一种用于防治二点委夜蛾的家蚕微孢子虫及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于作物害虫生物防治领域的一种用于防治二点委夜蛾的家家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)ED2013，该微孢子虫已于2014年8月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9557。本发明还公开了含有ED2013孢子的杀虫剂及其制备方法。本发明家蚕微孢子虫ED2013对二点委夜蛾幼虫具有较高杀虫活性，杀虫效果好，可有效地降低二点委夜蛾的种群数量，为防治二点委夜蛾提供了一种高效途径；其次，本发明属于生物防治方法，对环境无污染，对其他天敌无害，还可以替代或降低农药使用量，属于环境友好型。
CGMCC No.9557
2014.08.07
【专利说明】-种用于防治二点委夜蛾的家蚕微孢子虫及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物害虫生物防治领域，具体地说涉及一种用于防治二点委夜蛾的家 蚕微孢子虫；以及该家蚕微孢子虫在防治二点委夜蛾上的用途。
【背景技术】
[0002] 二点委夜蛾（学名：Proxenus lepigone (Moschler)，异名：Athetis lepigone) 属鳞翅目夜蛾科委夜蛾属害虫，主要危害玉米幼苗，分布于日本、朝鲜、俄罗斯、欧洲等地。 2005年在河北省发现该虫危害玉米幼苗（姜京宇等，中国植保导刊，2006年7期）；随后陆 续在河北省石家庄、邢台、保定、衡水、邯郸，山东宁津，河南新乡等地区有该害虫为害发生 报道，均为点片状发生，影响不大。但是，2011?2013年二点委夜蛾在黄淮海夏玉米区大爆 发，发生面积大，虫口密度高，为害程度严重（姜玉英，中国植保导刊，2012年02期；刘杰 等，中国植保导刊，2013年09期；李智慧等，植物保护，2013年01期]，已成为影响夏玉米 生产的重要害虫。
[0003] 二点委夜蛾的防治方法主要以化学防治为主，如用有机磷类化学药剂喷雾、毒土 毒饵诱杀、灌根等，由于该虫具有潜伏为害的习性，因此，化学防治存在防治困难、易产生药 害和造成环境污染等问题。此外，还有利用二点委夜蛾性诱剂、趋光性等诱杀方式防治二点 委夜蛾的报道，但其防治效果较差。因此，对于二点委夜蛾目前还没有比较有效的防治方 法。
[0004] 生物防治由于具有对人畜健康无害，无环境污染，不产生抗药性，能有效抑制或消 灭靶标生物等优点，已成为防治有害生物的重要手段。如寻找能控制二点委夜蛾种群数量 的微生物，是减轻其危害的有效途径。
[0005] 微孢子虫（Microsporidia)是一类普遍分布于自然界的细胞内专性寄生真菌，已 报道有150个属，约1200种。微孢子虫易受环境和寄主的诱变，即来自不同地理种群的生 物型和病原性等方面有很大差异。目前，幢虫微粒子虫（Nosema locustae)已作为杀虫 原生动物在美国环境保护署注册，并且进行商品化生产大量用于防治蝗虫（Tanada Y and Kaya Η K. Insect pathology. San Diego ;Academic Press, 1993)，该种微抱子虫制剂在中 国已经广泛应用于草原蝗虫和东亚飞蝗的防治（张龙.生物学通报，1999年第34卷第2 期）。此外，玉米螟微孢子虫很早就被认为是玉米螟自然平衡的重要因素，其对玉米螟生存、 繁殖和越冬均造成严重影响（问锦增等，生物防治通报，1986,2(2);何康来等，中国生物防 治，2002-05-08)。微孢子虫亦对小菜蛾、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等鳞翅目蔬菜害虫具有致病力 (吕要斌等，植物保护学报，2002年第29卷第4期；杨琼等，中国生物防治，2006年第22卷； 郑祥明等，中国病毒学，2000年第15卷）。
[0006] 经检索，没有发现利用微孢子虫防治二点委夜蛾的报道。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一种用于防治二点委夜蛾的家蚕微孢子虫。
[0008] 本发明第二目的在于提供一种杀虫剂。
[0009] 本发明第三目的在于提供上述杀虫剂的制备方法。
[0010] 本发明第四目的在于提供上述家蚕微孢子虫在防治玉米害虫上的用途。
[0011] 实现本发明的技术方案如下：
[0012] 本发明一种家蚕微孢子虫（Nosema bombycis)ED2013,已于2014年8月7日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9557。
[0013] -种杀虫剂，所述的杀虫剂含有上述家蚕微孢子虫（Nosema bombycis)ED2013。
[0014] 上述杀虫剂，所述的杀虫剂的剂型为孢子悬浮液。
[0015] 上述杀虫剂，所述的孢子悬浮液中ED2013孢子的浓度为1X106?1X10 9个孢子 /ml。
[0016] 上述杀虫剂的制备方法，包括如下步骤：
[0017] (1)、在室内温度为25?27°C、相对湿度为60?80%、光照时间为14小时/天的 条件下，用人工饲料对采自于田间的二点委夜蛾成虫进行继代饲养，连续饲养5代及以上， 形成稳定的群体；
[0018] (2)、用浓度为2X 106孢子/ml的ED2013孢子悬浮液浸泡大白菜叶片，晾干大白 菜叶片表面水分，饲喂步骤（1)中所得的二点委夜蛾3龄幼虫，连续饲喂48h，再进行人工饲 料饲养，让孢子在二点委夜蛾幼虫体内增殖；
[0019] (3)、待步骤（2)中饲喂的幼虫长至老熟，将感染微孢子虫的幼虫或者虫尸进行表 面消毒：放入75%酒精中浸泡1?2min，然后放在0. 1 %升汞中消毒1?2min，再以无菌水 洗3?5次，研磨，用4?6层纱布过滤，得组织液；向组织液中加入等体积无菌蒸馏水，然 后进行差速离心，在2500?3000rpm下离心25?30min，取沉淀；向沉淀中加入无菌水，用 漩涡振荡器震荡均匀，在500?700rpm下离心5?lOmin，取上清液；将沉淀再加入无菌水 震匀，然后在800?lOOOrpm下离心5?lOmin，取上清液；将2次所得上清液合并，浓缩； 在2500?3000rpm离心20?25min，取沉淀；用无菌水溶解稀释所得沉淀，即为ED2013孢 子悬浮液。
[0020] 上述方法步骤（1)或（2)中所述的人工饲料的组成成分及其制备方法见专利申请 《一种二点委夜蛾的人工饲料其制备方法与应用》（申请号为：201110404232.x)。
[0021] 上述方法步骤（2)中所述的ED2013孢子悬浮液是将ED2013孢子用无菌水配制而 成。
[0022] -种二点委夜蛾防治剂，其组成成分及其比例为：吐温20(v/v)0. 01%，蔗糖 1%?1.2% (重量比），ED2013孢子悬浮液；其中ED2013孢子的浓度为1X107孢子/ml。
[0023] 上述二点委夜蛾防治剂的制备方法，包括在施药前，用无菌水稀释上述ED2013孢 子悬浮液的浓度至1X 1〇7孢子/ml，再按照体积百分比为0. 01%的比例加入吐温20 (v/v) 和按照重量百分比为1%?1.2%的比例加入蔗糖，混合均匀，得到ED2013孢子悬浮液。
[0024] 一种毒饵，其原料组成成分及其比例为：0. 5X 109?IX 109个孢子/ml的ED2013 孢子悬浮液与麦麸的质量比为1:100。
[0025] 上述毒饵中所述的麦麸的直径2mm。
[0026] 上述毒饵中所述的ED2013的孢子数为0· 5?1 X 109孢子/100g毒饵，含水量为 10 ?12%。
[0027] 上述毒饵，按照如下方法制备：按照比例将上述ED2013孢子悬浮液与麦麸混合均 匀即可。
[0028] 上述家蚕微孢子虫ED2013在防治玉米害虫上的应用。
[0029] 所述的玉米害虫是指二点委夜蛾（Proxenus lepigone (Moschler)。
[0030] ED2013孢子悬浮液的使用方法：用ED2013孢子悬浮液对玉米基部周围进行均匀 喷雾2次，2次喷雾时间间隔2?3天。
[0031] 上述毒饵的使用方法，将毒饵洒在玉米幼苗根基部进行围棵诱杀处理。
[0032] 本发明家蚕微孢子虫ED2013的发现和筛选过程，以及鉴定分类：
[0033] 本发明家蚕微孢子虫ED2013是河北省农林科学院植物保护研究所于2013年10 月在河北高阳玉米田采集患病的二点委夜蛾幼虫中分离得到的。具体过程如下：2013年10 月在河北省高阳县的玉米田中采集患病的二点委夜蛾幼虫，然后研磨、过滤，再进行分子生 物学及形态学的分类鉴定。
[0034] 本发明微孢子虫ED2013的形态鉴定：
[0035] 在光学显微镜（放大400倍）可见该微孢子虫的孢子呈长卵圆形（见图3)，大小 为（2.12±0.09)以111\(1.21±0.08)4 111，比已报道的家香微抱子虫（1^〇861]1&13〇1]^)5^8)的 成熟孢子（3. 6-3. 8) μ mX (2. 0-2. 3) μ m小，初步认为ED2013是一种新的微孢子虫，将该微 孢子虫命名为ED2013。
[0036] 本发明微孢子虫ED2013的分子分类鉴定：
[0037] 以微孢子虫ED2013的基因组DNA为模板，以通用引物18f3和1492r为引物进行 PCR扩增，所得PCR产物为微孢子虫ssurRNA基因片段；其中所述的引物为：
[0038] 18f3:CACCAGGTTGATTCTGCC(SEQ ID No. 1)；
[0039] 1492r:GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID No. 2)〇
[0040] 将扩增所得的PCR产物送交上海生工生物工程有限公司进行测序，再将所得序列 (SEQ ID No. 3)在Genbank中进行Blast比对，结果本发明微孢子虫ED2013的ssurRNA基 因与家蚕微孢子虫（Nosema bombycis)的ssurRNA基因的相似性为99%，利用其构建系统 发育树（见图1)，说明ED2013在分类上属于家蚕微孢子虫（Nosema bombycis)，并且其序 列与任何其他的家蚕微孢子虫不同，说明ED2013为一种新微孢子虫。
[0041] 本发明具有的优点和有益效果：本发明家蚕微孢子虫ED2013对二点委夜蛾初孵 幼虫、2龄、3龄幼虫均具有较高杀虫活性，第8d校正死亡率分别达到91. 6 %、83. 35 %和 70. 4%，杀虫效果好，可有效地降低二点委夜蛾的种群数量，为防治二点委夜蛾提供了一种 高效途径；其次，本发明属于生物防治方法，对环境无污染，对天敌无害，还可以替代或降低 农药使用量，属于环境友好型。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1.本发明家蚕微孢子虫ED2013分类鉴定系统发育树。
[0043] 图2.被本发明家蚕微孢子虫ED2013感染的二点委夜蛾幼虫照片。
[0044] 图3.家蚕微孢子虫ED2013的形态照片（光学显微镜下放大400倍）。
【具体实施方式】
[0045] 实施例1、本发明家蚕微孢子虫ED2013孢子悬浮液的制备
[0046] 按照如下方法进行：
[0047] (1)、在室内温度在25?27°C、光照时间14小时/天、相对湿度60%?80%条件 下，用人工饲料对采自田间的二点委夜蛾（Proxenus lepigone(Moschler)成虫进行继代饲 养5代，形成稳定的二点委夜蛾室内养殖群体。其中所述的人工饲料及其制备方法见专利 申请《一种二点委夜蛾的人工饲料其制备方法与应用》（申请号为：201110404232.x)。
[0048] (2)、ED2013的接种扩繁增殖：用浓度为2X106孢子/毫升的家蚕微孢子虫 (Nosema bombycis)ED2013(于2014年8月7日将保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏 编号为CGMCC No. 9557)孢子悬浮液浸泡大白菜叶片，晾干大白菜叶片表面水分后，饲喂步 骤（1)中的二点委夜蛾3龄幼虫，连续饲喂48h;再用人工饲料饲养至老熟，让孢子在二点 委夜蛾幼虫体内增殖。
[0049] (3)、待步骤（2)中饲喂的幼虫长至老熟（见图2)，将感染微孢子虫的二点委夜蛾 幼虫或者虫尸进行表面消毒：把虫体放入75%酒精中浸泡2min，然后放在0. 1%升汞中消 毒2min，再以灭菌水洗4次，研磨，用5层纱布过滤，得组织液；向组织液中加入等体积无菌 蒸馈水，然后进行差速离心，在3000rpm下离心25min，弃上清液；向沉淀中加入无菌水，用 漩涡振荡器震荡均匀，在600rpm下离心8min，取上清液；将沉淀再加入无菌水，用漩涡振荡 器震荡均匀，然后在900rpm下离心7min，取上清液；将2次所得上清液进行合并，浓缩；在 2500rpm下离心25min，留取沉淀；用无菌水溶解稀释所得沉淀，即得ED2013孢子悬浮液。
[0050] 利用血球计数板计数，得浓度为1 X 109孢子/ml的ED2013孢子悬浮液。
[0051] 实施例2、；不同浓度ED2013孢子悬浮液防治二点委夜蛾对比试验
[0052] 按照如下方法进行：
[0053] 利用血球计数板计数，用无菌水将实施例1制备的ED2013孢子悬浮液分别配制 成1 X 105、1 X 106、1 X 107孢子/ml的孢子悬浮液，浸泡大白菜叶片，晾干大白菜叶片表面水 分，饲喂二点委夜蛾初孵、2龄、3龄、4龄幼虫，饲喂24小时后，再分单管单头正常饲养，每个 处理30头幼虫，3次重复，以无菌蒸馏水处理作为对照，对照自然死亡率在5%内为有效实 验。每天调查各处理死亡虫数，计算矫正死亡率、致死中浓度LC50和致死中时LT50。
[0054] 饲养条件：温度26±1°C、光周期1611:811仏:0)，相对湿度60-70%。
[0055] 数据统计分析应用SPSS 18. 0软件进行数据处理。
[0056] 结果（见表1)本发明家蚕微孢子虫ED2013对二点委夜蛾幼虫致病力随孢子浓度 升高而提高，在接种1X 1〇7孢子/ml处理第8d时对初孵、2龄、3龄幼虫的校正死亡率分别 达到 91. 6%、83· 35%和 70. 4%。
[0057] 表1不同浓度ED2013孢子悬浮液对二点委夜蛾幼虫致病力试验结果
[0058]
【权利要求】
1. 一种家蚕微孢子虫（Nosema bombycis)ED2013,已于2014年8月7日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9557。
2. -种杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂含有权利要求1所述的家蚕微孢子虫 (Nosema bombycis)ED2013〇
3. 按照权利要求2所述的杀虫剂，其特征在于所述的杀虫剂的剂型为孢子悬浮液。
4. 按照权利要求3所述的杀虫剂，其特征在于所述的孢子悬浮液中ED2013孢子的浓度 为1 X 106?1 X 109个孢子/ml。
5. 权利要求3所述的杀虫剂的制备方法，包括如下步骤： (1) 、在室内温度为25?27°C、相对湿度为60?80%、光照时间为14小时/天的条件 下，用人工饲料对采自于田间的二点委夜蛾成虫进行继代饲养，连续饲养5代及以上，形成 稳定的群体； (2) 、用浓度为2X 106孢子/ml的ED2013孢子悬浮液浸泡大白菜叶片，晾干大白菜叶 片表面水分，饲喂步骤（1)中所得的二点委夜蛾3龄幼虫，连续饲喂48h，再进行人工饲料饲 养，让孢子在二点委夜蛾幼虫体内增殖； (3) 、待步骤（2)中饲喂的幼虫长至老熟，将感染微孢子虫的幼虫或者虫尸进行表面消 毒：放入75 %酒精中浸泡1?2min,然后放在0. 1 %升萊中消毒1?2min,再以无菌水洗 3?5次，研磨，用4?6层纱布过滤，得组织液；向组织液中加入等体积无菌蒸馏水，然后 进行差速离心，在2500?3000rpm下离心25?30min，取沉淀；向沉淀中加入无菌水，用漩 涡振荡器震荡均匀，在500?700rpm下离心5?lOmin，取上清液；将沉淀再加入无菌水震 匀，然后在800?lOOOrpm下离心5?10min，取上清液；将2次所得上清液合并，浓缩；在 2500?3000rpm离心20?25min，取沉淀；用无菌水溶解稀释所得沉淀，即为ED2013孢子 悬浮液。
6. -种二点委夜蛾防治剂，其特征在于其组成成分及其比例为：吐温20 (v/v) 0.01%， 蔗糖1%?1.2% (重量比）和ED2013孢子悬浮液；其中ED2013孢子的浓度为1X107孢 子 /ml〇
7. -种毒饵，其特征在于其原料组成成分及其比例为：〇. 5 X 109?1 X 109个孢子/ml 的ED2013孢子悬浮液与麦麸的质量比为1:100。
8. 按照权利要求7所述的毒饵，其特征在于所述的麦麸的直径2mm。
9. 权利要求1所述的家蚕微孢子虫ED2013在防治玉米害虫上的应用。
10. 按照权利要求9所述的应用，其特征在于所述的玉米害虫是指二点委夜蛾 (Proxenus lepigone(Moschler)〇
【文档编号】C12N1/10GK104232487SQ201410425709
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】张海剑, 杜立新, 石洁, 曹伟平, 宋健, 郭宁 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所