山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种山羊痘病毒Taqman—MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。本方法根据靶序列上的1个区域设计2条引物和一条探针，该试剂盒包括2×PremixExTaqTM缓冲液、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。本发明只需要两步法扩增法及简单的反应条件就可以快速、高效、特异性、高灵敏度地检测目的靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。
【专利说明】山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引 物、试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及一种山羊痘 病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV)属羊痘病毒属（Capripoxvirus)病毒，可引起 动物的山羊痘，患病羊主要表现为发热，皮肤、黏膜、器官表面广泛性丘疹或结节，淋巴结肿 大，皮肤水肿，感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危 害，造成严重的经济损失。山羊痘与绵羊痘并称"羊痘"，可以感染人，因而在公共卫生方面 还具有重要意义（Key S J.，2007)。山羊痘病毒和绵羊痘病毒的某些分离毒株可同时感染 山羊和绵羊（Ahmed A M.，2007)，临床症状和发病机理上相似，传统的病原学检测方法操作 复杂，不适宜用于临床的检测，且与其他痘病毒在血清上存在交叉反应，血清型诊断方法也 难以区分确定。近年来，越来越多新型检测技术被应用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测 和鉴别。Madhusudan Η等人利用PCR-RFLP技术对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行了研究，可 以用于这两种病毒的分类及鉴定（Madhusudan Η.，2004)。但这种技术在聚合酶链式反应之 后还需要对产物进行纯化和酶切，较费时费力。而目前国内外其他一些检测技术也不能区 别检测这两种病毒，由此发明一种可鉴别检测山羊痘病毒的方法，对这两种病毒及羊痘病 毒属病毒的研究具有重要意义。在羊痘病毒检测方面，尚未有利用TaqMan-MGB突光定量方 法鉴别山羊痘的检测方法。根据上述内容中羊痘可以感染人，对人类食用含有该病毒的肉 制品，可能使人患病，因此对食品安全的监督和检测有重大的意义。
[0003] 由于该病毒的传染性极强，因此对于本病毒的防控就显得尤为重要。荧光定量 PCR技术是一种能够快速、准确的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、较高的稳定性。而 TaqMan-MGB是一种新型的探针，3'端经特殊处理的高特异性探针，能检测模板结合区甚至 1个碱基的突变基因，且本底荧光信号低，准确率高。
[0004] TaqMan探针是一种募核昔酸探针，突光基团链接在探针的5'末端，洋灭基团则在 3'端。当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。在 进行延伸反应时，聚合酶的5'外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发射 荧光。一分子的产物生成就会伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加， 释放出来的荧光基团不断的积累。因此TaqMan探针检测的是积累荧光。目前，水解探针已 被用于基因检测、病毒定量、癌细胞基因微突变检测、细胞因子基因定量等，其结果都具有 高特异性与高敏感性。
[0005] TaqMan-MGB探针是近年来的一种新型探针，它的淬灭基团是一种非荧光的淬灭基 团，本身不会发生荧光，这样就降低了 PCR反应荧光本底信号的强度，进一步提高了其敏感 性。
[0006] 中国发明专利（申请号为：200710030435. 0、200710030437· Χ、200710132320· 2、 200710026389.7,200810052321. 0,200810015001. 8,200810093986. 6,200910041358. 8, 200910251055. 9、200910090037· 7、201010555073· 9、201110339104· X 等）分别公开了采用 荧光定量PCR扩增技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用TaqMan - MGB探 针荧光定量PCR扩增技术检测山羊痘病毒的试剂盒及检测方法的报道。
【发明内容】
[0007] 为克服现有技术的不足，本发明针对TaqMan-MGB探针的优点，通过对山羊痘病毒 特异保守序列进行设计探针，建立了高度特异性、高灵敏度，并且稳定性好的检测方法。进 而本发明的第一个目的是提供一种山羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引 物，第二个目的是提供使用该引物用于山羊痘病毒TaqMa-MGB探针实时荧光定量PCR检测 的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的检测方法。
[0008] 为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：本检测用引物包括山羊痘病毒 上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 1;山羊痘病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID N0. 2 ; 山羊痘病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO. 3。
[0009] 为了实现上述第二目的本发明采用如下技术方案：一种山羊痘病毒Taqman - MGB 探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌 去离子水管，其中： 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成： DNA序列为SEQ ID NO. 1的10 μ mol/L的山羊痘病毒上游引物2 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 2的10 μ mol/L的山羊痘病毒下游引物2 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 3的10 μ mol/L的山羊痘病毒MGB探针1. 4 μ L ; 2XPremix Ex Taq?缓冲液 8yL; 灭菌去尚子水5. 6μ?; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为山羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20 μ L ; 具体地，性重组质粒DNA的制备如下：核苷酸序列为SEQ ID NO. 4的PCR上游引物和 核苷酸序列为SEQ ID NO. 5的PCR下游引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与 PMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA; 所述阴性对照管，管内为无山羊痘病毒感染的羊组织基因组DNA，体积为20μ L ; 所述灭菌去离子水管lmL?2mL。
[0010] 为实现上述第三目的本发明提供一种山羊痘病毒Taqman - MGB探针实时荧光定 量PCR检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA， 获得待检模板DNA ; 2) 扩增反应体系为：19μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 山羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反 应条件：预变性95°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s (使用ABI 7500议采用34s) 40个循环；在 60°C 34s进行荧光信号的采集。
[0011] 4)结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0012] 本发明的原理是：针对一段500bp左右的靶序列保守区域设计2条引物和一条 MGB探针，利用探针只与模板特异性地结合，其结合的位点在两条引物之间。探针的5'端标 记有报告基团FAM，3'端标记有非淬灭基团，本身不产生荧光，可以大大降低本低信号的强 度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得 同样的Tm值，可以将MGB探针设计的更短，既降低了合成车成本，也使得探针设计的成功率 大为提高。这种实验方法所使用的仪器比较简单，同时克服了传统PCR固有的检测时间长、 容易污染及检测成本高等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操 作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
[0013] TaqMan-MGB探针荧光定量PCR扩增技术是一种简便、快速、高度特异性的基因扩 增方法。将此基因扩增技术与普通PCR或普通的TaqMan探针技术进行比较，可发现该技术 在灵敏度、特异性和检测范围等指标上优于上面的技术，且不依赖于任何专门的仪器设备 即可实现现场高通量快速检测。现有的60°C 34s的检测周期较长，约1天，操作繁琐，而本 发明的试剂盒仅需50min左右。
[0014] 本发明的优点是（1)、不需要特殊试剂与设备；（2)、高特异性：应用保守区段， 二条引物及一条MGB探针，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于 99. 6%，假阳性率小于0. 1% ; (3)、快速、高效扩增：检测时间50min左右；（4)、灵敏度高：最 低检测极限达到3. 29拷贝/uL ; (5)、鉴定简便：通过最后的扩增曲线就可以进行结果的精 确的，无需电泳等其他任何分析步骤；（6)、用途：可用于畜产品及其相关产品的快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1特异性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图2灵敏度试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图3稳定性试验结果，图中横纵坐标表示扩增的循环数； 图4标准曲线的建立。
【具体实施方式】
[0016] 实施例1，引物的设计及筛选 山羊痘病毒荧光定量PCR扩增引物及探针，其设计是根据GenBank公布的山羊痘病毒 参考序列，用MEGA5进行比对，分析序列并在其保守区域进行引物与探针的设计。采用探 针设计软件Primer Express 3.0,设计4套突光定量引物，由英骏(上海)有限公司合成，利 用ABI 7500 FAST PCR仪对反应进程中的扩增情况进行实时监控，对不同引物组扩增的起 始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等参数进行分析， 筛选出扩增速率最高、特异性好的一组荧光定量PCR扩增引物，分别标记为SEQ ID NO. 1? SEQ ID NO. 3。其中引物组中引物上游：SEQ ID NO. 1;引物下游：SEQ ID NO. 2;探针： SEQIDN0·3;SEQIDN0·l?SEQIDN0·3的浓度分别为10μmol/L，10μmol/L，10 μ mol/L，体积比为1:1:1。同时，利用PCR引物软件设计阳性重组质粒DNA的PCR引物，其 核苷酸序列分别为：PCR上游引物：SEQ ID NO. 4 ;PCR下游引物：SEQ ID N0. 5 ;它们的体积 比为1:1。
[0017] SEQ ID NO. 1 代表的序列为：5' - CCACCCCAATATTCTGCTGC -3' SEQIDN0·2代表的序列为：5'-ACATTAGGGAATCATGTGCAGTGA-3' SEQIDN(λ3代表的序列为：5'FAM-TCTTGCTAAAATaCC-MGB3' SEQIDN0·4代表的序列为：5'-TTGTCAGAAACGAGG-3' SEQIDN0·5代表的序列为：5'-ATGCCTCACTTGTATTTGG-3' 实施例2,阳性对照品的制备 用试剂盒提取山羊痘病毒病毒细胞培养物的核酸，将其核酸进行PCR及电泳鉴定，采 用PCR上游引物SEQ ID N0. 4和PCR下游引物SEQ ID N0. 5进行扩增，并使用胶回收试剂 盒回收扩增的条带。按照1 :1〇的比例和PMD19-T载体进行连接反应，4°C连接过夜，转化 DH5 α菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定其核酸的0D值， 使其260/280的比值在1. 8?2. 0之间。
[0018] 实施例3，阴性对照品的制备 用试剂盒提取无山羊痘病毒感染的羊组织的DNA，进行PCR及电泳鉴定。
[0019] 实施例4,山羊痘病毒荧光定量PCR扩增快速检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的DNA提取试剂盒，提取样品中的DNA，获得待检模 板 DNA ; 2) 扩增反应体系为：19 μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 山羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反 应条件：预变性95°C 30s ;95°C 5s，60°C 34s (使用ABI 7500建议采用34s) 40个循环； 在60°C 34s进行荧光信号的采集。
[0020] 4)结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳 性，35个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
[0021] 实施例5,山羊痘病毒荧光定量PCR扩增的特异性试验 采用实施例4的反应体系及反应条件进行特异性的试验，所采用的模板分别是山羊痘 病毒DNA，绵羊痘病毒DNA，牛结节性皮疹病毒DNA，牛痘病毒DNA，羊口疮病毒DNA，阴性对 照。
[0022] 参见图1的结果显示：只有山羊痘病毒病毒有扩增曲线。
[0023] 实施例6,山羊痘病毒病毒荧光定量PCR扩增的灵敏度试验 将所建立的山羊痘病毒病毒质控标准品进行10倍倍比稀释（3. 29X 109拷贝/ μ L~3. 29拷贝/ μ L)，采用实施例4的反应体系及反应条件进行灵敏度试验，结果显示出， 建立的该方法最低能够检测出3. 29拷贝/ μ L的DNA样品。
[0024] 参见图2的结果显示：图中的曲线从左到右分别表示倍比稀释后的模板浓度，依 次分别为 3· 29Χ107 拷贝 / μ L、3. 29Χ106 拷贝 / μ L、3. 29Χ105 拷贝 / μ L、3. 29Χ104 拷贝 /^1^、3.29\103拷贝/^1^、3.29\102拷贝/^1^、3.29\10 1拷贝/^1^、3.29拷贝/^1^。
[0025] 实施例7,山羊痘病毒荧光定量PCR扩增的重复性试验 以重组质粒标准品3. 29X 106拷贝/yL与3. 29X 105拷贝/yL为模板，采用实施 例4的反应体系及反应条件进行重复性试验，组内与组间重复试验变异系数为0.42% ?1. 69%，表明该方法具有较好的重复性。
[0026] 参见图3的结果显示。
[0027] 实施例7,山羊痘病毒荧光定量PCR扩增的标准曲线的建立 把重组质粒的标准品进行五个倍比稀释，进行标准曲线的制作，以荧光强度的对数值 为横坐标，循环数为纵坐标作图，得到标准曲线，相关系数R2=〇. 999,扩增效率达到103 %， Y= -3. 43X+40. 18由此可见本实验所建立的标准曲线的扩增效率较好，其荧光曲线与所检 测的靶基因浓度之间的相关性较好，准确度较高。
[0028] 参见图4的结果显示。
【权利要求】
1. 山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物及探针，其特征在于：包 括山羊痘病毒上游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 1; 山羊痘病毒下游引物，其DNA序列为SEQ ID NO. 2 ; 山羊痘病毒MGB探针，其DNA序列为SEQ ID NO. 3。
2. 山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于：包括扩 增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中 ： 所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成： DNA序列为SEQ ID NO. 1的10 μ mol/L的山羊痘病毒上游引物2. 0 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 2的10 μ mol/L的山羊痘病毒下游引物2. 0 μ L ; DNA序列为SEQ ID NO. 3的10 μ mol/L的山羊痘病毒MGB探针1. 4 μ L ; 2XPremix Ex Taq 缓冲液 8μ?; 灭菌去尚子水5. 6μ?; 合计19 μ L,为单次反应的用量； 所述阳性对照管，管内为山羊痘病毒阳性重组质粒DNA，体积为20 μ L ; 所述阴性对照管，管内为无山羊痘病毒感染的羊组织基因组DNA，体积为20yL; 所述灭菌去离子水管lmL?2mL。
3. 根据权利要求2所述山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒， 其特征在于：所述阳性重组质粒DNA由如下反应获得： 核苷酸序列为SEQ ID NO. 4的PCR上游引物和核苷酸序列为SEQ ID NO. 5的PCR下游 引物按常规方法进行PCR扩增，将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳 性重组质粒DNA。
4. 根据权利要求2所述山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用试剂盒， 其特征在于：所述DNA序列为SEQ ID NO. 3的山羊痘病毒MGB探针的5'端标记有报告基团 FAM，3'端标记有非淬灭基团，同时还连接有MGB修饰基团。
5. 利用权利要求2所述试剂盒进行山羊痘病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检 测的非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤： 1) 制备待检模板DNA :选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA， 获得待检模板DNA ; 2) 扩增反应体系为：19 μ L扩增反应液；1 μ L待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反 应体系的总体积为20 μ L; 3) 山羊痘病毒荧光定量PCR扩增：将步骤2)配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反 应条件：预变性95°C 30s;95°C 5s，60°C 34s 40个循环；在60°C 34s进行荧光信号的采 集； 4) 结果判定：将扩增反应在35个循环以内且扩增曲线良好的反应直接判定为阳性，35 个循环以后的可直接判定为阴性，同时阳性对照的扩增明显，阴性对照没有扩增。
【文档编号】C12N15/11GK104152583SQ201410394039
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】王昱, 聂福平, 杨俊 , 王国民, 李应国 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心