一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基及其应用。本发明的蜡蚧轮枝菌的选择性培养基是由下列组分制成的：燕麦片10-20g，琼脂粉15-20g、细菌抑菌剂0.1-l.Og、真菌抑菌剂0.1-1.0g和蒸馏水1000ml。本发明的蜡蚧轮枝菌的选择性培养基具有以下优点：利用抗生素对细菌的抑杀作用，完全排除了细菌对靶标真菌检测的干扰；利用不同真菌对真菌抑菌剂的敏感性存在差异的特性，以及不同真菌对碳源利用能力的差异，消除待测样品中其他真菌的影响，从而达到有效定量检测蜡蚧轮枝菌的目的；该培养基的组分易得、价格低廉、制备简单、使用方便。
【专利说明】一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物领域，具体涉及一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基及其应 用。
【背景技术】
[0002] 錯阶轮枝菌（Lecanicillium Lecanii)是重要的虫生真菌，对刺吸式害虫具有很 好的防治效果，该菌在西欧、苏、美、中等许多国家和地区已有广泛应用。众所周知，生防菌 对作物害虫的防治效果与生防菌的施用时间、单次施用剂量、施用次数密切相关，因此，针 对不同作物或生境制定适宜的生防菌施用方法显得尤为重要。生防菌在自然界中天然存 在，研究其田间种群自然波动规律，以及人工投放施用后生防菌的延续或存活状况，对指导 生防菌使用具有重要指导意义。土壤是生防菌的最主要宿存场所，同时也是所有微生物的 主要活动场所，因此，生防菌土壤宿存的研究首先要排除土壤其它微生物的干扰。针对土壤 中虫生真菌的研究方法有限，主要有选择性培养基、虫饵诱菌法和PCR检测法。具体到蜡 蚧轮枝菌来说，虫饵诱菌中的诱虫对蜡蚧轮枝菌不敏感，无法对蜡蚧轮枝菌有效诱集。理论 上，PCR法可通过设计引物或探针特异性地检测靶标菌的核酸，然而土壤腐殖酸、微生物及 其代谢物往往严重干扰PCR的检测灵敏度，此外，PCR法也无法仅可以反映靶标菌的核酸状 况，无法反应靶标菌活菌的状况。选择性培养基可有效反应靶标菌活菌的状况，已成功应用 于白僵菌、绿僵菌等，而蜡蚧轮枝菌的选择性培养基依然缺乏。目前，蜡蚧轮枝菌在田间延 续与存活的基础研究相当缺乏，不利于指定适宜于的蜡蚧轮枝菌使用方法，严重制约了该 菌的应用与推广。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培 养基及其应用方法，能有效排除土壤杂菌干扰，从而快速准确的对蜡蚧轮枝菌的活菌量进 行检测，该培养基具备价格低廉、制备方便的优点
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述选择性培养基的应用。
[0005] 为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：一种蜡蚧轮枝菌选择性培养基，每 升该选择性培养基由如下组分组成：燕麦片10_20g，琼脂粉15-20g、细菌抑菌剂0. 1-1. 0g、 真菌抑菌剂〇. 1-1. Og和蒸馏水1000ml。
[0006] 作为一种优选方案，每升上述选择性培养基由如下组分组成：燕麦片15g，琼脂粉 17g、细菌抑菌剂0. 5g和真菌抑菌剂0. 5g。
[0007] 本发明所述的细菌抑菌剂为硫酸链霉素、氯霉素、青霉素中的一种或它们的混合 物。
[0008] 本发明所述的真菌抑菌剂为十二烷基胍醋酸盐、十六烷基三甲基溴化铵、多菌灵 中的一种或它们的混合物。
[0009] 上述蜡蚧轮枝菌选择性培养基的制作方法：称取燕麦15_20g，倒入锅中，加蒸馏 水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉15-20g和真菌抑菌剂0. 1-1. Og，再 次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌25min，待培养基冷却至不烫手时，加入 细菌抑菌剂〇. 1-1. 〇g，充分混匀后，倒入灭过菌的直径约9cm的培养皿中，每皿约20mL，冷 凝后低温保存备用，保存时间不超过2周。
[0010] 本发明选择性培养基可以用于定量检测蜡蚧轮枝菌。检测方法是：以选择性培养 基制备平板，将待测样品稀释后取50-100 μ 1涂布于平板上，25°C黑暗培养2-5天，培养完 毕后进行计数。
[0011] 与现有技术比较，本发明具有如下有益效果：利用抗生素对细菌的抑杀作用，排除 细菌对靶标真菌检测的干扰；利用不同真菌对真菌抑菌剂的敏感性存在差异的特性，以及 不同真菌对碳源利用能力的差异，消除待测样品中其他真菌的影响；该培养基具有制备简 单、组分易得，价格低廉的优点。
【具体实施方式】
[0012] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并不因此将本发明限制在所述的实施 例范围之中。
[0013] 实施例1 :一种定量检测錯阶轮枝菌的选择性培养基，其特征在于：燕麦15g，倒入 锅中，加蒸馏水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉17g和十六烷基三甲 基溴化铵〇. 5g，再次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌25min，待培养基冷却 至不烫手时，加入氯霉素〇. 5g，充分混匀后，倒入灭过菌的直径约9cm的培养皿中，每皿约 20mL，冷凝后低温保存备用，保存时间不超过2周。
[0014] 实施例2 :-种定量检测錯阶轮枝菌的选择性培养基，其特征在于：燕麦15g，倒入 锅中，加蒸馏水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉17g和多菌灵0. 5g，再 次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌25min，待培养基冷却至不烫手时，加入 硫酸链霉素〇. 5g，充分混勻后，倒入灭过菌的直径约9cm的培养皿中，每皿约20mL，冷凝后 低温保存备用，保存时间不超过2周。
[0015] 实施例3 :-种定量检测錯阶轮枝菌的选择性培养基，其特征在于：燕麦15g，倒入 锅中，加蒸馏水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉17g、十六烷基三甲基溴 化铵〇. 3g和多菌灵0. 3g，再次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌25min，待 培养基冷却至不烫手时，加入氯霉素〇. 5g，充分混匀后，倒入灭过菌的直径约9cm的培养皿 中，每皿约20mL，冷凝后低温保存备用，保存时间不超过2周。
[0016] 实施例4 :一种定量检测錯阶轮枝菌的选择性培养基，其特征在于：燕麦15g，倒入 锅中，加蒸馏水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉17g、十六烷基三甲基溴 化铵〇. 3g和十二烷基胍醋酸盐0. 3g，再次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌 25min，待培养基冷却至不烫手时，加入硫酸链霉素0. 5g，充分混匀后，倒入灭过菌的直径约 9cm的培养皿中，每皿约20mL，冷凝后低温保存备用，保存时间不超过2周。
[0017] 实施例5 :蜡蚧轮枝菌和选定杂菌在选择性培养基上的生长状况
[0018] 培养待测真菌的斜面中加入5ml 0. 05%吐温80灭菌水，充分涡旋即得孢子悬浮 液，用血球计数调节孢子浓度到IO5个孢子/ml，采用点孢法，接种菌株到选择性培养基上， 25°C黑暗培养。蜡蚧轮枝菌在选择性培养基上生长迅速，生长3天时，菌落直径4-6mm，菌 落整体蓬松、绒毛状，白色；球孢白僵菌在选择性培养基上生长相对缓慢，生长3天时，菌落 直径3-4mm，菌落密实，乳白色；金龟子绿僵菌在选择性培养基上生长相对缓慢，菌落直径 2-3mm，菌落中央稀疏向上生长，边缘生长差，白色；曲霉菌、镰刀菌和青霉菌在选择性培养 基不生长，生长3天时未见菌落。
[0019] 实施例6 :选择性培养基对蜡蚧轮枝菌的回收效率
[0020] 配制十六烷基三甲基溴化铵不同浓度的选择性培养基，包括0g/L、0. Ig/L、0. 2g/ 1^、0.38/1、0.48/1、0.58/1和0.68/1。培养蜡蚧轮枝菌的斜面中加入511110.05%吐温80灭 菌水，充分涡旋即得孢子悬浮液，用血球计数调节孢子浓度到IO 3个孢子/ml，取IOOy 1涂 布于不同处理的选择性培养平板上，25°C黑暗培养3天，培养完毕后统计成菌落数，计算回 收效率。每个处理设置3次重复。从表1看出，不同十六烷基三甲基溴化铵的选择性培养 基对蜡蚧轮枝菌的回收效率存在差异，随着十六烷基三甲基溴化铵浓度的增加，蜡蚧轮枝 菌孢子悬浮液在选择性培养基上的回收效率降低；当十六烷基三甲基溴化铵浓度为0. 5g/ L时，蜡蚧轮枝菌的回收效率为95. 7%，而当十六烷基三甲基溴化铵浓度为0. 6g/L时，蜡蚧 轮枝菌的回收效率显著降低至85. 8%。
[0021] 表1蜡蚧轮枝菌在不同浓度十六烷基三甲基溴化铵下的回收率
【权利要求】
1. 一种定量检测蜡蚧轮枝菌的选择性培养基，其特征在于：该选择性培养基由如下组 分组成：燕麦片10-20g，琼脂粉15-20g、细菌抑菌剂0. 1-1. Og、真菌抑菌剂0. 1-1. Og和蒸 馏水 1000ml。
2. 权利要求1所述的选择性培养基，其特征在于：所述的细菌抑菌剂为硫酸链霉素、氯 霉素、青霉素中的一种或它们的混合物；所述的真菌抑菌剂为十二烷基胍醋酸盐、十六烷基 三甲基溴化铵、多菌灵中的一种或它们的混合物。
3. 权利要求1所述的选择性培养基的制备方法，其特征在于：称取燕麦15-20g，倒入 锅中，加蒸馏水煮30分钟，用4层纱布过滤去残渣，滤液加入琼脂粉15-20g和真菌抑菌剂 0. 1-1. 0g，再次煮沸，蒸馏水定容到1000ml，121°C高压湿热灭菌25min，待培养基冷却至不 烫手时，加入细菌抑菌剂〇. 1-1. 〇g，充分混匀后，倒入灭过菌的直径约9cm的培养皿中，每 皿约20mL，冷凝后低温保存备用，保存时间不超过2周。
4. 权利要求1所述的选择性培养基的使用方法，其特征在于：以所述选择性培养基制 备平板，将待测样品稀释后取50-100 μ 1涂布于平板上，25°C黑暗培养2-5天，培养完毕后 进行计数。
5. 权利要求1所述的选择性培养基的应用，其特征在于：所述的选择性培养基中十六 烷基三甲基溴化铵的浓度对蜡蚧轮枝菌的回收效率影响差异，最适宜的十六烷基三甲基溴 化铵浓度为〇. 5g/L，此时蜡蚧轮枝菌的回收效率为95. 7% ;土壤悬浮液稀释倍数对选择 性平板上蜡蚧轮枝菌和杂菌的数量有显著影响，当以IO5个孢子/g 土剂量投放时，最适宜 的稀释倍数为100倍，此时选择性平板上蜡蚧轮枝菌菌落数适中，杂菌数量也很少，近乎没 有。
【文档编号】C12Q1/06GK104212874SQ201410419374
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】张艳军, 谢明, 彭德良 申请人:张艳军, 谢明