一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的方法，属于基因工程领域。本发明针对具有特定催化性能和用途的目标脂肪酶，通过全基因组脂肪酶基因挖掘，分类、催化特性预测得到候选基因；将候选基因分别在大肠杆菌中表达，通过分别检测可溶蛋白和包涵体活性进行筛选，获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因，并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。最终获得了编码仅在包涵体状态下表现酯合成活性和甲醇解活性的脂肪酶的基因。本发明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他酶的筛选和制备也提供了有价值的参考。
【专利说明】一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪 酶基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因的 方法，尤其是一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂肪酶基因并在重组大 肠杆菌中重组表达的方法，属于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶又称三酰基甘油水解酶（EC3. 1. 1.3)，是一种广泛应用的水解酶类，能够在 水相中催化水解底物酯键，有些脂肪酶也可以在非水相中催化酯化反应和酯交换反应等。 微生物脂肪酶已被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。 目前已有数百种微生物脂肪酶报道，并且许多已经商品化，但是，由于脂肪酶种类的广泛多 样性，不同脂肪酶的催化特性，如催化活性（酯合成活性、水解活性、甲醇解活性）、底物特 异性、位置选择性、立体选择性等有着显著的差异。为满足不同行业对特定特性脂肪酶的需 求，进一步挖掘微生物脂肪酶资源，开发和制备特定活性的脂肪酶仍然具有重要的现实意 义。本发明从具有特定基因资源的微生物出发，欲采用结合生物信息学和特异性筛选技术， 基于微生物全基因组的脂肪酶基因挖掘，分类、催化特性预测的基础上，通过分别检测大肠 杆菌外源表达可溶蛋白和包涵体的不同催化特性的筛选技术，获得具有特定特性的新型华 根霉脂肪酶基因，并在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。
[0003] 由于微生物特性和筛选方法的限制，通过传统微生物筛选方法获得特定特性脂肪 酶，进而开发新型脂肪酶基因资源的效率一般不高。近年来，现代基因组学技术为深度开发 微生物基因资源提供了可能，通过对特定微生物的全基因组测序，挖掘其中相关基因的方 法已被研究者所采用。华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC N〇:M201021是从我国传统微 生物载体--大曲中分离得到的一株丝状真菌，用于白酒生产，具有显著的催化酯化合成 和酯水解的能力，表明其含有丰富的脂肪酶，其中一种脂肪酶已被分离并克隆表达。但进一 步研究发现，一种外源表达的华根霉脂肪酶并不具有野生华根霉膜结合脂肪酶催化酯合成 的能力，表明华根霉中可能存在其他活性表现形式的脂肪酶。目前该菌株全基因组测序已 经完成（Genome Announcements, 2013, 1 (2) : e00195_12)，为进一步挖掘华根霉脂肪酶基因 资源提供了可能。现代生物信息学技术及相关软件也为脂肪酶基因资源的挖掘提供了有效 的手段。
[0004] 此外，脂肪酶的催化特性最终还是由活性测定来确定。而脂肪酶的活性测定方法 较多，常用的方法有橄榄油指示剂滴定法、对硝基苯脂肪酸酯（p-NP)法、有机相酯合成法、 甲醇水解法等。这些方法分别反映了脂肪酶的不同催化性能，而且不同方法测得的活性间 并不具有明显的对应关系。仅通过一种活性测定筛选方法，欲得到不同催化特性的新型脂 肪酶通常是比较困难的。因此，针对特定目标，有必要选择适当的活性测定方法以筛选特定 催化特性的脂肪酶。
[0005] 通常具有活性的酶，包括野生酶及外源表达酶，均为可溶性蛋白；而不溶性蛋白， 如大肠杆菌外源表达的包涵体，通常不表现出酶的活性，需复性后才可能表现相应的活性。 本发明基于华根霉基因组资源，主要针对脂肪酶催化酯合成和水解反应的不同性能，分别 对候选脂肪酶基因大肠杆菌外源表达可溶蛋白和包涵体进行不同活性检测和筛选，以获得 具有特定特性的新型华根霉脂肪酶基因，进而在重组大肠杆菌中进行活性表达制备。本发 明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他特性脂肪酶的筛 选和制备也提供了有价值的技术方案。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对脂肪酶及其催化特性的多样性，克服现有脂肪酶筛选方法针 对性不强、效率不高的问题，提供一种基于全基因组结合生物信息学特异性筛选华根霉脂 肪酶基因的方法，基于华根霉全基因组序列结合生物信息学挖掘潜在的候选脂肪酶基因， 将候选基因分别在大肠杆菌中表达，通过分别检测可溶蛋白和包涵体部分的活性进行筛 选，获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因。
[0007] 本发明的技术方案主要包括以下步骤：
[0008] (1)根据华根霉全基因组基因注释获得潜在的脂肪酶和酯酶基因，并对脂肪酶和 酯酶进行分类，选择已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，与所得华根霉基因组中潜在 的脂肪酶和酯酶基因进行同源性比对，选择同源性较高的脂肪酶或酯酶基因，预测其催化 特性，作为候选基因；
[0009] (2)将候选基因建立脂肪酶基因文库，在大肠杆菌中表达，分别检测可溶蛋白和包 涵体的不同催化特性，筛选获得具有特定催化特性的华根霉脂肪酶基因。
[0010] 本发明技术方案还可以包括将筛选获得的具有特定特性的华根霉脂肪酶基因在 重组大肠杆菌中进行活性表达，制备相应酶制剂。具体地，是根据大肠杆菌表达的蛋白活性 形式，分别对可溶蛋白或不可溶蛋白（包涵体）进行处理，制备相应酶制剂。
[0011] 步骤（1)所述具有特定功能的华根霉，是从我国传统微生物载体一大曲中分离 得到的一株丝状真菌华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021。该菌株用于白酒生 产，具有显著的催化酯化合成和酯水解的能力，可产多种脂肪酶。其全基因组已测序完成， 参见文献 Genome Announcements, 2013, 1 (2) : e00195_12,基因注释参见 http: //genome. igi. doe. gov/Rhichl/Rhichl. home, html〇
[0012] 步骤（1)所述采用生物信息学技术进行脂肪酶基因筛选及催化特性预测，优选根 据基因注释获得所有潜在的脂肪酶和酯酶基因，并利用生物信息学工具进行脂肪酶和酯酶 的分类；选择已知的具有特定催化特性的脂肪酶的基因，与华根霉基因组中潜在的脂肪酶 和酯酶基因进行同源性比对，选择确定同源性较高的脂肪酶或酯酶基因，预测其催化特性， 建立脂肪酶候选基因库。
[0013] 所述已知的具有特定催化特性的脂肪酶可以是用于生物柴油合成的米根霉脂 肪酶（Rhizopus oryzae Lipase, R0L)和/或用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪 酶B(Candida antarctica Lipase B，CALB)和/或用于食品加工的尖孢镰刀菌脂肪酶 (Fusarium oxysporum Lipase, F0L、F0L1)等。
[0014] 步骤（2)优选以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体。
[0015] 步骤（2)所述分别检测可溶蛋白和包涵体的不同催化特性，是根据脂肪酶不同的 催化特性和用途，采用不同的脂肪酶活性测定方法，如橄榄油指示剂滴定法测定脂肪酶水 解活性（参考国家标准GBT23535-2009脂肪酶制剂）、有机相酯合成法测定脂肪酶合成活性 (参考 Bioprocess and Biosystems Engineering, 2007, 30 (3) :147-155 中描述的方法）、 甲醇水解法测定脂肪酶甲醇解活性（参考Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101(4) :328-333中描述的方法）。检测对象同时包括重组大肠杆菌可溶和不可溶蛋 白（包涵体）表达产物。
[0016] 本发明要解决的第二个技术问题是提供两个应用上述方法筛选得到的华根霉脂 肪酶基因，核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所示。
[0017] 所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的基因（A06672)编码的脂肪酶，以大肠杆 菌BL21(DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体时，表达得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水 解活性^2U/mg)和较低的合成活性（0.029U/mg)，包涵体部分则同时具有脂肪酶水解活性 (108U/mg)、合成活性（0.42U/mg)和甲醇解活性（201.7U/mg)。
[0018] 进一步地，所述包涵体的获得方法优选将带有目的基因的pET-22b转化E. coli BL21 (DE3)，将阳性转化子单菌落接入含Amp抗性的5mlLB液体培养基的试管中，于 37 °C 200rpm培养3-4个小时作为种子液；向1LLB液体培养基中加入3试管种子液， 37°C 200rpm培养4-5个小时，加入IPTG至终浓度0. 4mmol/L进行诱导，28°C 180rpm诱导 3-5小时，离心收集菌体，在适当的缓冲液中超声破碎，离心后沉淀即为包涵体蛋白。所得包 涵体可直接作为催化非水相酯合成或醇解反应的脂肪酶使用。
[0019] 所述核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示的基因（A07506)编码的脂肪酶，以大肠杆 菌BL21(DE3)为宿主，以pET-22b为表达载体时，表达得到的可溶性蛋白部分具有脂肪酶水 解活性（201U/mg)和较低的合成活性（0.015U/mg)，包涵体部分则也具有脂肪酶水解活性 (78U/mg)和较低的合成活性（0.042U/mg)与甲醇解活性（19.0U/mg)。
[0020] 进一步地，所述可溶性蛋白的获得方法优选将带有目的基因的pET-22b转化 E. coli BL21 (DE3)，将阳性转化子单菌落接入含Amp抗性的5ml LB液体培养基的试管 中，于37°C 200rpm培养3-4个小时作为种子液，1L LB液体培养基中加入3试管种子液， 30°C 200rpm培养1小时，加入IPTG至终浓度0. 4mmol/L进行诱导，16°C 180rpm诱导2小 时，离心收集菌体，在适当的缓冲液中超声破碎，离心后得到的上清液即为脂肪酶溶液。
[0021] 本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0022] (1)本发明针对具有特定催化功能的目标脂肪酶，利用微生物全基因组数据和生 物信息学工具进行脂肪酶基因的初步筛选；根据脂肪酶的不同催化功能和用途，分别采用 不同的脂肪酶活性分析方法进行进一步筛选具有特定催化功能的脂肪酶。可有效减轻实验 工作量，针对性强，筛选效率较高。
[0023] (2)通常情况下，有活性的酶包括野生酶及外源表达酶，均为可溶性蛋白；而不溶 性蛋白，如大肠杆菌外源表达的包涵体，则不表现酶活。由于脂肪酶可以催化水相、油水界 面以及有机相（非水相）介质中的反应，因此，不溶于反应体系中的脂肪酶，例如包涵体，也 有可能表现出某些催化能力。本发明根据脂肪酶的催化功能，针对大肠杆菌外源表达时可 能出现的不同蛋白形式，包括可溶蛋白和不可溶蛋白（包涵体），均进行活性筛选分析，有 效地提高了获得目的基因及蛋白的可能性。可避免仅仅分析可溶性蛋白活性时，漏掉特定 基因编码的酶具有多种不同催化功能的情况。例如SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 2所示序 列编码的酶，在筛选过程中，如果放弃分析包涵体的不同催化活性，即使基因功能分析预测 其具有甲醇解活性，在测不到具体活性的情况下，则还是无法挖掘、确定所述酶的甲醇解活 性。而本发明通过对包涵体进行活性分析，最终确定所述酶还具有甲醇解活性，并发现在可 溶与不可溶状态下不同催化特性的活力不同。
[0024] 本发明方法将显著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因获得的效率，对于其他酶 的筛选和制备也提供了有价值的参考。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1基于华根霉全基因组的脂肪酶基因挖掘
[0026] 基于华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021 全基因组数据（GenBank 编号ANKS00000000)，通过Augustus软件与Genemark软件工具分别对测序后全基因组序 列数据进行基因预测，将预测基因序列与各数据库NR、PFAM、⑶D、KEGG、COG、SwissProt 及TrEMBL·进行比对，获得相应的功會泛注释信息(http://genome, jgi. doe. gov/Rhichl/ Rhichl. home, html)。从基因注释中共发现119个酯酶基因和123个脂肪酶基因，其中部分 基因既属于酯酶又属于脂肪酶。
[0027] 实施例2预测具有目的酶功能的脂肪酶候选基因的确定
[0028] 分别选择用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae Lipase, R0L， 氨基酸序列如GeneBank :BAG16821. 1所示），用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪 酶 B (Candida antarctica Lipase B，CALB，氨基酸序列如 NCBI UniProtKB/Swiss-Prot: P41365.1所示），用于食品加工的尖孢镰刀菌脂肪酶（Fusarium oxysporum Lipase, F0L 和F0L1氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示）作为目标酶，将华根霉基因 组中的脂肪酶和酯酶基因与目标酶基因序列进行Blast比对。在使用标准Blastp比对过 程结果不理想时，使用更为灵敏的Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST,有利于发现 远亲物种的相似蛋白或某个蛋白家族的新成员。以Query cover、Score、Identities和 Positives为指标进行分析，选择最有可能的目的酶候选基因。针对各目标酶主要候选基因 及比对参数如表1所示，其中，针对米根霉脂肪酶R0L，最有可能的候选脂肪酶基因依次为 A07506、A06672 和 A03113(http://genome, jgi. doe, gov/pages/search-for-genes. isf ? organism = Rhichl)。
[0029] 表1各目标酶候选基因及比对参数
[0030]
【权利要求】
1. 一种特异性筛选脂肪酶基因的方法，其特征在于，是基于华根霉全基因组序列结合 生物信息学筛选潜在的脂肪酶基因候选基因，将候选基因分别在大肠杆菌中表达，通过分 别检测可溶蛋白和包涵体部分的不同催化活性进行筛选，获得具有特定催化性能的华根霉 脂肪酶基因。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，主要包括以下步骤： (1) 根据华根霉全基因组基因注释获得潜在的脂肪酶和酯酶基因，并对脂肪酶和酯酶 进行分类，选择已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，与所得华根霉基因组中潜在的脂 肪酶和酯酶基因进行同源性比对，选择同源性较高的脂肪酶或酯酶基因，预测其催化特性， 作为候选基因； (2) 将候选基因建立脂肪酶基因文库，在大肠杆菌中表达，分别检测可溶蛋白和包涵体 的不同催化特性，筛选获得具有特定催化性能的华根霉脂肪酶基因。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述华根霉是华根霉（Rhizopus chinensis)CCTCC No :M201021。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述已知的具有特定催化特性的脂肪酶 包括用于生物柴油合成的米根霉脂肪酶、用于非水相有机合成的南极假丝酵母脂肪酶B、用 于食品加工的尖抱鎌刀菌脂肪酶。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述分别检测可溶蛋白和包涵体 的不同催化特性，是根据脂肪酶不同的催化特性和用途，采用不同的脂肪酶活性测定方法； 包括橄榄油指示剂滴定法测定脂肪酶水解活性、有机相酯合成法测定脂肪酶合成活性、甲 醇水解法测定脂肪酶甲醇解活性。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主， 以pET-22b为表达载体。
7. 应用权利要求1所述方法筛选得到的华根霉脂肪酶基因，其特征在于，核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 或 SEQ ID NO. 2 所示。
8. 权利要求8所述基因在制备酶制剂中的应用。
【文档编号】C12N9/20GK104195151SQ201410375196
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月31日 优先权日:2014年7月31日
【发明者】王栋, 徐岩, 喻晓蔚 申请人:江南大学