高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，包括：将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转入感受态大肠杆菌细胞中；利用耐药基因分离出感受性相对较高的大肠杆菌，然后使个别的所述感受性相对较高的大肠杆菌将驯化质粒丢失，再利用负筛选基因分离出将驯化质粒丢失的大肠杆菌；使用所述驯化质粒循环往复地对所述将驯化质粒丢失的大肠杆菌进行多轮筛选，从而制备得到高感受态的大肠杆菌菌株。本发明利用同时具有正、负筛选基因的驯化质粒对细菌进行多轮筛选，最终获得可以用来制备高效感受态细菌的新菌株的方法。
【专利说明】高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学与微生物学领域，特别是涉及一种高感受态大肠杆菌菌株 的驯化筛选方法。
【背景技术】
[0002] 质粒转化大肠杆菌是基因克隆的必须步骤之一。质粒是双链环状DNA，一般包含数 千到数万个碱基对，常天然存在与细菌体内。质粒可在细菌体内以数个至数百拷个贝数存 在，并作为编码一定表现型的遗传物质随细菌的分裂增殖稳定遗传给子代细菌，在细菌群 体中稳定存在。以质粒为载体的基因克隆是遗传工程科研与生产的基本方法之一。其基本 原理是以人工改造过的质粒为载体，在体外将目的基因 DNA片段连接、插入质粒DNA之中获 得重组质粒后，再将重组质粒转化入大肠杆菌之中。利用质粒可在大肠杆菌体内复制、增殖 的特点，并利用质粒自身编码的抗性基因表型在抗生素培养基中对细菌进行筛选培养，最 终获得纯系的，携带有大量重组质粒的大肠杆菌，从而实现目标基因的克隆增殖。在此过程 中，将体外重组的质粒DNA转化入大肠杆菌是关键步骤之一。这一步骤的效率越高，基因克 隆的成功机会就越高。这一效率通常以在转化实验中使用一微克质粒DNA所能获得的大肠 杆菌克隆数（CFU)来表示。一般地，从每微克质粒DNA获得10 6CFU是获得成功转化的最低 要求。当转化效率达到1〇8至l〇9CFU每微克质粒DNA时，克隆工作即可获得稳定地成功保 障。在某些工作中，比如鸟枪法构建基因库，感受态细菌的转化效率对最终基因库的质量有 着关键的影响。只有当转化效率达到1〇 8?l〇9CFU每微克质粒DNA时，所构建的基因库才 能合格。
[0003] 大肠杆菌在自然状态下无法接受外源质粒DNA。因此，在质粒转化前必须先对大肠 杆菌进行一定的处理，使其成为易于接受外源质粒DNA的状态，即感受态大肠杆菌。
[0004] 目前科研与生产中所使用的工具大肠杆菌有多种菌株，它们的遗传背景各不相 同，生理特性也有差异，这些差异分别有利于各类科研与生产目的。这些菌株对感受态制备 方法的反应各不相同。因此，不同的制备方法对同一菌株，同一方法对不同的菌株，感受态 细菌的制备效果均有显著差异。即使对易于形成感受态的菌株，如，DH5alpha而言，只有制 备过程复杂，工艺要求教高（需要液氮）的方法才能获得较好的感受态制备效果（达到或 高于10 8CFU每微克质粒DNA)。而较简单的制备方法，如，氯化钙法，通常只能达到106CFU每 微克质粒DNA。对难于形成感受态的菌株，如，BL21，现有任何方法均不能获得很满意的感 受态制备效果。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提出一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法， 通过多轮选择性筛选的方法，获得易于制备高效感受态细菌的超级感受大肠杆菌菌株，以 提高基因克隆过程中质粒DNA对大肠杆菌的转化效率。
[0006] 基于上述目的，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法包括：
[0007] 将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转入感受态大肠杆菌细胞中；
[0008] 利用耐药基因分离出感受性相对较高的大肠杆菌，然后使个别的所述感受性相对 较高的大肠杆菌将驯化质粒丢失，再利用负筛选基因分离出将驯化质粒丢失的大肠杆菌；
[0009] 使用所述驯化质粒循环往复地对所述将驯化质粒丢失的大肠杆菌进行多轮筛选， 从而制备得到高感受态的大肠杆菌菌株。
[0010] 可选地所述驯化筛选方法包括：
[0011] 1)将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转化入感受态大肠杆菌细胞中；
[0012] 2)将转化后的菌液涂布于含有与所述驯化质粒所携带的耐药基因相应的抗生素 的LB固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；
[0013] 3)收集步骤2)中获得的菌斑，将其接种于LB液体培养基后过夜培养，使个别大肠 杆菌将驯化质粒丢失；
[0014] 4)将步骤3)中获得的菌液涂布于含有与所述负筛选基因相应的杀菌物质的LB固 体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑；
[0015] 5)收集步骤4)中获得的菌斑，制备感受态大肠杆菌；
[0016] 6)将所述携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒再次转入步骤5)的感受态大 肠杆菌细胞中，依次重复步骤2)?步骤4);
[0017] 7)将步骤5)和6)按顺序循环，直至得到高感受态的大肠杆菌菌株。
[0018] 较佳地，所述步骤1)中驯化质粒的用量为所述步骤6)中驯化质粒的用量的 500 ?2000 倍。
[0019] 优选地，所述步骤2)和步骤4)中的培养温度为30?37°C。
[0020] 较佳地，所述步骤2)中的培养温度为40?45 °C。
[0021] 优选地，所述驯化过程的循环轮数为12?16轮。
[0022] 可选地，所述大肠杆菌菌株选自DH5alpha，T0P10和BL21中的一种。
[0023] 可选地，所述驯化质粒的骨架选自pET28, pucl8和pucl9中的一种。
[0024] 可选地，所述耐药基因选自卡那霉素基因，氨苄青霉素基因，氯霉素基因和红霉素 基因中的一种。
[0025] 可选地，所述负筛选基因选自sacB基因 ，rpsL (strA)基因，tetA基因，pheS基因， thyA基因，lacy基因，gata-1基因和mazF基因中的一种。
[0026] 从上面所述可以看出，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法使用 了一正一负两个筛选基因，在利用正筛选基因分离出感受性相对较高的细菌后，利用负筛 选基因分离出将驯化质粒丢失的细菌，进而可以使用同一种驯化质粒循环往复进行多轮筛 选，使'有益'突变在存留的细菌中逐渐积累，最终获得满意的菌株。本发明利用同时具有 正、负筛选基因的驯化质粒对细菌进行多轮筛选，最终获得可以用来制备高效感受态细菌 的新菌株的方法。
【具体实施方式】
[0027] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。
[0028] 作为本发明的一个实施例，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法 包括以下步骤：
[0029] 1、将sacB基因表达片段克隆入pET28质粒中，获得用于驯化大肠杆菌感受态性能 的驯化质粒。其中，PET28质粒本身携带有卡那霉素抗性基因，即该驯化质粒携带有卡那霉 素抗性基因和来自于枯草芽孢杆菌的sacB基因。
[0030] 2、采用氯化钙法制备DH5alpha大肠杆菌感受态细菌，形成浓度约为109CFU/mL的 感受态细菌悬浊液。
[0031] 具体地，所述感受态大肠杆菌的制备过程如下：
[0032] (1)从37°C培养16?20小时的大肠杆菌固体培养平皿中挑取一个单菌落（直径 2?3mm)，接种于一个含有100ml LB培养基的1L三角烧瓶中。于37°C剧烈振摇培养，直至 600nm波长下光密度值达0. 6 (通常需3小时左右）。
[0033] (2)在无菌条件下将细菌转移到两个无菌的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分 钟。
[0034] (3)于4°C用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分 钟，以回收细菌。
[0035] (4)倾弃上清培养液，将离心管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。
[0036] (5)以10ml用冰预冷的0. 1M氯化钙水溶液重悬每份沉淀，放置于冰浴上。
[0037] (6)于4°C以4000转/分离心10分钟，以回收细菌。
[0038] (7)倾弃上清，将离心管倒置1分钟以使最后残留的痕量氯化钙溶液流尽。
[0039] (8)每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0. 1M氯化钙水溶液重悬细菌沉淀，即成 为感受态大肠杆囷。
[0040] 3、以42°C热击的方法将1微克驯化质粒转化入上述感受态大肠杆菌细胞中。优选 地，1微克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0041] 具体地，所述感受态大肠杆菌质粒转化的过程如下：
[0042] (1)用无菌吸头吸取200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液，转移到于冰上预冷的无菌的 1.5ml微量离心管中。
[0043] (2)加入2 μ L的DNA溶液（事先调整溶液浓度，使DNA总量为1微克），轻轻旋转 以混匀内容物，在冰中放置30分钟。
[0044] (3)将离心管放入42°C的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动离心管。
[0045] (4)快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却1?2分钟。
[0046] (5)每个离心管中加入冰上预冷的800 μ L的LB培养基。
[0047] (6)将离心管转移到37°C摇床上，温育45分钟。
[0048] (7)取100 μ L温育后的菌液，加入900 μ L的LB液体培养基中进行（10倍）系列 稀释，稀释度从10至1〇3。
[0049] (8)取100 μ L稀释度103感受态大肠杆菌悬液均匀涂布于含有100 μ g/ml卡那霉 素的LB固体培养基（平皿）表面。
[0050] (9)倒置平皿，于37°C培养16小时，平皿上出现的菌落即为获得质粒转化的大肠 杆菌。转化效率（CFU/1 μ g质粒）=(平皿表面菌落计数X 104) /加入DNA总量（μ g)
[0051] 需要说明的是，在步骤（7)中稀释的目的是为了在步骤（9)的平皿上获得互不接 触，且数目适中，便于计数的克隆菌斑。一般而言，在一个直径9厘米的平皿上长出50? 300个菌斑是最合适的。如果在步骤（6)后不经稀释，把菌液直接涂到平皿上，即使在低转 化效率下（1〇6)，也会长出大量菌斑，甚至菌斑之间互相接触，成了菌膜。这样，即无法达成 获得纯系克隆目的，也无法正确计数菌斑数目以推算转化效率。在实际操作中，如果事先难 以估计转化效率，也就难以确定合适的稀释度，就将多个稀释度的菌液分别涂到平皿上，哪 个平皿上长出的菌斑数目合适就选用哪个。
[0052] 4、将转化后的大肠杆菌菌液涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基表面，然后置 37°C温箱中过夜培养。此时，因细菌的感受态性能较差，只有部分细菌在经过制备后能够成 为感受态细菌并在随后的热击转化中获得驯化质粒。而且，只有获得了驯化质粒的细菌才 能在含有卡那霉素的LB固体培养基表面存活、生长，经37°C过夜培养后形成菌斑。未能成 为感受态细菌，无法获得驯化质粒的细菌则被培养基中的卡那霉素杀灭。
[0053] 5、用细菌接种环收集由步骤4中获得的菌斑，将其接种于10mL的LB液体培养基 后于42°C振摇过夜培养。此时，接种于液体培养基中的全部细菌中都携有驯化质粒。驯化 质粒在大肠杆菌的最适生长温度37°C下可以很稳定地随细菌一起分裂增殖。但在42°C下 其稳定性会有所下降，导致个别细菌将驯化质粒丢失。
[0054] 6、将100uL从步骤5中获得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固体培养基表面，然 后置37°C温箱中过夜培养。此时，绝大部分细菌中仍携带有驯化质粒，这些细菌对蔗糖敏 感，无法在含有蔗糖的固体培养基表面存活生长，只有极少数将驯化质粒丢失的细菌可以 生长，并在过夜培养后形成菌斑。
[0055] 7、收集由步骤6中获得的菌斑，采用氯化钙法制备由步骤6得到的细菌的感受态 细菌，并形成浓度约为l〇 9CFU/毫升的感受态细菌悬浊液。具体操作过程可以与上述步骤2 相同。
[0056] 8、按步骤3的方法，将1纳克驯化质粒再次转化入步骤7的大肠杆菌之中。大幅 减少转化时驯化质粒的用量，使得只有感受性相对较好的细菌才能够获得驯化质粒。优选 地，1纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0057] 9、重复步骤4至步骤6。
[0058] 10、将步骤7、8、4、5、6按顺序循环重复，直至获得满意的转化效率的菌株。从第二 轮驯化起，均是1纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。在本实施例中，可以 经15轮驯化，也可以经13轮驯化。
[0059] 在没有获得该驯化质粒时，大肠杆菌的相关表现型为卡那霉素敏感且蔗糖耐受。 一旦获得该驯化质粒，则大肠杆菌的相关表现型改变为卡那霉素耐受且蔗糖敏感。当大肠 杆菌将该质粒丢失后，则又恢复卡那霉素敏感且蔗糖耐受的表现型。本发明利用该驯化质 粒作为工具，即可将"易于接受质粒转化"这一特性作为人工筛选条件，对大肠杆菌进行多 轮选择性筛选，最终获得感受态性能非常优良的变异型菌株。
[0060] 需要说明的是，也可以将上述大肠杆菌DH5alpha菌株替换为大肠杆菌Τ0Ρ10菌株 或者大肠杆菌BL21菌株，其他步骤同上述实施例。
[0061] 作为本发明的另一个实施例，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方 法包括以下步骤：
[0062] 1、将sacB基因表达片段克隆入pucl8质粒中，获得用于驯化大肠杆菌感受态性能 的驯化质粒。其中，pucl8质粒本身携带有氨苄青霉素抗性基因，即该驯化质粒携带有氨苄 青霉素抗性基因和来自于枯草芽孢杆菌的sacB基因。
[0063] 2、采用氯化钙法制备DH5alpha大肠杆菌感受态细菌，形成浓度约为109CFU/mL的 感受态细菌悬浊液。
[0064] 3、以42°C热击的方法将1. 1微克驯化质粒转化入上述感受态大肠杆菌细胞中。优 选地，1. 1微克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0065] 4、将转化后的大肠杆菌菌液涂布于含有氨节青霉素的LB固体培养基表面，然后 置35°C温箱中过夜培养。此时，因细菌的感受态性能较差，只有部分细菌在经过制备后能够 成为感受态细菌并在随后的热击转化中获得驯化质粒。而且，只有获得了驯化质粒的细菌 才能在含有氨节青霉素的LB固体培养基表面存活、生长，经35°C过夜培养后形成菌斑。未 能成为感受态细菌，无法获得驯化质粒的细菌则被培养基中的氨苄青霉素杀灭。
[0066] 5、用细菌接种环收集由步骤4中获得的菌斑，将其接种于10mL的LB液体培养基 后于44°C振摇过夜培养。此时，接种于液体培养基中的全部细菌中都携有驯化质粒。驯化 质粒在大肠杆菌的最适生长温度37°C下可以很稳定地随细菌一起分裂增殖。但在44°C下 其稳定性会有所下降，导致个别细菌将驯化质粒丢失。
[0067] 6、将100uL从步骤5中获得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固体培养基表面，然 后置36°C温箱中过夜培养。此时，绝大部分细菌中仍携带有驯化质粒，这些细菌对蔗糖敏 感，无法在含有蔗糖的固体培养基表面存活生长，只有极少数将驯化质粒丢失的细菌可以 生长，并在过夜培养后形成菌斑。
[0068] 7、收集由步骤6中获得的菌斑，采用氯化钙法制备由步骤6得到的细菌的感受态 细菌，并形成浓度约为l〇 9CFU/毫升的感受态细菌悬浊液。具体操作过程可以与上述步骤2 相同。
[0069] 8、按步骤3的方法，将0. 98纳克驯化质粒再次转化入步骤7的大肠杆菌之中。大 幅减少转化时驯化质粒的用量，使得只有感受性相对较好的细菌才能够获得驯化质粒。优 选地，0. 98纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0070] 9、重复步骤4至步骤6。
[0071] 10、将步骤7、8、4、5、6按顺序循环重复，直至获得满意的转化效率的菌株。从第二 轮驯化起，均是0. 98纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。在本实施例中，可 以经12轮驯化，也可以经16轮驯化。
[0072] 作为本发明的又一个实施例，本发明提供的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方 法包括以下步骤：
[0073] 1、将sacB基因表达片段克隆入pucl9质粒中，获得用于驯化大肠杆菌感受态性能 的驯化质粒。其中，pucl9质粒本身携带有氨苄青霉素抗性基因，即该驯化质粒携带有氨苄 青霉素抗性基因和来自于枯草芽孢杆菌的sacB基因。
[0074] 2、采用氯化钙法制备T0P10大肠杆菌感受态细菌，形成浓度约为109CFU/mL的感 受态细菌悬浊液。
[0075] 3、以42°C热击的方法将0. 9微克驯化质粒转化入上述感受态大肠杆菌细胞中。优 选地，〇. 9微克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0076] 4、将转化后的大肠杆菌菌液涂布于含有氨节青霉素的LB固体培养基表面，然后 置33°C温箱中过夜培养。此时，因细菌的感受态性能较差，只有部分细菌在经过制备后能够 成为感受态细菌并在随后的热击转化中获得驯化质粒。而且，只有获得了驯化质粒的细菌 才能在含有氨节青霉素的LB固体培养基表面存活、生长，经33°C过夜培养后形成菌斑。未 能成为感受态细菌，无法获得驯化质粒的细菌则被培养基中的氨苄青霉素杀灭。
[0077] 5、用细菌接种环收集由步骤4中获得的菌斑，将其接种于10mL的LB液体培养基 后于41°C振摇过夜培养。此时，接种于液体培养基中的全部细菌中都携有驯化质粒。驯化 质粒在大肠杆菌的最适生长温度33°C下可以很稳定地随细菌一起分裂增殖。但在41°C下 其稳定性会有所下降，导致个别细菌将驯化质粒丢失。
[0078] 6、将100 μ L从步骤5中获得的菌液涂布于含有5%蔗糖的LB固体培养基表面，然 后置37°C温箱中过夜培养。此时，绝大部分细菌中仍携带有驯化质粒，这些细菌对蔗糖敏 感，无法在含有蔗糖的固体培养基表面存活生长，只有极少数将驯化质粒丢失的细菌可以 生长，并在过夜培养后形成菌斑。
[0079] 7、收集由步骤6中获得的菌斑，采用氯化钙法制备由步骤6得到的细菌的感受态 细菌，并形成浓度约为l〇9CFU/毫升的感受态细菌悬浊液。具体操作过程可以与上述步骤2 相同。
[0080] 8、按步骤3的方法，将1. 1纳克驯化质粒再次转化入步骤7的大肠杆菌之中。大 幅减少转化时驯化质粒的用量，使得只有感受性相对较好的细菌才能够获得驯化质粒。优 选地，1. 1纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。
[0081] 9、重复步骤4至步骤6。
[0082] 10、将步骤7、8、4、5、6按顺序循环重复，直至获得满意的转化效率的菌株。从第二 轮驯化起，均是0. 98纳克驯化质粒对应200 μ L感受态大肠杆菌悬浊液。在本实施例中，可 以经14轮驯化，也可以经15轮驯化。
[0083] 在本发明的又一个实施例中，也可以将上述实施例中的sacB基因替换为其他负 筛选基因，例如替换外为rpsL(strA)基因，tetA基因，pheS基因，thyA基因，lacy基因和 gata-Ι基因中的一种。
[0084] tetA基因可使细菌获得四环素抗性，同时对镍离子、铬离子和高渗透压敏感。rpsL 基因会使细菌对链霉素敏感。pheS基因可导致细菌对对氯苯丙氨酸敏感。thyA基因导致细 菌对甲氧苄氨嘧啶敏感。lacY基因导致细菌对t-o-硝基苯基-B-D-半乳糖苷敏感。但野 生型大肠杆菌和多数工具菌株（包括本发明中提到的3种菌株）已携有rpsL，pheS，thyA， lacY基因（即已经对相应杀菌物质敏感），所以它们只对将相应基因敲除的特殊菌株（可 耐受相应杀菌物质）才可用作负筛选基因。
[0085] gata-Ι基因本身编码一个细菌毒性蛋白，需要在其前面加一个平时关闭，而可被 某种特定物质诱导表达的启动子（比如lac启动子）加以控制。此时，相应的诱导剂（对 lac启动子来说是IPTG)就成为'杀菌物质'。与此原理相同的还有mazF基因。本发明中 控制sacB基因表达的是其自身的启动子，无条件地持续表达。但在没有蔗糖存在时不会对 细菌造成伤害。
[0086] 大肠杆菌感受态驯化效果对比实验
[0087] 实验过程：
[0088] 1、经不同轮次驯化菌株的与（未经驯化的）初始菌株（parental strain)大肠杆 菌菌株分别制备各自的感受态大肠杆菌。
[0089] 2、42°C热击的方法将1纳克质粒DNA(卡那霉素抗性）分别转化入感受态大肠杆 菌细胞中。将转化后的感受态细菌各涂布三个平皿。以三个平皿中菌落计数的平均值计算 转化效率。实验结果如下：
[0090]
【权利要求】
1. 一种高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，包括： 将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转入感受态大肠杆菌细胞中； 利用耐药基因分离出感受性相对较高的大肠杆菌，然后使个别的所述感受性相对较高 的大肠杆菌将驯化质粒丢失，再利用负筛选基因分离出将驯化质粒丢失的大肠杆菌； 使用所述驯化质粒循环往复地对所述将驯化质粒丢失的大肠杆菌进行多轮筛选，从而 制备得到高感受态的大肠杆菌菌株。
2. 根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 驯化筛选方法包括： 1) 将携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒转化入感受态大肠杆菌细胞中； 2) 将转化后的菌液涂布于含有与所述驯化质粒所携带的耐药基因相应的抗生素的LB 固体培养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑； 3) 收集步骤2)中获得的菌斑，将其接种于LB液体培养基后过夜培养，使个别大肠杆菌 将驯化质粒丢失； 4) 将步骤3)中获得的菌液涂布于含有与所述负筛选基因相应的杀菌物质的LB固体培 养基表面，然后置于温箱中过夜培养，形成菌斑； 5) 收集步骤4)中获得的菌斑，制备感受态大肠杆菌； 6) 将所述携带有耐药基因和负筛选基因的驯化质粒再次转入步骤5)的感受态大肠杆 菌细胞中，依次重复步骤2)?步骤4); 7) 将步骤5)和6)按顺序循环，直至得到高感受态的大肠杆菌菌株。
3. 根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 步骤1)中驯化质粒的用量为所述步骤6)中驯化质粒的用量的500?2000倍。
4. 根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 步骤2)和步骤4)中的培养温度为30?37°C。
5. 根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 步骤2)中的培养温度为40?45°C。
6. 根据权利要求2所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 驯化过程的循环轮数为12?16轮。
7. 根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 大肠杆菌菌株选自DH5alpha，T0P10和BL21中的一种。
8. 根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 驯化质粒的骨架选自pET28, pucl8和pucl9中的一种。
9. 根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 耐药基因选自卡那霉素基因，氨苄青霉素基因，氯霉素基因和红霉素基因中的一种。
10. 根据权利要求1所述的高感受态大肠杆菌菌株的驯化筛选方法，其特征在于，所述 负筛选基因选自sacB基因，rpsL(strA)基因，tetA基因，pheS基因，thyA基因，lacy基因， gata-Ι基因和mazF基因中的一种。
【文档编号】C12N15/70GK104195159SQ201410380004
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月4日 优先权日:2014年8月4日
【发明者】任军, 高芳芳 申请人:北京康为世纪生物科技有限公司