一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用，视网膜色素上皮细胞培养基包括第一RPE细胞培养基和第二RPE细胞培养基；在1.5周内分别使用以上两种培养基，可以快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞，培养得到的RPE是多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞，并具有正常的生物学功能。与现有技术相比，本发明在使用常规实验耗材的前提下，1.5周内即可快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞，成本较低，且扩增速度很快。
【专利说明】—种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培养基及其用途，尤其是涉及一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用，属于生物医学领域。
【背景技术】
[0002]老年性黄斑变性(Age-relatedMacular Degenerat1n, AMD)是一种在老年人群中多发的眼底疾病。AMD临床表现为中心视力进行性减退，从而引起阅读和其他行为障碍。前期研究工作发现AMD的形成与视网膜色素上皮细胞(RPE)对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降相关，未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并恢复视力的有效方法。细胞替代治疗就是通过外科手术剥离患者病变的RPE细胞，再将各种来源的RPE细胞以悬浮液或聚合物支架为载体移植到有RPE遗传缺陷动物的视网膜下腔，可以有效地延缓光感受器细胞的退行性病变并改善视觉功能。
[0003]RPE是位于脉胳膜和神经视网膜之间的连续单层细胞。其功能主要是维持视网膜细胞的自我更新，这包括吞噬消化脱落的光感受器细胞的视细胞外节盘膜；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。而RPE细胞的这一生理功能异常与AMD的发生密切相关。在细胞替代治疗中，目前常用的RPE移植的供体来源主要是胎儿及成年人的RPE。虽然诱导多能干细胞(iPSC)不涉及破坏胚胎细胞等伦理学问题，而且避免了免疫排斥反应，但是iPSC可能的致瘤性限制了其在治疗AMD中的应用。
[0004]目前，用来移植RPE的胎儿及成年人的RPE数量极为有限，不能满足患者的需求。同时，在以往的RPE培养条件下,不仅需要使用transwell等昂贵耗材,而RPE扩增速度缓慢，不能快速形成具有极性和生物功能的RPE单细胞层。这些都严重束缚了 RPE细胞替代治疗的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种视网膜色素上皮细胞培养基及其应用。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0007]一种视网膜色素上皮细胞培养基，包括第一 RPE细胞培养基和第二 RPE细胞培养基;
[0008]所述的第一 RPE细胞培养基包括以下组分，以500ml计，各组分的用量关系如下:
[0009]α修饰最小必需培养基:380-405ml ；
[0010]NI 补充物:5ml;
[0011]谷氨酰胺:5mL:
[0012]青霉素-链霉素；5mL;
[0013]非必需氨基酸:5mL:
[0014]牛磺酸:100-150mg;
[0015]氢化可的松:10_15μ g ;
[0016]三碘甲状腺原氨酸:0.008-0.012μ g ；
[0017]热灭活胎牛血清:75-100ml ；
[0018]所述的第二 RPE细胞培养基包括以下组分，以500ml计，各组分的用量关系如下:
[0019]α修饰最小必需培养基:430_455ml ；
[0020]NI 补充物:5ml ；
[0021]谷氨酰胺:5mL;
[0022]青霉素-链霉素:5mL ；
[0023]非必需氨基酸:5mL ；
[0024]牛横酸:75_100mg；
[0025]氢化可的松:5-10 μ g ；
[0026]三碘甲状腺原氨酸:0.003-0.008 μ g ；
[0027]热灭活胎牛血清:25-50ml。
[0028]所述的第一 RPE细胞培养基或第二 RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过0.22 μ M孔径的过滤介质过滤，通过0.22 μ M孔径的过滤介质过滤用来除去可能存在的污染细菌。上述第一 RPE细胞培养基或第二 RPE细胞培养基可在4°C下稳定保存3个月。
[0029]视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。具体包括以下步骤:
[0030](I)提前I~6小时，用α修饰最小必需培养基包被培养瓶，其中α修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是5~20 μ g/mL ；
[0031](2)快速在36~38°C水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管；
[0032](3)将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一 RPE细胞培养基，离心，离心的操作条件为常温,转速为300~500x g,离心时间为3~5分钟；
[0033](4)将步骤(3)锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一 RPE细胞培养基重悬细胞；
[0034](5)将步骤⑴中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤⑷重悬后的细胞，混匀；
[0035](6)将培养瓶放置于培养箱中培养,培养箱的条件为36~38°C,4.5~5.5% CO2,90~100%湿度，第3天将培养瓶中的培养基换成第二 RPE细胞培养基；
[0036](7)以后每3天换一次第二 RPE细胞培养基，1.5周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。步骤(7)中扩增后的细胞数目大于5亿个。
[0037]目前，用来移植RPE的胎儿及成年人的RPE数量极为有限，不能满足患者的需求。同时，在以往的RPE培养条件下，不仅需要使用transwell等昂贵耗材，而且RPE扩增速度缓慢，不能快速形成具有极性和生物功能的RPE单细胞层。本发明提供了一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基配方，在使用常规实验耗材的前提下，1.5周内即可快速培养出细胞替代治疗所需的RPE单层细胞。
[0038]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0039]1、本发明的培养基中各组分的配比选择可以保证视网膜色素上皮细胞的最优生长，如果采用其他的配比均不能达到视网膜色素上皮细胞的最优生长。同时在培养基中加入牛磺酸、氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸，并采用本发明的配比可以模拟视网膜色素上皮细胞在体内环境下的生存条件并防止视网膜色素上皮细胞的氧化损伤。
[0040]2、本发明采用的第一 RPE细胞培养基与第二 RPE细胞培养基的组分含量有变化，第一 RPE细胞培养基通过增加血清用量迅速扩增RPE细胞，避免细胞量过低导致细胞形态发生不可逆变化。第二 RPE细胞培养基的组分相应增加了牛磺酸、氢化可的松和三碘甲状腺原氨酸的用量，主要是增强RPE细胞的活力；同时减少血清用量可以避免细胞过度增殖和凋亡，并维持单层细胞，防止多层细胞的不规则聚团出现。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0042]实施例1
[0043]本实施例所需试剂来源如下:
[0044]
【权利要求】
1.一种视网膜色素上皮细胞培养基，其特征在于，包括第一 RPE细胞培养基和第二 RPE细胞培养基； 所述的第一 RPE细胞培养基包括以下组分，以500ml计，各组分的用量关系如下: α修饰最小必需培养基:380-405ml ； NI补充物:5ml ； 谷氨酰胺:5mL ； 青霉素-链霉素:5mL ； 非必需氨基酸:5mL ； 牛横酸:100-150mg ； 氢化可的松:10-15 μ g ； 三碘甲状腺原氨酸:0.008-0.012μ g ； 热灭活胎牛血清:75-100ml ； 所述的第二 RPE细胞培养基包括以下组分，以500ml计，各组分的用量关系如下: α修饰最小必需培养基:430-455ml ； NI补充物:5ml ；
谷氨酰胺:5mL ； 青霉素-链霉素:5mL ； 非必需氨基酸:5mL ； 牛磺酸:75_100mg ； 氢化可的松:5-10 μ g ； 三碘甲状腺原氨酸:0.003-0.008 μ g ； 热灭活胎牛血清:25-50ml。
2.根据权利要求1所述的一种视网膜色素上皮细胞培养基，其特征在于，所述的第一RPE细胞培养基或第二 RPE细胞培养基的各组分在配制培养基前均通过0.22 μ M孔径的过滤介质过滤，除去可能存在的杂菌。
3.—种如权利要求1所述的视网膜色素上皮细胞培养基的应用，其特征在于，视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增。
4.根据权利要求3所述的一种视网膜色素上皮细胞培养基的应用，其特征在于，视网膜色素上皮细胞培养基用于胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增，具体包括以下步骤: (1)提前I~6小时，用α修饰最小必需培养基包被培养瓶； (2)快速在36~38°C水浴槽内解冻胚胎RPE细胞，取出冻存管； (3)将冻存管中的胚胎RPE转移到锥形试管中，并加入第一RPE细胞培养基，离心； (4)将步骤(3)锥形试管中的上清吸走，然后再加入第一RPE细胞培养基重悬细胞； (5)将步骤(1)中培养瓶的培养基吸走，同时加入步骤(4)重悬后的细胞，混匀； (6)将培养瓶放置于培养箱中培养，第3天将培养瓶中的培养基换成第二RPE细胞培养基; (7)以后每3天换一次第二RPE细胞培养基，1.5周后即可观察到具有黑色素的多角形、镶嵌、呈极性排列的单层细胞。
5.根据权利要求4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特征在于，步骤(1)所述的α修饰最小必需培养基的层粘连蛋白浓度是5~20 μ g/mL。
6.根据权利要求4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特征在于，步骤(3)中离心的操作条件为常温，转速为300~500xg，离心时间为3~5分钟。
7.根据权利要求4所述的一种胚胎视网膜色素上皮细胞快速体外扩增的培养基，其特征在于，步骤 (6)中，培养箱的条件为36~38°C，4.5~5.5% CO2,90~100%湿度。
【文档编号】C12N5/071GK104178452SQ201410424794
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】薛志刚, 范国平 申请人:同济大学