miRNA捕获探针及其修饰电极与捕获探针互补链及其修饰碳纳米管-金磁纳米粒复合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种miRNA捕获探针及其修饰电极，以及miRNA捕获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，并基于上述修饰电极和修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物建立了一种检测miRNA的方法，可以实现对miRNA的快速、灵敏、特异和稳定检测。
【专利说明】m i RNA捕获探针及其修饰电极与捕获探针互补链及其修饰 碳纳米管-金磁纳米粒复合物
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物、材料和电化学检测【技术领域】，涉及一种捕获探针及其修饰电极， 与捕获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，还涉及用上述修饰电极和修 饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物检测生物活性小分子的方法。
【背景技术】
[0002] 微小RNA (miRNA)是一类长度为21?25个核苷酸的内源性非编码RNA，能够与靶 基因3'非翻译区结合在转录后水平负调控基因的表达。miRNA与人类疾病的发生、发展密 切相关，且血液、尿液中的miRNA稳定性强、重复性好，因此可作为多种疾病尤其是肿瘤诊 断的非创伤性生物标志物。
[0003] 目前用于miRNA检测的方法主要有Northern印迹、基因芯片和实时定量 PCR(qRT-PCR)等。Northern印迹是首先被用于半定量检测miRNA的实验技术，至今仍被 视为是检测miRNA的金标准，由于其存在要求的样本量大、灵敏度低、操作耗时且不适用于 高通量检测等缺点，通常用于miRNA检测结果的验证。基因芯片技术是当前广泛用于检测 miRNA水平的高通量技术，该技术可一次性对大量样本进行持续、快速、有效的检测，但同样 存在检测所需样本量较大、耗费较高、不同实验室之间结果可重复性差等诸多不足，一般多 用于miRNA的初筛。qRT-PCR是生物医学领域中较常用的miRNA检测方法，系通过反应体系 中荧光强度的变化对目标miRNA片段的扩增进行实时检测，具有敏感性高、准确度高、方法 简单等优点，但对引物设计及实验操作要求较高。因此，急需建立一种操作简便、具有较高 特异性和敏感性的检测miRNA的新方法。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miRNA捕获探针及其修饰电极，与miRNA捕 获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，并基于上述修饰电极和修饰的碳 纳米管-金磁纳米粒复合物建立一种检测miRNA的新方法，可以实现对miRNA的快速、灵 敏、特异和稳定检测。
[0005] 经研究，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1. miRNA捕获探针，为单链DNA，从5'端至3'端依次含有与miRNA部分互补片段、 核酸内切酶酶切位点以及与辅助探针部分互补片段，其3'末端还修饰有巯基；所述辅助探 针为单链DNA，从5'端至3'端依次含有与捕获探针部分互补片段以及与miRNA部分互补 片段；所述miRNA捕获探针中含有的与miRNA部分互补片段和所述辅助探针中含有的与 miRNA部分互补片段不重叠。
[0007] 进一步，所述miRNA捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述辅助探针的 核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0008] 更进一步，所述miRNA 捕获探针为 5' -CCACTTCAGTTAT-CCTCAGCGTGGAAAA-(CH2)6- SH-3';所述辅助探针为 5' -CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3';
[0009] 2. miRNA捕获探针修饰电极，由以下方法制得：将经打磨、抛光、洗涤、干燥处理的 金电极表面用miRNA捕获探针修饰后，再用己烷巯醇封闭非特异性吸附位点，即得miRNA捕 获探针修饰电极。
[0010] 进一步，所述miRNA捕获探针修饰电极由以下方法制得：用润湿的麂皮打磨金电 极，然后依次用加有〇. 3μηι和0. 05μηι A1203粉末的麂皮对电极进行抛光打磨，每次打磨后 将电极用水洗净，再依次用乙醇和水超声洗涤，处理后的金电极干燥备用；然后在处理后的 金电极表面滴加2 μ Μ的miRNA捕获探针溶液，修饰过夜，用水清洗电极，再在电极表面滴加 ImM的己烷巯醇溶液，孵育40分钟封闭非特异性吸附位点，用水清洗电极，即得miRNA捕获 探针修饰电极。
[0011] 3. miRNA捕获探针互补链，所述互补链与miRNA捕获探针中核酸内切酶剪切点下 游序列互补，其3'末端还修饰有氨基。
[0012] 进一步，所述miRNA捕获探针互补链的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0013] 更进一步，所述 miRNA 捕获探针互补链为 Y -TTTTCCACGCTGA- (CH2) 6-NH2-3、
[0014] 4. miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，由以下方法制得： 将羧基化碳纳米管分散于含有TODA和NaCl的水溶液中，超声，离心，沉淀用水洗涤，得到 roDA功能化的碳纳米管；再将roDA功能化的碳纳米管重新分散于金磁纳米粒溶液中，孵 育，磁性分离，得到碳纳米管-金磁纳米粒复合物；再将碳纳米管-金磁纳米粒复合物与甲 苯胺蓝和miRNA捕获探针互补链反应，使甲苯胺蓝和miRNA捕获探针互补链修饰到金磁纳 米粒的表面，磁性分离，即得到miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合 物。
[0015] 进一步，所述miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物由以 下方法制得：将羧基化碳纳米管分散于含有0. 2wt% TODA和0. 5M NaCl的水溶液中，超声 30min，离心，沉淀用水洗涤，得到TODA功能化的碳纳米管；再将TODA功能化的碳纳米管重 新分散于0. 5mg/mL的金磁纳米粒溶液中，孵育2小时，磁性分离，得到碳纳米管-金磁纳米 粒复合物；再将碳纳米管-金磁纳米粒复合物与lmg/mL的甲苯胺蓝溶液和2 μ Μ的miRNA 捕获探针互补链溶液在4°C反应12小时，磁性分离，即得到miRNA捕获探针互补链修饰的碳 纳米管-金磁纳米粒复合物。
[0016] 本发明中所述金磁纳米粒是指具有核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米磁 性粒子，核表面是金的壳层。
[0017] 5.利用miRNA捕获探针修饰电极与miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金 磁纳米粒复合物检测miRNA的方法，包括以下步骤：以miRNA捕获探针修饰电极为工作电 极、钼电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组建miRNA电化学生物传感器；在miRNA捕 获探针修饰电极表面滴加含有辅助探针、核酸内切酶和待测miRNA的溶液，37°C孵育，用水 清洗电极表面，待干后再滴加 miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物， 37°C孵育，用水清洗电极表面，然后在PBS缓冲液中进行差动脉冲伏安法扫描，检测电流峰 值，进而对待测miRNA进行定性和定量分析。
[0018] 进一步，利用miRNA捕获探针修饰电极与miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米 管-金磁纳米粒复合物检测miRNA的方法，包括以下步骤：在miRNA捕获探针修饰电极表面 滴加含有1 μ Μ辅助探针、5U Nt. BbvCI内切酶和待测miRNA的1 XNEB缓冲液，37°C孵育1 小时，用水清洗电极表面，待干后再滴加 miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米 粒复合物，37°C孵育1. 5小时，用水清洗电极表面，然后在0. 1Μ、ρΗ7. 4的PBS缓冲液中进行 差动脉冲伏安法扫描，电位扫描范围为-〇. 6V?0V，脉冲宽度为0. 05s，检测电流峰值，进而 对待测miRNA进行定性和定量分析。
[0019] 上述miRNA检测方法的原理如下：PDDA功能化后的碳纳米管可以吸附大量的金磁 纳米粒，电活性物质甲苯胺蓝和miRNA捕获探针互补链可修饰到金磁纳米粒的表面，得到 碳纳米管-金磁纳米粒复合物。当溶液中存在目标miRNA时，其首先与电极上修饰的miRNA 捕获探针以及溶液中加入的辅助探针杂交，形成"Y"型结构，进而被核酸内切酶识别并剪 切，在金电极上形成大量的miRNA捕获探针片段，该miRNA捕获探针片段与碳纳米管-金 磁纳米粒复合物上修饰的miRNA捕获探针互补链杂交，从而将碳纳米管-金磁纳米粒复合 物结合至电极表面，由于碳纳米管-金磁纳米粒复合物上携带了大量的电活性物质甲苯胺 蓝，从而可以通过检测甲苯胺蓝的电流信号达到快速检测目标miRNA的目的。
[0020] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种miRNA捕获探针及其修饰电极，与 miRNA捕获探针互补链及其修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，并基于上述修饰电极和 修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物建立了一种检测miRNA的新方法，可以实现对miRNA 的快速、灵敏、特异和稳定检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明：
[0022] 图1为金电极修饰过程的电化学表征，其中A为铁氰化钾的CV表征曲线；B为碳 纳米管-金磁纳米粒复合物修饰前后的DPV表征曲线。
[0023] 图2为金电极与碳纳米管-金磁纳米粒复合物孵育时间的优化。
[0024] 图3为miRNA电化学传感器检测不同浓度miRNA的DPV表征曲线（A)和标准曲线 ⑶。
[0025] 图4为miRNA电化学生物传感器的特异性实验结果。
[0026] 图5为miRNA电化学生物传感器的稳定性实验结果。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
[0028] 主要仪器和试剂：CHI760D型电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司； KQ-5200B型超声器清洗器购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；金电极、饱和甘汞电极、 钼电极和0.3μπι、0.05μπι A1203粉末购自天津艾达恒昊科技发展有限公司。金磁纳米粒 (直径50nm，为核壳结构的超顺磁性复合微粒，其核为纳米磁性粒子，核表面是金的壳层） 购自陕西省西安市金磁纳米生物技术有限公司；羧基化碳纳米管（CNTs)购自广东省深圳 市纳米技术有限公司；自主设计的miRNA捕获探针（CP)、辅助探针（AP)、miRNA捕获探针互 补链以及目标miRNA等单链核酸由上海生物生工有限公司合成；Nt. BbvCI内切酶及缓冲液 购自美国New England BioLabs公司；甲苯胺蓝（Tb)、己烧巯醇（96%, HT)和聚二烯丙基 二甲基氯化铵（PDDA)购自美国Sigma公司。
[0029] miRNA捕获探针、辅助探针、miRNA捕获探针互补链以及目标miRNA的序列如下：
[0030] miRNA 捕获探针：5，-CCACTTCAGTTATCCTCAGCGTGGAAAA- (CH2) 6-SH-3 ' （SEQ ID No. 1)；
[0031] 辅助探针：5，-CCACGCTGAGGAAATCACAGTACTGTA-3，（SEQ ID No. 2);
[0032] miRNA 捕获探针互补链：5' -TTTTCCACGCTGA-^HA-NHfS' (SEQ ID No. 3);
[0033] 目标 miRNA :5，-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3，（SEQ ID No. 4)。
[0034] 实施例1、miRNA捕获探针修饰电极的制备
[0035] 用润湿的麂皮打磨金电极，然后依次用加有0.3 μ m和0.05 μ m A1203粉末的麂皮 对电极进行抛光打磨，每次打磨后将电极用超纯水洗净，再依次于乙醇和超纯水中超声洗 涤5min，处理后的金电极干燥备用；在处理后的金电极表面滴加20 μ L2 μ Μ的捕获探针溶 液，室温修饰过夜，用超纯水清洗电极，再在电极表面滴加20 μ LlmM的己烷巯醇溶液，室温 孵育40分钟封闭非特异性吸附位点，用超纯水清洗电极，即得到miRNA捕获探针修饰电极， 4 °C储存备用。
[0036] 实施例2、miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物的制备
[0037] 将2mg羧基化碳纳米管分散于4mL含有0· 2wt % TODA和0· 5M NaCl的水溶液中， 超声30min得到均一的黑色溶液，高速离心，沉淀用水洗涤3次，得到TODA功能化的碳纳米 管。将H)DA功能化的碳纳米管重新分散于2mL0. 5mg/mL的金磁纳米粒溶液中，孵育2h，磁 性分离，得到碳纳米管-金磁纳米粒复合物。将碳纳米管-金磁纳米粒复合物与4mLlmg/mL 的甲苯胺蓝溶液和200 μ L2 μ Μ的miRNA捕获探针互补链溶液在4°C反应12h，磁性分离，即 得到miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物。
[0038] 实施例3、miRNA电化学生物传感器的组建及用其检测miRNA的方法
[0039] 以miRNA捕获探针修饰电极为工作电极、钼电极为对电极、饱和甘汞电极为参比 电极，组建miRNA电化学生物传感器。
[0040] 在miRNA捕获探针修饰电极表面滴加10 μ L含有1 μ Μ辅助探针、5U Nt. BbvCI内 切酶和目标miRNA的1XNEB缓冲液，37°C孵育lh，用超纯水清洗电极表面，待干后再滴加 10 μ L碳纳米管-金磁纳米粒复合物，37°C孵育1. 5h，用超纯水清洗电极表面，然后在0. 1M、 pH7. 4的PBS缓冲液中进行差动脉冲伏安法（DPV)扫描，电位扫描范围为-0. 6V?0V，脉冲 宽度为〇. 〇5s，采样宽度为0. 0167s，检测电流峰值。同时与未经碳纳米管-金磁纳米粒复 合物修饰的电极进行对照。
[0041] 本发明研究了金电极修饰过程中的峰电流变化，用循环伏安法测定的CV曲线表 征（图1)。图1A为铁氰化钾的CV表征曲线，电位扫描范围为-0. 2V?0. 6V，电位扫描速 率为50mv/s，其中a为裸金电极的CV曲线；b为miRNA捕获探针修饰后的CV曲线，可见 miRNA捕获探针修饰在一定程度上阻碍了金电极表面的电子传输，因此峰电流值减小；c为 己烷巯醇封闭后的CV曲线，可见己烷巯醇在封闭非特异性吸附位点的同时也阻碍了电子 的传输，因此峰电流值进一步减小；d为miRNA捕获探针修饰电极与辅助探针、核酸内切酶 和目标miRNA共同孵育后的CV曲线，峰电流值有所增强，说明核酸内切酶成功识别了目标 miRNA与miRNA捕获探针和辅助探针杂交形成的"Y"型结构并对miRNA捕获探针进行了剪 切，从而使电极表面的位阻减小，电流增大。图1B为碳纳米管-金磁纳米粒复合物修饰前 后的DPV表征曲线，其中d与图1A中的d相对应，为碳纳米管-金磁纳米粒复合物修饰前 的DPV曲线，由于含有电活性物质甲苯胺蓝的碳纳米管-金磁纳米粒复合物没有修饰到电 极表面，因此DPV曲线无明显的峰值，e是碳纳米管-金磁纳米粒复合物修饰后的DPV曲线， 可以看出有明显的DPV响应。
[0042] 本发明在研究过程中对影响miRNA电化学生物传感器电流响应的主要参数（金电 极与碳纳米管-金磁纳米粒复合物的孵育时间）进行了优化。以500fM目标miRNA为检测 对象，金电极与碳纳米管-金磁纳米粒复合物的孵育时间由30min逐渐增加到llOmin，结 果如图2所示，传感器的峰电流逐渐升高并于90min左右达到最大值，之后继续增加孵育时 间，峰电流基本保持不变，说明90min时金电极表面结合的碳纳米管-金磁纳米粒复合物已 达到饱和，因此金电极与碳纳米管-金磁纳米粒复合物的孵育时间优选为90min。
[0043] 在优化条件下，本发明对miRNA电化学生物传感器的检测性能进行了考察。使 用miRNA电化学生物传感器检测不同浓度的miRNA，结果如图3所示，可见随着miRNA浓 度的不断增加，其峰电流也随之增大（图3A);当miRNA浓度在5. 0X10_16?2. 0X10_9M 范围内时，其浓度的对数值与峰电流呈良好的线性关系（图3B)，线性回归方程为：1 = 8. 9441gC+144. 5,相关系数R为0. 9945。上述结果表明本发明的miRNA电化学生物传感器 具有较宽的线性范围。
[0044] 本发明对miRNA电化学生物传感器的特异性进行了考察。使用miRNA电化学生物 传感器分别检测空白（blank)，5pM AFP，5pM PDGF，5pM Hb，5pM CEA，由 5pM AFP、5pM PDGF、 5pM Hb、5pM CEA四种干扰物与50fM目标miRNA组成的混合物（mixture)，以及50fM目标 miRNA (target)，结果如图4所示，可见即使干扰物的浓度为目标miRNA的100倍，也不会对 检测结果产生明显的干扰，说明本发明的miRNA电化学生物传感器具有良好的选择性。
[0045] 本发明对miRNA电化学生物传感器的稳定性进行了考察。使用miRNA电化学生物 传感器在含有5pM目标miRNA的PBS缓冲液中连续CV扫描30圈，结果如图5所示，峰电流 变化为（34. 6-34. 1)/34. 6 = 1. 4%，说明本发明的miRNA电化学生物传感器具有良好的稳 定性。
[0046] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1. miRNA捕获探针，其特征在于，为单链DNA，从5'端至3'端依次含有与miRNA部分互 补片段、核酸内切酶酶切位点以及与辅助探针部分互补片段，其3'末端还修饰有巯基；所 述辅助探针为单链DNA，从5'端至3'端依次含有与捕获探针部分互补片段以及与miRNA部 分互补片段；所述miRNA捕获探针中含有的与miRNA部分互补片段和所述辅助探针中含有 的与miRNA部分互补片段不重叠。
2. 如权利要求1所述miRNA捕获探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 示；所述辅助探针的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 权利要求1或2所述miRNA捕获探针修饰电极，其特征在于，由以下方法制得：将经 打磨、抛光、洗涤、干燥处理的金电极表面用miRNA捕获探针修饰后，再用己烷巯醇封闭非 特异性吸附位点，即得miRNA捕获探针修饰电极。
4. 如权利要求3所述miRNA捕获探针修饰电极，其特征在于，由以下方法制得：用润 湿的麂皮打磨金电极，然后依次用加有〇. 3 μ m和0. 05 μ m A1203粉末的麂皮对电极进行抛 光打磨，每次打磨后将电极用水洗净，再依次用乙醇和水超声洗涤，处理后的金电极干燥备 用；然后在处理后的金电极表面滴加2 μ Μ的miRNA捕获探针溶液，修饰过夜，用水清洗电 极，再在电极表面滴加 ImM的己烷巯醇溶液，孵育40分钟封闭非特异性吸附位点，用水清洗 电极，即得miRNA捕获探针修饰电极。
5. 权利要求1或2所述miRNA捕获探针互补链，其特征在于，所述互补链与miRNA捕获 探针中核酸内切酶剪切点下游序列互补，其3'末端还修饰有氨基。
6. 如权利要求5所述miRNA捕获探针互补链，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
7. 权利要求5或6所述miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物， 其特征在于，由以下方法制得：将羧基化碳纳米管分散于含有TODA和NaCl的水溶液中，超 声，离心，沉淀用水洗漆，得到TODA功能化的碳纳米管；再将TODA功能化的碳纳米管重新分 散于金磁纳米粒溶液中，孵育，磁性分离，得到碳纳米管-金磁纳米粒复合物；再将碳纳米 管-金磁纳米粒复合物与甲苯胺蓝和miRNA捕获探针互补链反应，使甲苯胺蓝和miRNA捕 获探针互补链修饰到金磁纳米粒的表面，磁性分离，即得到miRNA捕获探针互补链修饰的 碳纳米管-金磁纳米粒复合物。
8. 如权利要求7所述miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物，其 特征在于，由以下方法制得：将羧基化碳纳米管分散于含有0. 2wt% TODA和0. 5M NaCl的 水溶液中，超声30min，离心，沉淀用水洗涤，得到TODA功能化的碳纳米管；再将TODA功能 化的碳纳米管重新分散于0. 5mg/mL的金磁纳米粒溶液中，孵育2小时，磁性分离，得到碳纳 米管-金磁纳米粒复合物；再将碳纳米管-金磁纳米粒复合物与lmg/mL的甲苯胺蓝溶液和 2 μ Μ的miRNA捕获探针互补链溶液在4°C反应12小时，磁性分离，即得到miRNA捕获探针 互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物。
9. 利用权利要求3或4所述miRNA捕获探针修饰电极与权利要求7或8所述miRNA捕获 探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物检测miRNA的方法，其特征在于，以miRNA 捕获探针修饰电极为工作电极、钼电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组建miRNA电 化学生物传感器；在miRNA捕获探针修饰电极表面滴加含有辅助探针、核酸内切酶和待测 miRNA的溶液，37°C孵育，用水清洗电极表面，待干后再滴加 miRNA捕获探针互补链修饰的 碳纳米管-金磁纳米粒复合物，37°C孵育，用水清洗电极表面，然后在PBS缓冲液中进行差 动脉冲伏安法扫描，检测电流峰值，进而对待测miRNA进行定性和定量分析。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，在miRNA捕获探针修饰电极表面滴加含有 1 μ Μ辅助探针、5U Nt. BbvCI内切酶和待测miRNA的1XNEB缓冲液，37°C孵育1小时，用水 清洗电极表面，待干后再滴加 miRNA捕获探针互补链修饰的碳纳米管-金磁纳米粒复合物， 37°C孵育1. 5小时，用水清洗电极表面，然后在0. 1M、pH7. 4的PBS缓冲液中进行差动脉冲 伏安法扫描，电位扫描范围为-〇. 6V?0V，脉冲宽度为0. 05s，检测电流峰值，进而对待测 miRNA进行定性和定量分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104152449SQ201410406476
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】项贵明, 蒲晓允, 张立群, 蒋栋能, 刘飞, 刘畅, 刘琳琳 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院