培养液中，结果表明，胶质细胞生长状态不好，显微镜下观察到胶质细胞不够透明，细胞质内容物较多，趋于凋亡。
[0104]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置，其特征在于，包括基底和聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章可移除地复合在所述基底上； 所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽； 所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述第三通孔与所述第二通孔的距离为500 μ m ~2000 μ mD
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一通孔和第二通孔的横截面为长方形。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于，所述第一通孔横截面的长为1.0cm~2.0cm,宽为 0.5cm ~2.0cm ； 所述第二通孔横截面的长为1.0cm~2.0cm,宽为0.5cm~2.0cm。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述基底表面孵育有细胞外基质。
7.一种用于神经元与神经胶质细胞有序共培养的装置的制备方法，包括: 制备聚二甲基硅氧烷印章，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m~2000 μ m ； 将所述聚二甲基硅氧烷印章贴附于基底表面，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷印章按照以下方法制备: 采用微机械加工技术在模板上制备至少一个凹形线型微结构单元，所述凹形线型微结构单元包含依次排列的、至少一个第一凹形条和至少一个第二凹型条，所述第一凹型条和第二凹型条的距离为500 μ m~2000 μ m ； 用聚二甲基硅氧烷对所述模板上的凹形线型微结构单元进行二次翻膜，得到聚二甲基硅氧烷模板； 去除所述聚二甲基硅氧烷模板上第一凹型条和第二凹型条的底面，得到聚二甲基硅氧烷印章。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一凹型条的横截面为长方形，长为1.0~2.0cm,宽为0.5~2.0cm ;所述第二凹型条的横截面为长方形,长为1.0~2.0cm,宽为 0.5 ~2.0cm。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔。
11.一种神经元细胞与胶质细胞有序共培养的方法，其特征在于，包括: 在基底上孵育细胞外基质； 将聚二甲基硅氧烷印章连接在孵育有细胞外基质的基底上，所述聚二甲基硅氧烷印章包含至少一个微孔单元，所述微孔单元包含依次排列的、至少一个垂直于所述基底的第一通孔和至少一个垂直于所述基底的第二通孔，所述第一通孔和第二通孔分别与基底表面形成一端开口的凹槽；所述第一通孔和第二通孔的距离为500 μ m-2000 μ m ； 分别向所述第二通孔中加入神经胶质细胞悬浮溶液和第一通孔中加入神经元原代细胞悬浮液，进行培养； 培养完毕后，去除聚二甲基硅氧烷印章，将表面粘附有神经胶质细胞和神经元细胞的基底进行共培养。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述微孔单元还包括与第一通孔和第二通孔依次排列的至少一个垂直于所述基底的第三通孔； 向所述第二通孔 中加入神经胶质细胞悬浮溶液和向所述第一通孔和第三通孔中加入神经元原代细胞悬浮液，进行培养。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，首先加入神经胶质细胞悬浮溶液，进行第一步培养至神经胶质细胞粘附在基底表面； 然后加入神经元原代细胞悬浮液，进行第二步培养至神经元细胞粘附在基底表面。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述神经胶质细胞悬浮溶液的细胞密度为15~17个/mL ;所述神经元原代细胞悬浮液细胞密度为14~16个/mL。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一步培养的时间为0.5h~.1.5h ;所述第二步培养的时间为0.5h~1.5h。
【文档编号】C12M3/04GK104130943SQ201410363029
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】陈振玲, 刘永锁, 王妍, 王伟, 于红燕 申请人:民航总医院, 中国民用航空局民用航空医学中心