一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，通过在生长对数期时加入一定的树脂，使发酵产生的乳酸链球菌素吸附于树脂，一方面减小发酵液中乳酸链球菌素的浓度，从而解除其对细胞生长和产物合成的抑制作用，另一方面有效提高乳酸链球菌素的发酵浓度，本发明中乳酸链球菌素浓度达到10000U/mL以上，显著高于一般发酵方法中乳酸链球菌素的浓度。另夕卜，采用保藏编号为CGMCCN0.8090的乳酸乳球菌CQ0422作为发酵菌种，其合成乳酸链球菌素的产率至少是一般乳酸链球菌的4.5倍，对提高乳酸链球菌素的产率起到重要的作用。本发明具有工艺简单、生产成本低、乳酸链球菌素浓度及产率局等优点。
【专利说明】一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发 酵工艺。
【背景技术】
[0002] 乳酸链球菌素既Nisin，又称乳酸链菌肽或尼生素，主要是某些乳酸链球菌菌株 代谢产生的一种小分子抗菌肽，它对许多包括金黄色葡萄球菌、溶血球菌、肉毒梭菌、嗜热 脂肪芽孢杆菌、李斯特菌在内的多种革兰氏阳性食物腐败菌和病原菌都有强烈的抑杀作 用。目前，我国食品添加剂标准化委员会批准使用的微生物防腐剂只有Nisin和纳他霉素。 1990年，我国将其列为国标GB2760-86品种，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉 制品生产中。Nisin对热稳定，使用后在消化道内很快被蛋白水解酶消化成氨基酸，不会产 生抗性和过敏反应，其作为一种理想的天然防腐剂已获得越来越广泛的应用。乳酸链球菌 素是目前国际上允许商业化生产的最重要的天然防腐剂，并且随着下游产业的快速发展， 乳酸链球菌素的可使用量将十分巨大，其产业发展存在巨大的空间。
[0003] 目前乳酸链球菌素的生产主要为微生物发酵法，然而在微生物发酵生产乳酸链球 菌素过程中，乳酸链球菌素对细胞生长特别是产物合成具有显著的抑制作用，从而抑制了 乳酸链球菌素产率的提高，另外，发酵所用菌种的产乳酸链球菌素的水平也直接制约乳酸 链球菌素的产率，因此解除乳酸链球菌素对细胞生长和产物合成的抑制，及使用高产优良 的菌株，将大幅度提高乳酸链球菌素的发酵水平，降低生产成本，提高乳酸链球菌素的产业 化生产效率。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，通过使用 有利于发酵菌种生长及乳酸链球菌素产生的发酵培养基，并通过在到达生长对数期时向 发酵培养物中加入对乳酸链球菌素有选择性吸附的树脂，使发酵产生的乳酸链球菌素吸附 于树脂，一方面减小发酵液中乳酸链球菌素的浓度，从而解除对细胞生长和产物合成的抑 制作用，另一方面有效提高乳酸链球菌素的发酵浓度。
[0005] 本发明的另一个目的是，通过使用经微波诱变并筛选得到的高产乳酸链球菌素的 乳酸乳球菌CQ0422作为发酵菌种，有效提高乳酸链球菌素的产率。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] -种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其中，
[0008] 将产乳酸链球菌素的菌种接种发酵培养基进行发酵培养，培养至生长对数期时加 入发酵培养物体积2-5%的树脂，总发酵时间24_72h后得到含有乳酸链球菌素的发酵产 物；
[0009] 其中，所述发酵培养基包含以下重量份的组分：蔗糖2. 5-3. 0,蛋白胨0. 8-1. 2,酵 母膏 0· 4-0. 5，Na2HP04 L 8-2. 0，MgS04 0· 01-0. 03,蒸馏水 90-100 ;所述发酵培养基的 pH 值 为 6· 5-7. 5。
[0010] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述产乳酸链 球菌素的菌种为保藏编号为CGMCC NO. 8090的乳酸乳球菌CQ0422。
[0011] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述树脂为 Dl 13树脂或NKA-II树脂。
[0012] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述D113树 脂或NKA-II树脂在加入发酵培养物之前经过预处理，所述预处理的方法为：将树脂置于 95-100%乙醇中浸泡至少2h,浸泡结束后用蒸馈水进行冲洗至少3次。
[0013] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述乳酸乳球 菌CQ0422接种发酵培养基之前进行活化和种子培养，包括以下步骤：
[0014] 步骤一、种子活化，挑取乳酸乳球菌CQ0422的单菌落接种于液体种子培养基中， 于28-30°C静止培养7-8h，得到活化后菌液；
[0015] 步骤二、种子培养，将活化后菌液按照1-2%的比例接种另一液体种子培养基中， 于28-30°C静止培养7-8h，得到种子培养液。
[0016] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述种子培 养基包括以下重量份的组分：蛋白陈0. 5-1. 0,豆胨0. 5-1. 0,酵母膏0. 25-0. 5,牛肉膏 0· 5-1. 0,乳糖 0· 5-1. 0,抗坏血酸 0· 05-0. 10，β -磷酸甘油二钠 L 9-2. 5, MgSO4 · 7H20 0· 025-0. 05,蒸馏水90-100 ;所述种子培养基的pH值为6. 5-7. 0。
[0017] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，将乳酸乳球菌 CQ0422的种子培养液接种发酵培养基进行培养，接种量为发酵培养基体积的5-8%，发酵 培养温度为28-30°C，pH值为6. 0-6. 5,转速为200-400转/min。
[0018] 优选的是，所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述乳酸乳球 菌CQ0422经过微波诱变并采用琼脂扩算法筛选得到。
[0019] 本发明具有以下有益效果：通过使用有利于发酵菌种生长及乳酸链球菌素产生的 发酵培养基，并通过在到达生长对数期时向发酵培养物中加入对乳酸链球菌素有选择性吸 附的树脂，使发酵产生的乳酸链球菌素吸附于树脂，一方面减小发酵液中乳酸链球菌素的 浓度，从而解除对细胞生长和产物合成的抑制作用，另一方面有效提高乳酸链球菌素的发 酵浓度，本发明中乳酸链球菌素浓度达到lOOOOU/mL以上，显著高于一般发酵方法中乳酸 链球菌素的浓度。同时，由于树脂具有良好的脱色效果，通过添加树脂在起到吸附作用的 同时，对发酵产物起到很好的脱色作用，使发酵产物的颜色较浅，有利于后期的产物分离纯 化,降低生产成本。
[0020] 另外，本发明使用了经微波诱变并筛选得到的高产乳酸链球菌素的乳酸乳球 菌CQ0422作为发酵菌种，该菌的保藏编号为CGMCC NO. 8090,经过试验检测，乳酸乳球菌 CQ0422合成乳酸链球菌素的产率是一般乳酸链球菌产率的至少4. 5倍，对提高乳酸链球菌 素的产率起到重要的作用。
[0021] 本发明具有生产工艺简单、生产成本低、过程易控制且无污染、乳酸链球菌素浓度 及产率高等优点，适合乳酸链球菌素的大规模工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺的流程图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能 够据以实施。
[0024] 如图1所示，一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其中，
[0025] 将产乳酸链球菌素的菌种接种发酵培养基进行发酵培养，培养至生长对数期时， 加入发酵培养物体积2-5 %的树脂，根据多次试验得出，一般从发酵后12小时开始根据菌 种生长情况逐步以直接从接种口倒入发酵罐中的方式向发酵培养物中添加树脂，并控制树 脂的总加入量为发酵体积的2-5%。从发酵开始算起，总发酵时间24-72h，得到含有乳酸链 球菌素的发酵产物；其中，所述发酵培养基包含以下重量份的组分：蔗糖2. 5-3.0,蛋白胨 0· 8-L 2,酵母膏 0· 4-0. 5, Na2HPO4 L 8-2. 0, MgSO4 0· 01-0. 03,蒸馏水 90-100 ;所述发酵培 养基的pH值为6. 5-7. 5。
[0026] 所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述树脂为D113树脂或 NKA-II树脂；所述Dl 13树脂或NKA-II树脂在加入发酵培养物之前经过预处理，所述预处 理的方法为：将树脂置于95-100 %乙醇中浸泡至少2h，浸泡结束后用蒸馏水进行冲洗至少 3次，直到预处理后的树脂没有乙醇味道为止。由于本发明所用树脂对乳酸链球菌素具有选 择性吸附作用，可将大部分发酵产生的乳酸链球菌素吸附于树脂，一方面减小发酵液中乳 酸链球菌素的浓度，从而解除或降低乳酸链球菌素对细胞生长和产物合成的抑制作用，另 一方面有效提高乳酸链球菌素的发酵浓度，本发明中乳酸链球菌素浓度达到lOOOOU/mL以 上，显著高于一般发酵方法中乳酸链球菌素的浓度。同时，由于树脂具有良好的脱色效果， 通过添加树脂在起到吸附作用的同时，对发酵产物起到很好的脱色作用，使发酵产物的颜 色较浅，有利于后期的产物分离纯化。
[0027] 所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述产乳酸链球菌素的 菌种没有采用常用的乳酸链球菌，而是采用了保藏编号为CGMCC NO. 8090的乳酸乳球菌 CQ0422,分类命名：Lactococcus lactis，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年8月30日。该菌株以 从北京北纳创联生物技术研究院购买的乳酸乳球菌CICC23610为出发菌株，经过微波诱 变并采用琼脂扩算法筛选得到，合成乳酸链球菌素的能力为一般乳酸链球菌的4. 5倍，对 提高乳酸链球菌素的产率具有重要的意义。
[0028] 所述乳酸乳球菌CQ0422的微波诱变方法为：将出发菌株扩大培养后，以10%的 接种量接种到装有20ml种子培养基的50ml容量瓶中，30°C培养到对数生长期，放入微波 中以高强度微波处理，诱变获得菌株采用琼脂扩算法筛选获得高产乳酸链球菌素突变菌株 CQ0422。
[0029] 所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述乳酸乳球菌CQ0422 接种发酵培养基之前进行活化和种子培养，包括以下步骤：
[0030] 步骤一、种子活化，将冷冻保藏的菌种通过平板划线分离单菌落，平板培养基采用 固体种子培养基，是在液体种子培养基的基础上加入1. 5-2%的琼脂制得。挑取乳酸乳球菌 CQ0422的单菌落接种于液体种子培养基中，于28-30°C静止培养7-8h，得到活化后菌液；
[0031] 步骤二、种子培养，将活化后菌液按照1-2%的比例接种另一液体种子培养基中， 于28-30°C静止培养7-8h，得到种子培养液。
[0032] 所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，所述种子培养基包括以 下重量份的组分：蛋白陈〇. 5-1. 0,豆胨0. 5-1. 0,酵母膏0. 25-0. 5,牛肉膏0. 5-1. 0,乳糖 0· 5-L 0,抗坏血酸 0· 05-0. 10，β -磷酸甘油二钠 L 9-2. 5, MgSO4 · 7Η20 (λ 025-0. 05,蒸馏 水90-100 ;所述种子培养基的pH值为6. 5-7. 0。
[0033] 所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺中，将乳酸乳球菌CQ0422的 种子培养液接种发酵培养基进行培养，接种量为发酵培养基体积的5-8%，发酵培养温度为 28-30°C，pH 值为 6. 0-6. 5,转速为 200-400 转 /min。
[0034] 实施例一
[0035] 从平板培养基中挑取一环菌种接于液体种子培养基中，30°C活化8h，再以1%的 接种量接入另一液体种子培养基中，30°C静止培养8h，作为发酵的种子培养液。
[0036] 发酵培养基：蔗糖2. 9%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.4%，Na2HPO4 1.8%，MgSO4 0.02%，pH值7. 5。将种子培养液接种于发酵培养基，接种量为5%，培养温度为30°C，pH 值为6. 1，转速为200转/min，发酵5. 5h加入2%的D113树脂，发酵时间为24h结束，乳酸 链球菌素的发酵浓度为11325U/mL。
[0037] 实施例二
[0038] 从平板培养基中挑取一环菌种接于液体种子培养基中，30°C活化8h，再以1%的 接种量接入另一液体种子培养基中，30°C静止培养8h，作为发酵的种子培养液。
[0039] 发酵培养基：蔗糖2. 5%，蛋白胨0.8%，酵母膏0.4%，Na2HPO4 1.8%，MgSO4 0. 04%，pH值7. 5。将种子培养液接种于发酵培养基，接种量为6%，培养温度为30°C，pH 值为6. 2,转速为300转/min，发酵5. 5h加入3%的D113树脂，发酵时间为24h结束，乳酸 链球菌素的发酵浓度为12085U/mL。
[0040] 实施例三
[0041] 从平板培养基中挑取一环接于液体种子培养基中，30°C活化8h，再以1 %的接种 量接入另一液体种子培养基中，30 °C静止培养8h，作为发酵的种子培养液。
[0042] 发酵培养基：蔗糖3.0%，蛋白胨1.2%，酵母膏0.5%，Na2HPO 4 2.0%，MgSO4 0.03%，pH值7. 5。将种子培养液接种于发酵培养基，接种量为5%，培养温度为30°C，pH 值为6. 3,转速为200转/min，发酵5. 5h加入5%的NKA-II树脂，发酵时间为24h结束，乳 酸链球菌素的发酵浓度为11450U/mL。
[0043] 实施例四
[0044] 从平板培养基中挑取一环接于液体种子培养基中，30°C活化8h，再以1 %的接种 量接入另一液体种子培养基中，30 °C静止培养8h，作为发酵的种子培养液。
[0045] 发酵培养基：蔗糖2. 6%，蛋白胨1.1%，酵母膏0.5%，Na2HPO4 1.9%，MgSO4 0.02%，pH值7. 5。将种子培养液接种于发酵培养基，接种量为5%，培养温度为30°C，pH 值为6. 5,转速为200转/min，发酵5. 5h加入4%的NKA-II树脂，发酵时间为24h结束，乳 酸链球菌素的发酵浓度为11089U/mL。
[0046] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。
【权利要求】
1. 一种高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于， 将产乳酸链球菌素的菌种接种发酵培养基进行发酵培养，培养至生长对数期时加入发 酵培养物体积2-5%的树脂，总发酵时间24-72h后得到含有乳酸链球菌素的发酵产物； 其中，所述发酵培养基包含以下重量份的组分：蔗糖2. 5-3. 0,蛋白胨0. 8-1. 2,酵母 膏 0· 4-0. 5, Na2HPO4L 8-2. 0, MgSO4O. 01-0. 03,蒸馏水 90-100 ;所述发酵培养基的 pH 值为 6. 5-7· 5〇
2. 如权利要求1所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述产乳酸链球菌素的菌种为保藏编号为CGMCC NO. 8090的乳酸乳球菌CQ0422。
3. 如权利要求2所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述树脂为Dl 13树脂或NKA-II树脂。
4. 如权利要求3所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述D113树脂或NKA-II树脂在加入发酵培养物之前经过预处理，所述预处理的方法为：将树 脂置于95-100%乙醇中浸泡至少2h，浸泡结束后用蒸馏水进行冲洗至少3次。
5. 如权利要求2所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述乳酸乳球菌CQ0422接种发酵培养基之前进行活化和种子培养，包括以下步骤： 步骤一、种子活化，挑取乳酸乳球菌CQ0422的单菌落接种于液体种子培养基中，于 28-30°C静止培养7-8h，得到活化后菌液； 步骤二、种子培养，将活化后菌液按照1-2%的比例接种另一液体种子培养基中，于 28-30°C静止培养7-8h，得到种子培养液。
6. 如权利要求5所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述种子培养基包括以下重量份的组分：蛋白陈〇. 5-1. 0,豆胨0. 5-1. 0,酵母膏0. 25-0. 5， 牛肉膏0. 5-1. 0,乳糖0. 5-1. 0,抗坏血酸0. 05-0. 10，β -磷酸甘油二钠1. 9-2. 5， MgSO4 · 7Η200· 025-0. 05,蒸馏水90-100 ;所述种子培养基的pH值为6. 5-7. 0。
7. 如权利要求5所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，将 乳酸乳球菌CQ0422的种子培养液接种发酵培养基进行培养，接种量为发酵培养基体积的 5-8%，发酵培养温度为28-30°C，pH值为6. 0-6. 5,转速为200-400转/min。
8. 如权利要求2所述的高产乳酸链球菌素的吸附分离耦合发酵工艺，其特征在于，所 述乳酸乳球菌CQ0422经过微波诱变并采用琼脂扩算法筛选得到。
【文档编号】C12R1/46GK104212858SQ201410391233
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】张春颖, 杨旭锦 申请人:西藏天虹科技股份有限责任公司