一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物，包含标记基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种，MaDAHPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，MaEPSPS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，MaICS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MaCAD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明采用水杨酸代谢途径关键基因MaDAHPS1、MaEPSPS1、MaICS、MaCAD1和MaC4H2中的一种或多种作为基因标记物，可以用于香蕉抗枯萎病早期筛选，为育种的早期鉴定提供了技术保障。
【专利说明】一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，尤其涉及一种用于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因 标记物。
【背景技术】
[0002]香蕉枯萎病，又称巴拿马病、黄叶病，是在世界范围内限制香蕉产量的主要原因 (Getha and Vikineswary，2002 ;0, Donnell et al，1998 ;Ploetz and Pegg，2000)。该病 是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. Cubense，Foc)引起的毁灭性土传 维管束病害，广泛分布于世界各大香蕉主产区（高乔婉，1996)。香蕉枯萎病菌是兼性寄生 菌，其腐生能力很强，在土壤中可以存活S-10年。病原菌进入寄主以后，采用死体营养方 式，先降解寄主组织，杀死寄主细胞，再吸收营养（王振中，2006)。香蕉枯萎病是一种典型 的维管束病害，发病时在整株外表可见明显的萎焉和下部老叶变黄，在病害严重时期，受感 染的植株大多数的叶片变黄或干枯，假茎可以直立1-2个月，之后整株倒地腐烂。在受感染 的植株内部，根系和球茎的木质部组织中呈现出红褐色至栗色的变化。在球茎的横切面，有 红掠色或黑色的斑点，这是被病原囷侵染后坏死的维管束（P6r ez_Vicente, 2004)。Foe也 侵染香蕉周围萌发的吸牙（P6rez-Vicente，2004)。同时枯萎病扩散的途径还包括带病的种 苗（Su et al，1986)和带有病原菌的农耕工具及种植者（Hwang et al，2004)等。
[0003]目前依据病菌在香蕉不同品系及不同属种的致病程度，将其划分为4个生理小种 (Koenig et al，1997)。其中，1号小种（Racel)呈世界性分布，侵染粉蕉、香蕉的栽培品种 大蛮舍（Gros Michel, AAA)及龙牙焦（Musa, AAB)，不侵染矮香蕉（Dwarf Cavendish, AAA); 香蕉栽培史上第一次枯萎病爆发就是1号生理小种造成的。2号小种（Race2)仅侵染三 倍体杂种棱香蕉（Bl Ugg〇e，AAB)，不侵染大蜜舍，对香蕉栽培品种的危害较小。3号小种 (Race 3)主要侵染野生揭尾蕉属（Heliconia spp·)，对香蕉栽培品种基本不造成危害。4号 小种（Race4)几乎危害所有的香蕉和大蕉品种（Persley et al, 1987 ;Koenig et al，1997 ; Ploetz et al，2000)，如大蜜舍、矮香蕉、野蕉、棱指蕉。该小种分热带型（tropical)和亚 热带型（subtropical)两种（Visser et al，2〇10)，在香蕉整个生长时期均造成危害，当土 壤中病原菌的浓度达到1 X l〇3CFU/g时，就能使香蕉表现出病害症状（何欣等，2010)。4号 生理小种在4个生理小种中破坏性最大（Persley et al，1987 ;王振中，2006)，目前占世界 栽培香蕉种植面积的80%的品种受它侵染，这其中包括商品化种植程度很高的卡文迪什亚 种（Cavendish subgroups)(Kungn and Jeffries, 2001 ;Ploetz，2005)。
[0004] 香蕉枯萎病的发生和发展机理十分复杂，在该研究领域一直存在长期的争论，其 研究涉及到病理学、解剖学、生理学、生物化学和分子生物学等多个学科。有研究显示枯萎 病的发生是由于病原菌通过根系侵入植株输导组织，病原体在木质部的导管中大量繁殖， 这些繁殖体可以在蒸腾压力的作用下随导管运输（在梯状导管的基部收集到病原体）， 随着病原体的大量增殖，增殖的病原菌体可由一个导管运输到另一个导管，大量繁殖的 病原菌在导管内形成凝胶体，受感染的宿主分泌酚类化合物使堵塞的导管木质化而死亡 (Ploetz and Pegg，2000)。同样利用GFP标记的Foe TR4观察到在接种1天后病源菌便附 着于根系表皮细胞，沿细胞间层生长，之后可在维管束中大量繁殖从而导致根系死亡（殷 晓敏等，2011)。
[0005] 用香蕉枯萎病菌细胞壁的激发子处理香蕉根系会诱发根系细胞壁的木质化，而且 耐病品种中这些酶活均高于感病品种（cv. Williams)，表明木质素引起细胞壁加厚是起到 防卫尖孢镰刀菌4号生理小种的重要途径（Ana et al, 2000)。研究发现利用激发子处理香 蕉植株后，与对照相比较，水杨酸的水平提高21倍，防御酶活性也显著提高，同时多酚含量 也提高，说明激发子能够诱导产生系统获得性抗性（Patel et al，2004)，同样在抗病品种 中的酚酸类物质上升高于感病品种（VandenBerg et al，20〇7)，这些研究结果表明香蕉对 枯萎病菌存在可诱导的抗病性，而且酚类物质代谢参与香蕉抗枯萎病的过程。
[0006] 在基因水平，VandenBerg等（2007)利用SSH和微阵列技术研究耐病和感病品种的 香焦根系中发现细胞壁加固相关基因可能参与到香蕉抵抗枯病病菌的侵染，这与之前的生 化研究结果相吻合。伴随着新~代测序技术的发展，RNA-seq(RNA-sequencing)和数字基 因表达谱（Digital gene expression profiles, DGE)广泛应用到非模式植物尤其是农作物 的转绿组和基因表达谱的研究（Varshney et al，2009 ;梁烨等，2011)。最近Li等（2012) 利用这些技术研究香蕉与枯萎病互作的抗性机理，研究发现病原菌侵染香蕉激活了香蕉的 病原菌相关分子模式触发的免疫反应（PTI)，效应因子触发的免疫反应（ETI)，离子流和茉 莉酸的生物合成参与到香蕉抗枯萎病的过程，水杨酸不参与香蕉抗Foe TR4的过程，上述结 果从转绿组角度阐释了香蕉抗枯萎病的分子机理。
[0007] 由于香焦是二倍体，不广生种子，常规育种很难进行（Robinson, 1996)。在香蕉 品种中，野生种的香蕉对枯萎病具有很好的抗性，这些材料是很好的抗病基因库（Pl〇etz and Pegg，2〇00)。但对这些基因功能的研究还只处在初始阶段。而利用基因工程手段将 抗病相关基因导入感病香焦品种仅有少数成功的报道（Mahdavi et al,2012)，但在香蕉 中可罪有效的is传转化方法还需要进一步的探索与研究（Becker et al, 2000 ;Khanna et al，2004)。
[0008] DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映，而且具有标记量丰富、稳定、操作 简便等优点。目前，DNA分子标记已广泛地应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因 定位和分子标记辅助选择等各方面（葛颂等，1994)。
[0009]香蕉品种创制是对香蕉品种经济性状的设计、重组、选择和固定。传统的育种方法 主要是依靠香蕉的形态标记进行选择，同时香蕉的高度不育和多态性不但耗费大量的人力 和物力，而且需要很长的时间。近年来，随着生物技术的发展，香蕉育种的方式有了很大的 变化，各种遗传标记广泛应用于香蕉育种，尤其是DNA分子标记技术的应用，极大地缩短了 育种的周期。
[0010]大量的DNA分子标记被运用于香蕉亲缘关系分析及分类的研究。Uma等采用rapd 标记技术分析印第安I6个品种的野生蕉遗传多样性和种间相关性，将16个品种分为4类。 我国士者对3 3个品种香蕉（Musa nana Lour,为M. acuminata与M. balbisian的自交及杂 交后代）的遗传变异进行了研究，将这些品种划归4个群。Noyer等利用SSR和AFLP标记 对30个香蕉品种遗传背景分析，发现遗传基础较为狭小，而用m SAp标记研究在CCGG位点 胞核嘧啶甲基化程度，获得较高的遗传多样性数据。Nair等采用建立在香蕉的 LTR序列基 础之上的IRAP标记对％个香蕉品种基因组分类，结果表明，iraP标记在鉴定B基因存在 较为适用。Creste等利用微卫星标记技术对巴西的58个香蕉品种的基因型（49个二倍体 和9个三倍体品种）进行分类，为种质资源的鉴定和评价奠定了基础。
[0011]近年来随着分子生物学研究手段的不断更新，基因组学和转录组学研究获得快速 f展，建立在这些技术基础上的数量众多的基因表达信息被获得。因此，借助于这些信息分 离用于鉴定某一性状的标记基因成为可能，为育种的早期鉴定提供了技术保障。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于现有技术的不足，提供一种基因标记物，可用于抗枯萎病香蕉 品种的早期筛选。
[0013] 本发明的第一个方面是提供一种于筛选抗枯萎病香蕉品种的基因标记物，述基 因标记物包含标记基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、Males、MaCADl和MaC4H2中的一种或多种， MaDAHPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，MaEPSPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，MalCS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，MaCADl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示， MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0014] 优选地，，所述基因标记物包含标记基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、Males、MaCADl和 MaC4H2。
[0015] 本发明的第二个发明是提供一种筛选抗枯萎病香蕉品种的方法，包括以下步骤： 将香蕉幼苗接种镰刀菌，然后确定本发明第一个方面所述的基因标记物的表达水平，筛选 基因标记物的表达水平提高的香蕉幼苗。
[0016] 优选地，在接种镰刀菌之前，先确定本发明第一个方面所述的基因标记物的表达 水平。
[0017] 本发明的第三个方面是提供一种本发明第一个方面所述的基因标记物在筛选抗 枯萎病香蕉品种中的应用。
[0018] 本发明的第四个方面是提供一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测本发明第一个 方面1所述的基因标记物的表达的探针。
[0019] 本发明采用水杨酸代谢途径关键基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、MalCS、MaCADl和 MaC4H2中的一种或多种作为基因标记物，可以用于香蕉抗枯萎病早期筛选，为育种的早期 鉴定提供了技术保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为感病品种和抗病品种接种FocTR4后游离态水杨酸（SA)的含量检测结果；
[0021] 图2为感病品种和抗病品种接种FocTR4后结合态SA的含量检测结果；
[0022] 图3为感病品种和抗病品种中MaDAHPSl表达检测结果；
[0023] 图4为感病品种和抗病品种中MaEPSPSl表达检测结果；
[0024] 图5为感病品种和抗病品种中MalCS表达检测结果；
[0025] 图6为感病品种和抗病品种中MaCADl表达检测结果；
[0026] 图7为感病品种和抗病品种中MaC4H2表达检测结果；
[0027] 图8为不同浓度水杨酸处理对Foe TR4生长的影响的检测结果，其中，水杨酸处理 浓度：1 :OuM ;2 :50uM ;3 :100uM ;4 :200uM ;5 :300uM ;6 :400uM ;7 :500uM ;8 :600uM ;
[0028]图9不同浓度的水杨酸对香蕉幼苗根系的影响结果图，其中b*a的局部放大图；
[0029]图1〇为水杨酸处理对诱导香蕉抗病性的效果图，其中，a为外部症状，b为内部症 状；
[0030t图η为SA预处理后接种Foc TR4后香蕉根系SA含量影响的检测结果，其中，a为 对游离态SA含量的影响，b为对结合态SA含量的影响；
[0031 ]图12为SA预处理后接种Foc TR4后对诱导水杨酸代谢途径关建酶基因的表达的 影响。
【具体实施方式】
[0032]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发 明。
[0033] 1·水杨酸代谢途径关键基因的获得（克隆）
[0034]以镰刀菌侵染后2天、4天和6天的香蕉根系提取总RNA,构建文库进行转录组 分析，犾得涉及水杨酸代谢途径差异表达cDNA片段14个，并用RACE技术在香蕉果实中 克隆到了 5个重要基因的全长序列，分别命名为3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸_7_磷 酸合酶基因（ 3_dexy-D-arabin〇-heptulosonate-7-phosphate synthase, MaDAHPSl)、 5細醇丙丽醜莽草酸_3-憐酸合成酶基因（S-enoipyruvyishikimateS-phosphate synthase, MaEPSPSl)、异分支合酶基因（isoch〇rismate synthase, MalCS)、肉桂醇脱氧 酶基因 （Cinnamyl alcohol dehydrogenase, MaCADl)、肉桂酸 4-羟基裂解酶基因 （Cinnama te-4-hydroxylase, MaC4H2)〇
[0035] 1· 1 MaDAHPSl 克隆
[0036]提取香蕉（Musa acuminate L_ AAA group cv. Brazilian,中国热带农业科学院热 带生物技术研究所澄迈香蕉种植园）根系的总RNA，反转录得到cDNA,按照如下体系进行 PCR扩增：
[0037]以反转录cDNA为模板，以D1-3'以及D2-3'作为5，RACE反应的3,端弓丨物和5,端 接头引物ptr5 '进行半嵌套PCR扩增，经过2轮PCR扩增获得883bp长PCR产物。以D3-5， 和3'端接头引物ptr3'进行PCR扩增基因3'端序列，获得424bp长PCR产物。对转录组 序列、5'端序列和3'端序列分析获得该基因的全长序列，以此全长序列设计引物DAH5,和 DAH3'，以反转录cDNA为模板，按下列PCR反应体系和条件进行PCR扩增得产物。
[0038] PCR 引物：
[0039] D1-3' ：5' -CTGTTCGCTGTGCTCAGTGAAATCG-3,；
[0040] D2-3' ：5' -TGGCAGTATGCCCGGATCATTTCTCTG-3' ；
[0041 ] D3-5 ' ： 5，-ATTGCCAATCCTCTTGGGATCAAG-3，。
[0042] cDNA接头引物：
[0043] ptr5, ：5, -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3,；
[0044] ptr3, ：5, -TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3，。
[0045] 基因全长引物：
[0046] DAH-5,引物：5' -ATGGCCCTCGCCAGCGGCTC-3,；
[0047] DAH-3 ' 引物：5 ' -TCATAAGTGGAAAAGGCATAG-3 '。
[0048] PCR反应体系：
[0049] 在0. 2mL离心管中依次加入：
[0050]
【权利要求】
1. 一种基因标记物，其特征在于，所述基因标记物包含标记基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、 MalCS、MaCADl和MaC4H2中的一种或多种，MaDAHPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， MaEPSPSl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，MalCS的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示， MaCADl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，MaC4H2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
2. 根据权利要求1所述的基因标记物，其特征在于，所述基因标记物包含标记基因 MaDAHPSl、MaEPSPSl、MalCS、MaCADl 和 MaC4H2。
3. -种筛选抗枯萎病香蕉品种的方法，其特征在于，包括以下步骤： 将香蕉幼苗接种镰刀菌，然后确定权利要求1所述的基因标记物的表达水平，筛选基 因标记物的表达水平提商的香焦幼苗。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在接种镰刀菌之前，先确定香蕉幼苗中权 利要求1所述的基因标记物的表达水平。
5. 权利要求1所述的基因标记物在筛选抗枯萎病香蕉品种中的应用。
6. -种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述的基因标记物 的表达的探针。
【文档编号】C12Q1/68GK104232759SQ201410405969
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】金志强, 王卓, 徐碧玉, 刘菊华, 张建斌, 贾彩红, 苗红霞 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所