一种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法
【专利摘要】本发明冬虫夏草发酵培养【技术领域】，尤其是一种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，包括准备半连续发酵罐、培养基准备、发酵检测、浓缩菌丝体，分离发酵液和孢子、继续发酵培养步骤，通过过滤时选择膜过滤器，甚至选择选择性膜过滤，减少进入滤液的菌丝体，既能提高菌丝体的收率，降低滤液的COD，降低污水处理量，又不破坏细胞本身，保证胞内有效成分的全部回收；选择性膜过滤系统对于菌丝和孢子的分离效果好，分离出来的冬虫夏草孢子数量较大，并且环境变换温和，所以缩短了种子液的适应时间，直接进入倍增发酵过程，从而发酵周期也随之缩短16个小时左右；提高了生产效率，降低生产电耗，获得较好的效益。
【专利说明】一种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明冬虫夏草发酵培养【技术领域】，尤其是一种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续 培养方法。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草是国家二类保护植物，主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肃等省 (区）的高山草甸中，具有滋肾补肺、养心益肝、增强抗病能力的功效。但，由于冬虫夏草成 长的特殊性，变得十分的稀有和珍贵，而国内外对冬虫夏草的需求量成倍增长，价格猛增， 促使了人们过度采挖，严重的破坏了冬虫夏草自然资源，为了满足市场的需求，缓解冬虫夏 草自然资源的破坏，人工培养冬虫夏草的思路得到了开拓。当前，已经形成了对冬虫夏进行 人工培养的诸多方法，并且，深层发酵生产的冬虫夏草菌丝与天然的冬虫夏草具有相似的 成份和类同的药理作用，因此，目前普遍采用的是液体深层发酵工艺来培养冬虫夏草。
[0003] 但是，在冬虫夏草菌深层发酵工艺中，均是采用孢子与发酵液分离之后，再将孢子 作为种子液来进行下一次发酵生产，这样使得孢子种子液需要再度适应环境，可在进行孢 子与发酵液分离，通常是采用板框过滤的方式，来分离发酵液和冬虫夏草菌丝体，这样使得 进入滤液的菌丝体较多，菌丝体的收率较低，污水的处理量较大，细胞体容易被损坏，丢失 掉细胞内的部分有效成分。
[0004] 并且，冬虫夏草菌丝的生长条件较为严格、生长速度慢，使得发酵培养周期长，造 成发酵能耗大，发酵成本高，进而使得生产效率低，培养成本大。
[0005] 为此，有研究者从上述技术问题对冬虫夏草菌丝体的分离提取方法以及冬虫夏草 菌丝粉的生产方法做出了研究，如专利号为CN201210344464. 5的《一种基于膜技术提取虫 草被孢菌丝体的方法》的发明专利公开了将虫草被孢发酵液通过微滤膜处理分离得到虫草 被孢菌丝体，改变了传统虫草被孢分离所用离心方式；专利号为CN200810095732. 8的《用 膜过滤生产冬虫夏草菌丝粉的方法》公开了把发酵法生产的最终菌液用转鼓真空过滤，得 到的滤液采用膜过滤法进行过滤，过滤后的固体物经微波干燥、粉碎得冬虫夏草菌丝粉，过 滤后的滤液经浓缩、喷雾干燥后得冬虫夏草营养粉，此方法可有效回收约10?25%的冬虫 夏草菌丝，它减少了很大浪费，降低了生产成本，提高了生产效率，有很好的经济和社会效 益；即以上现有技术没有从冬虫夏草培养过程的营养保护作出研究，即使采用膜过滤的方 式来替代传统的离心方式，避免虫草细胞体的破损，排除部分营养流入发酵液中，但其效果 均较为不理想；并且对于冬虫夏草的培养周期没有作出研究，使得冬虫夏草的培养成本较 大，利润较低。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种冬虫夏草发酵液回收 孢子半连续培养方法，其具有：能够有效分离冬虫夏草发酵液与孢子，使得孢子数量较大， 孢子作为种子液进行再次培养的环境条件温和，缩短孢子种子液对环境的适应时间，进而 缩短冬虫夏草的发酵培养时间，提高了生产效率，降低生产电耗等特征。
[0007] 为了实现上述的发明目的，本发明具体是通过以下技术方案得以实现的：
[0008] -种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，包括以下步骤：
[0009] (1)准备半连续发酵罐：使用净化蒸汽对空罐、管道、过滤器及阀门在压力为 0.1?0.15MPa，温度121?124°C，持续灭菌30?50min;并将空罐、管道、过滤器以及阀 门连接起来；
[0010] (2)培养基准备：将培养基装入步骤1)的空罐之中，装入量为空罐体积容量的 50-55%，并在压力为0· 12?0· 15MPa，温度121?126°C条件下灭菌35-45min;随后，更换 无菌风维持压力，启动冷水循环系统进行降温到20?30°C后，接种发酵培养；
[0011] (3)发酵检测：当发酵进行到100_120h后，对发酵罐取样，进行发酵液检测，当分 生孢子>90%的脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，菌丝培养结束；
[0012](4)浓缩菌丝体，分离发酵液和孢子：将步骤3)中的含有菌丝体及孢子的培养液， 经过过滤器进行过滤处理，获得冬虫夏草的孢子和部分发酵液；
[0013](5)继续发酵培养：将步骤4)获得的冬虫夏草孢子和纯净的发酵液以及原料液再 返回半连续发酵罐中，作为发酵罐的种子，继续进行冬虫夏草的半连续发酵培养。
[0014] 较佳的，所述的步骤1)灭菌的压力为0· 12?0· 13MPa，温度122?123°C，持续时 间为40min。
[0015] 较佳的，所述的步骤2)灭菌的压力为0·13?0·14MPa，温度为123?124°C，持续 时间为40min。
[0016] 优选地，所述的步骤2)中采用冷水循环系统降温到25°C。
[0017] 优选地，所述的步骤2)中培养基的组成为葡萄糖2.0%、蛋白胨4.0%、 KH2P040. 20%、MgS040. 10%、玉米浆 0. 15%、糖蜜 0. 25%、其余为水。
[0018] 较佳的，所述的步骤3)中发酵检测是当发酵到105?115h后，对发酵罐内的液体 取样检测。
[0019] 优选地，所述的步骤3)中发酵检测是当发酵到IlOh后，对发酵罐内的液体取样检 测。
[0020] 较佳的，所述步骤4)中经过过滤器进行过滤处理的过滤为膜过滤。
[0021] 优选地，所述步骤4)中经过过滤器进行过滤处理的过滤为选择性膜过滤。
[0022] 与现有技术相比，本发明的技术效果体现在：
[0023] ①通过对培养设备的恰当处理，排除了培养种子受到外界菌种的污染影响，确保 了菌种的成活率，降低培养成本。
[0024] ②通过对发酵进行的程度进行恰当的跟踪检测，确保孢子脱离母体达到最大限 度，提高发酵液中孢子含量的最大化率，增大了孢子回收率以及确保后续培养的种子供应， 提高了菌丝体的收率。
[0025] ③通过培养理化条件的恰当处理，使整个培养过程的理化环境条件，均适宜冬虫 夏草菌丝的生长，进一步的提高菌丝体的回收率，降低培养成本。
[0026] ④选择适当的培养基来对冬虫夏草孢子进行培养，补充了冬虫夏草的营养成分， 提高了人工培养冬虫夏草的市场价值。
[0027] ⑤通过过滤时选择膜过滤器，甚至选择选择性膜过滤，减少进入滤液的菌丝体，既 能提高菌丝体的收率，降低滤液的COD，降低污水处理量，又不破坏细胞本身，保证胞内有效 成分的全部回收，具有显著的经济效益、社会效益和环境效益。
[0028] ⑥选择性膜过滤系统对于菌丝和孢子的分离效果好，分离出来的冬虫夏草孢子数 量较大，并且环境变换温和，所以缩短了种子液的适应时间，直接进入倍增发酵过程，从而 发酵周期也随之缩短16个小时左右；提高了生产效率，降低生产电耗，获得较好的效益。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的 范围不仅局限于所作的描述。
[0030] 实施例1
[0031] 选择发酵系统为5m3作为冬虫夏草半连续发酵培养系统，使用净化蒸汽对空罐、管 道、过滤器及阀门在压力为0.IMPa，温度121°C，持续灭菌50min;并将空罐、管道、过滤器 以及阀门连接起来；将由葡萄糖2. 0 %、蛋白胨4. 0 %、KH2P040. 20 %、MgS040. 10 %、玉米 浆0. 15%、糖蜜0. 25%、其余为水组成的培养基装入空罐之中，装入量为空罐体积容量的 50%，并在压力为0· 12MPa，温度121°C条件下灭菌45min;随后，更换无菌风维持压力，启动 冷水循环系统进行降温到20°C后，接种发酵培养；当发酵进行到IOOh后，对发酵罐取样，进 行发酵液检测，当分生孢子达到90%的脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，菌丝培 养结束；将含有菌丝体及孢子的培养液，经过过滤器进行过滤处理，获得冬虫夏草的孢子和 部分发酵液；再将冬虫夏草孢子和纯净的发酵液以及原料液再返回半连续发酵罐中，作为 发酵罐的种子，继续进行冬虫夏草的半连续发酵培养。
[0032] 实施例2
[0033] 选择发酵系统为5m3作为冬虫夏草半连续发酵培养系统，使用净化蒸汽对空罐、管 道、过滤器及阀门在压力为0. 15MPa，温度124°C，持续灭菌30min;并将空罐、管道、过滤器 以及阀门连接起来；将由葡萄糖2. 0 %、蛋白胨4. 0 %、KH2P040. 20 %、MgS040. 10 %、玉米 浆0. 15%、糖蜜0. 25%、其余为水组成的培养基装入空罐之中，装入量为空罐体积容量的 55 %，并在压力为0· 15MPa，温度126 °C条件下灭菌35min;随后，更换无菌风维持压力，启动 冷水循环系统进行降温到30°C后，接种发酵培养；当发酵进行到120h后，对发酵罐取样，进 行发酵液检测，当分生孢子达到99. 9%的脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，菌丝 培养结束；将含有菌丝体及孢子的培养液，经过过滤器进行选择性透过膜过滤处理，获得冬 虫夏草的孢子和部分发酵液；再将冬虫夏草孢子和纯净的发酵液以及原料液再返回半连续 发酵罐中，作为发酵罐的种子，继续进行冬虫夏草的半连续发酵培养。
[0034] 实施例3
[0035] 选择发酵系统为5m3作为冬虫夏草半连续发酵培养系统，使用净化蒸汽对空罐、 管道、过滤器及阀门在压力为0. 13MPa，温度123°C，持续灭菌40min;并将空罐、管道、过滤 器以及阀门连接起来；将由葡萄糖2. 0%、蛋白胨4. 0%、KH2P040. 20%、MgS040. 10%、玉米 浆0. 15%、糖蜜0. 25%、其余为水组成的培养基装入空罐之中，装入量为空罐体积容量的 53%，并在压力为0· 12MPa，温度123°C条件下灭菌40min;随后，更换无菌风维持压力，启动 冷水循环系统进行降温到25°C后，接种发酵培养；当发酵进行到IlOh后，对发酵罐取样，进 行发酵液检测，当分生孢子达到95%的脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，菌丝培 养结束；将含有菌丝体及孢子的培养液，经过过滤器进行反渗透膜过滤处理，获得冬虫夏草 的孢子和部分发酵液；再将冬虫夏草孢子和纯净的发酵液以及原料液再返回半连续发酵罐 中，作为发酵罐的种子，继续进行冬虫夏草的半连续发酵培养。
[0036] 实施例4-9
[0037] 在实施例1-3的基础上，实施例4-9的【具体实施方式】数值变化如下：
【权利要求】
1. 一种冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 准备半连续发酵罐：使用净化蒸汽对空罐、管道、过滤器及阀门在压力为0. 1? 0. 15MPa，温度121?124°C，持续灭菌30?50min ;并将空罐、管道、过滤器以及阀门连接起 来； (2) 培养基准备：将培养基装入步骤1)的空罐之中，装入量为空罐体积容量的 50-55%，并在压力为0· 12?0· 15MPa，温度121?126°C条件下灭菌35-45min;随后，更换 无菌风维持压力，启动冷水循环系统进行降温到20?30°C后，接种发酵培养； (3) 发酵检测：当发酵进行到100_120h后，对发酵罐取样，进行发酵液检测，当分生孢 子> 90%的脱落母体孢子梗，孢子梗数量增加不明显时，菌丝培养结束； (4) 浓缩菌丝体，分离发酵液和孢子：将步骤3)中的含有菌丝体及孢子的培养液，经过 过滤器进行过滤处理，获得冬虫夏草的孢子和部分发酵液； (5) 继续发酵培养：将步骤4)获得的冬虫夏草孢子和纯净的发酵液以及原料液再返回 半连续发酵罐中，作为发酵罐的种子，继续进行冬虫夏草的半连续发酵培养。
2. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 的步骤1)灭菌的压力为〇· 12?0· 13MPa，温度122?123°C，持续时间为40min。
3. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 的步骤2)灭菌的压力为0· 13?0· 14MPa，温度为123?124°C，持续时间为40min。
4. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 的步骤2)中采用冷水循环系统降温到25°C。
5. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 的步骤2)中培养基的组成为葡萄糖2. 0%、蛋白胨4. 0%、ΚΗ2Ρ040. 20%、MgS040. 10%、玉米 浆0. 15%、糖蜜0. 25%、其余为水。
6. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 的步骤3)中发酵检测是当发酵到105?115h后，对发酵罐内的液体取样检测。
7. 如权利要求1或6所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于： 所述的步骤3)中发酵检测是当发酵到110h后，对发酵罐内的液体取样检测。
8. 如权利要求1所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于：所述 步骤4)中经过过滤器进行过滤处理的过滤为膜过滤。
9. 如权利要求1或8所述的冬虫夏草发酵液回收孢子半连续培养方法，其特征在于： 所述步骤4)中经过过滤器进行过滤处理的过滤为选择性膜过滤。
【文档编号】C12R1/645GK104263651SQ201410382718
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】史兰东, 藤国霞 申请人:贵州黔坤生物制药有限公司