一种d-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，主要以利用低能N+离子注入技术对乳酸克鲁维酵母进行诱变而获得的突变菌株为筛选对象，建立了高糖固体培养基初筛，纸色谱法和高效液相色谱法组合使用进行复筛的高通量筛选方法。该方法具有筛选效率高、成本低、筛选周期短、易于操作等优点，为高效筛选经低能离子注入改造酵母所得D-阿拉伯糖醇高产菌株提供了新方法。
【专利说明】一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于离子束【技术领域】，具体涉及一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法。
【背景技术】
[0002]D-阿拉伯糖醇是一种五碳糖醇，分子式为C5H12O5,分子量为152.12，是木糖醇和核糖醇的同分异构体。糖醇是经糖还原的一类多元醇，具有低热值、抗龋齿、不影响胰岛素水平等优点，在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值。目前，常规生产D-阿拉伯糖醇的方法主要是化学法合成，但是该方法反应过程复杂、设备要求高、环境污染严重。针对化学合成法的缺点，人们将目光集中于通过生物转化法生产D-阿拉伯糖醇，其反应条件温和、生产工艺简单，因而备受关注。
[0003]Spencer等人研究发现耐高渗酵母在高渗条件下可产生多元醇，代谢葡萄糖产生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇为主，截止目前可用于生产D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、拟内袍霉属(EndomycoPsis)、小丛梗袍属(Moniliella)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤母属(Pichia)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)。但是,大部分产D-阿拉伯糖醇的酵母菌株对底物葡萄糖的转化率较低，多数酵母菌株的转化葡萄糖产D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的转化率介于10%~40%之间，并且普遍存在甘油及其他多元醇副产物。乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母，具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广(25~46°C )、分泌蛋白能力强、不产生内毒素、对人类安全等优点，因此长期以来一直被用于发酵工业。
[0004]低能离子N+注入技术作为一种新的诱变源，目前在国内微生物育种中取得显著成效，其原因在于低能离子注入生物体时同时存在能量交换、能量沉积、质量沉积及电荷交换四大效应。由于注入离子的电荷数、质量数、能量和剂量的组合不同，可以提供众多的诱变条件，使离子注入诱变具有突变谱宽，突变率高的特点，从而可以筛选到符合生产要求、提高产量的突变体。然而低能N+离子注入技术转化的随机性较大，建立一种高通量的快速筛选方法尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法。
[0006]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0007]I)初筛:将经过诱变的出发酵母菌株接种于YPD液体培养基中，然后于28~370C >160~200r/min下振荡培养24~28h得预培养液，将预培养液涂布于高糖固体培养基上，然后于28~37°C恒温培养48~60h，所述高糖固体培养基含有500~550g/L的葡萄糖；
[0008]2)复筛:经过恒温培养后，挑取生长于高糖固体培养基上的单菌落并接种于YPD液体培养基中，然后于28~37°C、160~200r/min下振荡培养24~28h得种子培养液，将种子培养液接种于YPD发酵培养基中，然后于160~200r/min、28~37°C下振荡培养96~144h得发酵液，将发酵液离心，将离心得到的上清液用纸色谱法进行分析，根据纸色谱上D-阿拉伯糖醇对应的显色斑点筛选D-阿拉伯糖醇产量较高的突变菌株。
[0009]利用低能离子注入技术对出发酵母菌株进行诱变。
[0010]所述出发酵母菌株为乳酸克鲁维酵母。
[0011]所述诱变具体包括以下步骤:
[0012]a)挑取出发酵母菌株单菌落接种于YPD液体培养基中，然后于28~37°C、160~200r/min下振荡培养18~24h得菌液；
[0013]b)用无菌水将菌液稀释至0.5~1.0 X 107CFU/mL得菌体稀释液，将100~150 μ L菌体稀释液均匀涂布于无菌平皿中央，然后用无菌风吹干得菌膜；
[0014]c)将菌膜置于离子注入机的无菌靶台上，并按以下条件对菌膜进行低能离子注入:注入离子为N+，注入剂量为1.5 X 115~2.5X10161ns/cm2，注入能量为15~25KeV，脉冲时间为5~10s，间隔时间为5~10s，真空度为1.5~2.0XlO^4Pa0
[0015]所述高糖固体培养基的组成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的琼脂。
[0016]所述YPD发酵培养基的组成包括200.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨以及10.0g/L的酵母膏。
[0017]所述纸色谱法采用的展开剂为正丁醇、吡啶与水的混合物，正丁醇:吡啶:水的体积比为14:3:3 ;纸色谱法采用的显色剂是饱和硝酸银-丙酮溶液和饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液，饱和硝酸银-丙酮溶液的制备方法为:将0.1mL饱和硝酸银水溶液加入到40mL丙酮中得混合物，向混合物中加入ImL水后通过搅拌使结晶析出的硝酸银完全溶解，饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液的制备方法为:将1mL饱和氢氧化钠水溶液与520mL无水乙醇混合；纸色谱法采用的标准品为质量浓度30g/L的葡萄糖水溶液、质量浓度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和质量浓度30g/L的甘油水溶液的等体积混合液。
[0018]所述筛选方法还包括以下步骤:
[0019]验证:利用高效液相色谱对D-阿拉伯糖醇产量较高的突变菌株的发酵液进行分析。
[0020]本发明的有益效果体现在:
[0021]本发明以利用低能离子(N+)注入技术对出发酵母菌株(乳酸克鲁维酵母)进行诱变而获得的突变菌株为筛选对象，建立了高糖培养基初筛，纸色谱法复筛的高通量筛选方法。
[0022] 本发明对利用的低能离子注入技术的条件进行了大量的实验摸索，所确定的注入剂量等条件可以保证稳定的筛选效率。本发明对标准品的组成和显色剂进行了优化，可以加快筛选速度，提高筛选结果的可靠性。本发明通过整合高糖培养基初筛的高效性，纸色谱法复筛的简便性和高效液相色谱法验证的高准确性而建立的高通量快速筛选方法可以保证稳定的筛选效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为高产菌株的传代稳定性试验。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
[0025](一 )培养基
[0026]高糖固体培养基的组成为:葡萄糖500.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂 20.0g/L, pH 为 6.5 ;
[0027]YPD液体培养基的组成为:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L, pH为 6.5 ;
[0028]YPD发酵培养基的组成为:葡萄糖200.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L, pH为 6.5。
[0029]斜面培养基的组成为:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L，琼脂20g/L，pH 为 6.5 ;
[0030](二)筛选所依据的方法
[0031](I)耐高糖实验:将经低能离子注入的出发菌株接种于高糖固体培养基上，于37 °C恒温培养48h，观察菌体生长情况。
[0032](2)纸色谱法复筛:分别将5 μ L上清液(发酵液离心)和标准品在层析滤纸上点样，在展开剂正丁醇-吡啶-水(V/V/V, 14:3:3)中层析24h(室温)，晾干后用显色剂(①取0.1mL饱和硝酸银溶液加入到40mL丙酮中，然后逐滴加ImL水搅拌使结晶析出的硝酸银至完全溶解，配制成饱和硝酸银-丙酮溶液，其中饱和硝酸银溶液为质量浓度为2500g/L的硝酸银水溶液；②取1mL饱和氢氧化钠溶液加入到520mL无水乙醇中，配制成饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液，其中饱和氢氧化钠溶液为质量浓度为530g/L的氢氧化钠水溶液)显色，显色步骤为:于室温下向晾干后的滤纸上先喷洒一层饱和硝酸银-丙酮溶液，待滤纸自然干燥后，再向滤纸上喷洒一层饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液，标准品为以下三种溶液的等体积混合液:质量浓度30g/L的葡萄糖水溶液、质量浓度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和质量浓度30g/L的甘油水溶液。标准品中葡萄糖、D-阿拉伯糖醇以及甘油在滤纸上的位置顺序为:下面为葡萄糖，中间为D-阿拉伯糖醇，上面为甘油，观察D-阿拉伯糖醇对应位置上的斑点大小。
[0033](3)高效液相色谱验证:检测发酵液中胞外D-阿拉伯糖醇含量。色谱柱=SHlOll ；流动相:0.01mol/L H2SO4 ;流速:0.8mL/min ;进样量:5 μ L ;柱温:50°C ;检测器:示差检测器(RID)。
[0034](三)突变菌株的构建
[0035]用低能N+离子注入技术对乳酸克鲁维酵母进行诱变，构建D-阿拉伯糖醇高产工程菌。
[0036](I)菌悬液的制备
[0037]将本实验室保藏的乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis, ATCC12426,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)作为出发菌株，出发菌株于斜面培养基上划线，置于37°C恒温培养24h后，挑取单菌落接种到YPD液体培养基中，于37°C、160r/min振荡培养18h得菌液。
[0038](2)菌膜制备
[0039]用无菌水将菌液稀释至1.0X 107CFU/mL得菌体稀释液，取100 μ L菌体稀释液均匀涂布于无菌平皿中央，用无菌风吹干制成菌膜。
[0040](3)低能离子注入最佳参数
[0041]在能量为20KeV、脉冲时间为5s、间隔时间为10s，真空度为1.5 X KT4Pa条件下，用不同剂量(0X1014、15X1014、35X1014、55X1014、75X1014、95X1014、115X1014、135X10141ns/cm2)对乳酸克鲁维酵母进行诱变处理，结合低能离子对细胞的致死率情况，绘出致死率和注入剂量的曲线，致死率随着注入剂量增加呈先增大后降低再增大的“马鞍”型曲线，获得最佳诱变注入参数为:能量为20KeV、脉冲时间为5s、间隔时间为10s，真空度为 1.5Xl(T4Pa，注入剂量为 75X10141ns/cm2。
[0042](4)低能离子注入菌膜
[0043]将带有所述菌膜的无菌平皿置于离子注入机的无菌靶台上，用能量为20keV、注入剂量为75X10141ns/cm2、脉冲时间为5s、间隔时间为10s、真空度为1.5X 10_4Pa，进行低能离子注入。
[0044](四)突变菌株筛选流程
[0045]将经低能离子注入后的乳酸克鲁维酵母接种于高糖固体培养基上进行初步筛选；将初筛得到的菌株进一步进行YPD液体发酵培养，利用纸色谱法和液相色谱法分析发酵所得发酵液，从而对突变菌株进一步筛选鉴定。所述发酵培养包括以下步骤:转接到Yro发酵培养基，于28~37°C、转速为160~200r/min条件下培养96~144h。
[0046]具体说明如下:
[0047](I)预培养
[0048]经过上述步骤(4)低能离子注入菌膜后，用2mL YPD液体培养基浸泡菌膜，37°C温育2h，用无菌玻璃刮铲洗脱平皿上的菌膜，获得洗脱液；未注入的对照菌膜也作同样处理。用移液枪将洗脱液转移至装有5mL YPD液体培养基的试管中，于37°C、160r/min振荡培养24h得预培养菌液。
[0049](2)高糖固体培养基初筛结果
[0050]将所得预培养菌液涂布于高糖固体培养基上，于37°C恒温培养48h后，挑取生长情况较好的菌落复筛。
[0051](3)纸色谱法初步复筛
[0052]从步骤(2)中生长情况较好的菌落中随机挑选出50个较大单菌落分别接种于含5mL YPD液体培养基的试管中，并于37°C、160r/min下培养24h得种子培养液，以体积比为5%的接种量将种子培养液接种于含10mL YPD发酵培养基的250mL三角瓶中，然后于160r/min、37°C下培养96h，然后于10000r/min离心10min，用纸色谱法对离心得到的上清液进行分析。
[0053](4)高效液相色谱法确证
[0054]将步骤(3)得到的显色斑点较大的5株菌株的发酵液浓缩(将发酵液在70°C恒温浓缩至原体积的1/50)后用微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法对其进行验证。试验结果表明显色较大的斑点所对应的发酵液中D-阿拉伯糖醇含量较高，最高可达88.23g/L。
[0055](五)筛选方法的可重复性
[0056]本发明进行了多个(1000个批次)批次的出发菌株诱变处理(注入)，然后分别对各个批次处理后的菌株进行初筛和复筛，经过统计，各个批次均可以从初步筛选中的30~50个克隆中筛选出5~6株高产菌株，发酵液中D-阿拉伯糖醇含量至少为81.35g/L。
[0057](六)突变菌株的遗传稳定性
[0058]将筛选出来的突变菌株活化后接种于含200mLYPD液体培养基的三角瓶中进行培养(37°C、160r/min)，传代培养8代测定突变菌株的遗传稳定性结果参见图1。D-阿拉伯糖醇的产量略有波动，但变化不显著，说明菌株遗传稳定性高。
[0059] 本发明使用低能N+离子注入技术对乳酸克鲁维酵母进行诱变，构建D-阿拉伯糖醇高产突变菌株。根据高产菌株有耐高渗的性质，建立了用高糖固体培养基初筛的方法。再结合纸色谱法和高效液相色谱法联合使用进行组合复筛，根据纸层析显色斑点的大小筛选得到较高产菌株，再利用高效液相色谱法对纸色谱法的筛选结果进一步进行验证。实验结果表明，本发明建立的高糖固体培养基进行初筛以及组合纸色谱法与高效液相色谱法联用复筛的筛选方法具有筛选成本低，操作方便，能快速地从大批量诱变菌株中筛选出高产菌株。
【权利要求】
1.一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:该筛选方法包括以下步骤: 1)初筛:将经过诱变的出发酵母菌株接种于YPD液体培养基中，然后于28~37°C、160~200r/min下振荡培养24~28h得预培养液，将预培养液涂布于高糖固体培养基上，然后于28~37°C恒温培养48~60h，所述高糖固体培养基含有500~550g/L的葡萄糖； 2)复筛:经过恒温培养后，挑取生长于高糖固体培养基上的单菌落并接种于YH)液体培养基中，然后于28~37°C、160~200r/min下振荡培养24~28h得种子培养液，将种子培养液接种于YPD发酵培养基中，然后于160~200r/min、28~37°C下振荡培养96~144h得发酵液，将发酵液离心，将离心得到的上清液用纸色谱法进行分析，根据纸色谱上D-阿拉伯糖醇对应的显色斑点筛选D-阿拉伯糖醇产量较高的突变菌株。
2.根据权利要求1所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:利用低能离子注入技术对出发酵母菌株进行诱变。
3.根据权利要求2所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述出发酵母菌株为乳酸克鲁维酵母。
4.根据权利要求2所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述诱变具体包括以下步骤: a)挑取出发酵母菌株单菌落接种于YPD液体培养基中，然后于28~37°C、160~200r/min下振荡培养18~24h得菌液； b)用无菌水将菌液稀释至0.5~1.0X 107CFU/mL得菌体稀释液，将100~150 μ L菌体稀释液均匀涂布于无菌平皿中央，然后用无菌风吹干得菌膜； c)将菌膜置于离子注入机的无菌靶台上，并按以下条件对菌膜进行低能离子注入:注入离子为N+，注入剂量为1.5 X 115~2.5 X 10161ns/cm2，注入能量为15~25KeV，脉冲时间为5~10s，间隔时间为5~10s，真空度为1.5~2.0XlO^4Pa0
5.根据权利要求1所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述高糖固体培养基的组成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的琼脂。
6.根据权利要求1所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述Yro发酵培养基的组成包括200.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨以及10.0g/L的酵母膏。
7.根据权利要求1所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述纸色谱法采用的展开剂为正丁醇、吡啶与水的混合物，正丁醇:吡啶:水的体积比为14:3:3 ;纸色谱法采用的显色剂是饱和硝酸银-丙酮溶液和饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液，饱和硝酸银-丙酮溶液的制备方法为:将0.1mL饱和硝酸银水溶液加入到40mL丙酮中得混合物，向混合物中加入ImL水后通过搅拌使结晶析出的硝酸银完全溶解，饱和氢氧化钠-无水乙醇溶液的制备方法为:将1mL饱和氢氧化钠水溶液与520mL无水乙醇混合；纸色谱法采用的标准品为质量浓度30g/L的葡萄糖水溶液、质量浓度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和质量浓度30g/L的甘油水溶液的等体积混合液。
8.根据权利要求1所述一种D-阿拉伯糖醇高产酵母突变菌株的筛选方法，其特征在于:所述筛选方法还包括以下步骤:验证:利用 高效液相色谱对D-阿拉伯糖醇产量较高的突变菌株的发酵液进行分析。
【文档编号】C12N15/01GK104164415SQ201410387843
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月7日 优先权日:2014年8月7日
【发明者】钱卫东, 周颖欣, 王婷, 宁肖肖, 蔡长龙, 毛培宏 申请人:陕西科技大学