一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型有效培养方法，不同于传统的经典的悬滴培养方法，以一种简化的悬浮分化培养方法形成类胚体，采用无血清培养液并进行改良，其中添加了多种诱导和营养强化物质，增加心肌细胞的分化率和存活时间。本发明进一步有效地更新和完善了胚胎干细胞分化为功能性心肌细胞的方法，极大地提高拟胚体分化的心肌细胞的比例，可为干细胞临床移植治疗技术和药物筛选等提供更多的功能强大的心肌细胞来源。本发明方法操作简单易行；缩短了培养时间；增强了体外分化成心肌细胞的功能；包括搏动时间、心肌细胞跳动的自律性和节律性；可重复性强。
【专利说明】一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的有效培养方法，属于干细胞生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]心脏病是人类健康的头号杀手。据世界心脏联盟统计，在全世界范围内每死亡三人，就有一人的死因与心血管病症有关，目前已经到了心血管疾病的“井喷期”，尤其是35-50岁年龄段。如缺血性心脏病、心肌梗死、心力衰竭和心肌病等已成为当今临床上常见病。人体心肌组织中干细胞数量有限，分化能力差，心肌细胞坏死或凋亡后，心肌难以修复，进而出现心肌细胞数量减少、心室重构、心律失常等，最终出现心力衰竭。
[0003]心血管疾病发展到终末期，因心肌细胞结构损害导致心脏功能不可逆转性改变，健存心肌细胞的代偿能力不能满足机体需求。目前临床上常用的治疗手段可以改善心脏循环，解决部分心肌再灌注问题，但难以解决心肌细胞的丢失，并且保守治疗手段亦不能从根本上解决问题。最终可采用心脏移植，但受到心脏供体来源、移植物抗宿主病反应等方面的限制，临床很难常规开展。为世界众多的心血管疾病患者寻找更有效的治疗手段，开辟新的治疗途径成为必然。
[0004]随着细胞和组织工程研究的不断深入，为实现缺血心肌在结构与功能的再修复，在细胞水平进行心肌重塑是近年的研究热点，人们对干细胞移植技术治疗心血管疾病进行了大量研究。在过去的十年里，大量关于心脏疾病的干细胞疗法的安全性和有效性的临床试验研究，尽管试验设计不同，但疗法的安全性已被证明。
[0005]胚胎干细胞(ES)具有在体外分化为三个胚层的所有组织细胞的能力。诱导人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞，其作用:(1)为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者实施细胞治疗，用来修复受损的心肌细胞；(2)作为种子细胞，用于构建供器官移植用的人造心脏；(3)用于研究心肌细胞发育分化的分子机理及更直观的用于体外筛选人类心血管药物等。
[0006]但是使用经典传统的方法使胚胎干细胞分化的拟胚体只有约5-9%的细胞可分化为心肌细胞，因此，提高胚胎干细胞来源功能性心肌细胞的诱导分化率，进而提高干细胞临床移植治疗的疗效，和优化药物筛选的有效率，以满足市场巨大需求。
[0007]目前通常采用的胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的主要方式是，在诱导ES细胞向心肌细胞定向分化时，首先将ES细胞在无饲养层和无LIF条件下悬滴培养10-13天形成拟胚体(EBs)，再悬浮培养2-3天，后用各种细胞因子或化学诱导物诱导，可得到节律性搏动的心肌细胞团。通常采用维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)或5-氮胞苷等诱导，同时刺激hES细胞向心肌细胞分化的细胞因子有HGF、EGF、bFGF、TGF-B, RA、双环磷酸腺苷(db2cAMP)、LIF等，可使细胞诱导分化率得到不同程度的提高，但是细胞因子的价格比较昂贵。截止目前，所有体外诱导ES细胞定向分化的物质只能提高某一分化细胞在分化群体中的比例，但所获得的的心肌细胞的数量和质量并不理想。以胚胎干细胞非常领先的以色列为例，科学家Kehat等将人类ES细胞悬浮培养分化为心脏收缩样心肌细胞团，其具有早期心肌细胞的结构和功能，但其分化率很低，仅达8.1%。基于此，诱导ES细胞分化为心肌细胞的方法有待进一步完善和更新。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是，提供一种有效地获得胚胎干细胞源心肌细胞的体外诱导分化的培养方法，所述方法可以显著地提高拟胚体分化为心肌细胞的比例，缩短分化时间，增强了体外分化的心肌细胞的功能，包括延长搏动时间、心肌细胞跳动的自律性和节律性；可为临床上的细胞治疗、人造心脏的种子细胞、心肌细胞分子机理研究和药物筛选等提供更多的心肌细胞来源。
[0009]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，包括以下步骤:
步骤I)拟胚体的形成:以浓度为(2~4) X 15个/ml接种人胚胎干细胞至明胶包被的培养皿中，每天添加培养基并吹打,避免细胞贴壁,所用培养基为无血清拟胚体形成培养基，培养条件是37°C、5%C02和95%饱和湿度。第3天可形成拟胚体并悬浮在培养液中，第5_7天形成大量的拟胚体。
[0010]步骤2)心肌细胞分化培养:收集拟胚体以I个/孔接种在12孔培养皿中，所用的心肌细胞分化培养基是以80%DMEM培养基为基础培养基，添加20%血清替代品，并添加了多种诱导物质。每天更换一次分化培养基，并添加强化营养物质，培养条件为37°C、5%C02和95%饱和湿度的条件下静态培养；跳动心肌细胞在培养的第3天出现，大量的心肌细胞在培养的第5天出现跳动，当大面积观察到节律性搏动细胞团的出现即完成了心肌细胞的分化。
[0011]进一步的，所述步骤I)中人胚胎干细胞是已经建系的人类胚胎干细胞、未分化的或分化早期的正常染色体核型的人类胚胎干细胞。
[0012]进一步的，所述步骤I)中明胶包被的培养皿的制备步骤包括:制备(0.1-0.3)%的明胶溶液，使明胶溶液铺满无菌组织培养皿底部并孵育至少I小时，然后吸去多余明胶溶液，接着晾干备用，即制备完成明胶包被的培养皿。
[0013]进一步的，所述步骤I)中无血清拟胚体形成培养基包括:基础培养基用80% DMEM培养基；添加20%血清替代品，lmmol/L必需氨基酸，2mmol/LL-谷氨酰胺，0.lmmol/L β -巯基乙醇，50IU/mL青霉素，10 μ g/mL链霉素。
[0014]进一步的，所述步骤2)中心肌细胞分化培养基添加的诱导物质分别是:L-谷氨酰胺2mmol/L、L丙酮酸钠0.182mmol/L、非必须氨基酸lmmol/L、β -巯基乙醇0.lmmol/L、转铁蛋白5.6mg/L、亚硒酸钠20mg/L和p38_MAPK抑制剂5 μ mol/L。
[0015]进一步的，所述步骤2)中心肌细胞分化培养过程中添加的营养强化物质同时包括了维生素C、蛋白水解物和牛血清白蛋白，其优选浓度分别是维生素C0.lmmol/L、蛋白水解物50 μ g/ml和牛血清白蛋白50 μ g/ml。
[0016]进一步的，所述步骤2)中分化形成的心肌细胞在37°C条件下可跳动30-45天，跳动次数可达60-80次/分钟，其自律性和节律性与正常人心脏一样。
[0017]本发明的显著效果是:
I)本发明与传统培养方法的优点是:a)在形成拟胚体的过程中，传统悬滴培养方法每一滴培养液少，不易添加培养液，细胞处于乏氧状态，易造成营养缺乏；而本发明的方法是放置在一个已经处理过的不易贴壁的大空间的培养液中，充分吸收养分和营养物质；使形成的拟胚体更有活力和分化潜能。b)本发明缩短了由胚胎干细胞向心肌细胞分化的时间，并提高心肌细胞形成效率和活性。c)传统的悬滴方法培养的拟胚体分化形成的心肌细胞跳动时间短，容易分化，传统的方法分化形成的心肌细胞的跳动时间仅为5-9天，而本发明方法跳动时间可达30-45天，甚至更长时间。
[0018]2)采用本发明可促使人胚胎干细胞向功能性心肌细胞分化效率的增加，不仅促进心肌细胞的分化效率，而且提高心肌细胞的功能性，包括延长搏动时间、心肌细胞跳动的自律性和节律性，可以提高心肌细胞应用的有效性。
[0019]3)本发明可为临床上心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者实施的细胞治疗，构建供器官移植用的人造心脏研究的种子细胞，心肌细胞发育分化的分子机理研究，以及更直观的人类心血管药物体外筛选等提供更多的心肌细胞来源。
[0020]4)本发明分化培养过程采用无血清DMEM培养基作为基础培养基，依次添加诱导营养物质，并添加了营养强化物质，增加了细胞的生长和分化效率，其中:a)维生素C作为人体必需的维生素之一，与其它的化学诱导剂相比，更加的安全可靠，采用这种方法诱导分化产生的心肌细胞能为以后的干细胞应用于临床治疗打下良好的基础。b)蛋白水解物是蛋白质经过酶、酸或者碱水解之后得到的产品，其主要成分为肽类，此外，还包含少量氨基酸、糖类、脂类、矿物质和维生素等物质；它具有来源广泛、价格低廉、无毒等特点。蛋白水解物不仅可以优化动物细胞培养基的组成，而且其中所含部分肽段可作为外部分子信号对细胞代谢、生物合成、生长、凋亡及产物表达等生命活动产生特殊的调控作用；并在特定条件下可促进动物细胞体外增殖、增强产物表达；它不仅为细胞生长提供简单的氮源，还能提供多种营养成分和生长因子类似物等。c)牛血清白蛋白是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，它具有维持渗透压和溶液酸碱度的作用；它可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合，传送和运输细胞生长需求的重要营养物质，包括脂肪、金属离子、氨基酸等，因此具有载体作用和营养作用；它在血液循环中还具有重要的抗氧化作用。
[0021]5)本发明方法简单，可重复性强，操作简单易行；采用无血清培养基，而且所用的分化培养基中添加的诱导物质不是价格昂贵的细胞因子，可降低细胞培养的成本，适合工业化大规模细胞生产。
[0022]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1是人胚胎干细胞向心肌细胞的分化率，图中所示为本发明方法与传统悬滴培养对比效果。
[0024]图2是人胚胎干细胞向心肌细胞的分化率，图中所示为本发明方法与未添加营养强化物质培养对比效果。
[0025]图3是跳动的心肌细胞检测到的自发动作电位。
【具体实施方式】
[0026]下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
[0027]具体实施例1:拟胚体的形成
1.制备明胶包被的培养皿，其步骤包括:制备0.1%的明胶溶液，使明胶溶液铺满无菌组织培养皿底部并孵育至少I小时，然后吸去多余明胶溶液，接着晾干备用，即制备完成明胶包被的培养皿。
[0028]2.制备无血清拟胚体形成培养基:基础培养基用80% DMEM培养基；添加20%血清替代品，lmmol/L必需氨基酸,2mmol/LL-谷氨酰胺,0.lmmol/L β -巯基乙醇，50IU/mL青霉素，10 μ g/mL链霉素。
[0029]3.拟胚体的形成:以浓度为2X105个/ml接种人胚胎干细胞至明胶包被的培养皿中，每天添加培养基并吹打，避免细胞贴壁，所用培养基为无血清拟胚体形成培养基，培养条件是37°C、5%C02和95%饱和湿度。第3天可形成拟胚体并悬浮在培养液中，第5_7天形成大量的拟胚体。
[0030]具体实施例2:心肌细胞分化培养
1.制备心肌细胞分化培养基:基础培养基用80% DMEM培养基，20%血清替代品，并添加了诱导物质，分别是:L-谷氨酰胺2mmol/L、L丙酮酸钠0.182mmol/L、非必须氨基酸lmmol/L、β -巯基乙醇0.lmmol/L、转铁蛋白5.6mg/L、亚硒酸钠20mg/L和p38_MAPK抑制齐[I 5 μ mol/L。
[0031]2.将培养的拟胚体转移至24孔培养板中，每孔放置I个拟胚体，所用培养基为心肌细胞分化培养基，并在心肌细胞分化培养过程中添加了营养强化物质，同时包括了维生素C、蛋白水解物和牛血清白蛋白，其浓度分别是维生素C 0.lmmol/L、蛋白水解物50 μ g/ml和牛血清白蛋白50 μ g/ml。培养条件是37°C、5%C02和95%饱和湿度。每天更换一次的分化培养基，并添加营养强化物质。跳动心肌细胞在培养的第3天出现，大量的心肌细胞在培养的第5天出现跳动，可持续培养并跳动30-45天，跳动次数可达60-80次/分钟。
[0032]具体实施例3:人胚胎干细胞向心肌细胞的分化率实验
1.不同条件下形成的拟胚体向心肌细胞分化培养实验步骤和方法:将培养的拟胚体移至96孔培养板，每孔接种I个拟胚体，实验组和对照组均做3板平行实验。然后置于37°C、95%饱和湿度并5%C02的条件下静态培养；每天更换一次培养基。其中实验组采用悬浮培养条件下形成的拟胚体，并添加营养强化物质，对照组采用传统倒置悬浮培养条件下形成的拟胚体，不添加营养强化物质；每天在光学显微镜下观察皿中是否有自发性搏动的细胞团出现，节律性搏动细胞团的出现被认为是成功分化的心肌细胞的功能标志。隔天计数出现自发性、有节律跳动拟胚体数目作为心肌细胞分化效率指标，计算每组的搏动细胞团占EBs总数的百分比，并进行统计。
[0033]实验结果:实验组与对照组相比，减小了心肌细胞分化时间，实验组从人胚胎干细胞接种形成拟胚体开始跳动仅需8-10天，即拟胚体培养阶段5-7天，拟胚体开始跳动形成心肌细胞阶段3天；而对照组从人胚胎干细胞接种形成拟胚体开始跳动需要13-16天，即拟胚体培养阶段10-13天，拟胚体开始跳动形成心肌细胞阶段3天；增加了心肌细胞搏动时间，实验组心肌细胞在正常培养条件下可保持跳动30-45天，而对照组心肌细胞在正常培养条件下仅保持7-9天即停止跳动；增加了心肌细胞的分化率，以拟胚体接种至96孔板的时间为第I天计算，搏动细胞团出现的数目较对照组显著增加，如图1所示，细胞团搏动率差异显著。
[0034]2.营养强化的心肌细胞分化率实验步骤和方法:将培养的拟胚体移至96孔培养板，每孔接种I个拟胚体，实验组和对照组均做3板平行实验。然后置于37°C、95%饱和湿度并5%C02的条件下静态培养；每天更换一次培养基。其中实验组添加营养强化物质，对照组不添加营养强化物质；每天在光学显微镜下观察皿中是否有自发性搏动的细胞团出现，节律性搏动细胞团的出现被认为是成功分化的心肌细胞的功能标志。隔天计数出现自发性、有节律跳动拟胚体数目作为心肌细胞分化效率指标，计算每组的搏动细胞团占EBs总数的百分比，并进行统计。
[0035]实验结果:实验组与对照组相比，强化营养的无血清培养基可以促进心肌细胞分化作用，以拟胚体接种至96孔板的时间为第I天计算，搏动细胞团出现的数目较对照组显著增加，如图2所示，细胞团搏动率差异显著。
[0036]3.免疫荧光染色实验:
在铺有22mmX22mm盖玻片的24孔板中，用上述方法将人胚胎干细胞诱导分化为跳动的心肌细胞。用新鲜配制的4%多聚甲醛固定细胞lOmin，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3遍，每次5min。用0.4%tritonX_100 (PBS配制)对细胞透化处理lOmin, PBS洗3遍，每次5min。2%牛血清蛋白(BSA)封闭30min，PBS洗2遍。加入一抗心肌肌钙蛋白T (cTnT，l: 200，PBS稀释)，4°C孵育过夜(20h)，PBS洗3遍，每次5min。加入二抗，室温孵育30~45min，PBS洗4遍，每次5min。加入20 μ I封片剂封片后，在荧光显微镜下读片。空白对照的细胞染色不加一抗，所有实验均经3次重复。结果观察到，几乎整个搏动的克隆细胞团cTnT染色都呈阳性，而不是在非搏动细胞区域存在。
[0037]4.人胚胎干细胞向心肌细胞收集和流式检测:
心肌细胞的收集步骤为:用不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲溶液清洗培养板两次，然后用包含浓度为1.6mg/mL胶原酶和20%胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液孵育30分钟，再用500 μ L0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化后收集成单细胞悬液，最后用40 μ m细胞滤网过滤细胞悬液，以悬滴方式培养的拟胚体分化的心肌细胞团做对照。
[0038]流式细胞仪检测:对心肌细胞特异性蛋白肌球蛋白重链(β-MHC)和肌钙蛋白I进行检测，为使细胞在常温下分别用鼠抗人抗体MHC-FITC、cTnl-FITC孵育30分钟；然后每个样品管加入1.5~2mLPBS溶液PBS清洗一次，1500转离心5分钟；弃上清，每样品管加入300 μ LPBS溶液重悬，进行流式检测。心肌细胞特异性表面标志物表达率分别为MHC-74.12%和cTn1-83.66%，而对照组心肌细胞特异性表面标志物表达率分别为MHC-28.56%和cTn1-27.31%。表明特异性心肌标记物在拟胚体成熟和心肌细胞发生过程中表达明显，心肌细胞数量在整个细胞团中比例明显增大。
[0039]5.电生理实验:
选取人胚胎干细胞分化得到的跳动部分细胞团，经36h培养后，选择跳动细胞用于膜片钳实验。应用电流钳技术记录胚胎干细胞分化的心肌样细胞的自发性动作电位。膜片钳放大器采用Axon-200A。玻璃微电极填充液成分为:KC150mmol/L、Kasp80mmol/L、MgCl2lmmol/L、MgATP3mmol/L、HEPES1mmoI/L、EGTA1mmoI/L (KOH 滴定至 pH 值为 7.4)，电极电阻 2 ~4ΜΩ。细胞外灌流液成份为:NaC1140mmol/L、KC15.4mmol/L、CaC121.8mmol/L、MgCI2Immol/I,、HEPES10mmol/L、D-glucose1mmo 1/L (NaOH 滴定至 ρΗ7.4)。在电极与细胞膜之间形成高阻(I~56Ω )封接后进一步将膜吸破，调节电容和串联电阻补偿。实验在37 0C下进行，所得数据(采样率为1kHz )经低通滤波(IkHz )后存储于电脑中用于分析并获得结论。实验结果是，将跳动克隆消化成单细胞，用膜片钳实验检测单个跳动心肌细胞的电生理，发现能够检测到自发性动作电位，如图3所示，表明分化形成的心肌细胞的自律性和节律性与正常人心脏一样。
[0040] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，包括以下步骤: 步骤I)拟胚体的形成:以浓度为(2~4) X 15个/ml接种人胚胎干细胞至明胶包被的培养皿中，每天添加培养基并吹打,避免细胞贴壁,所用培养基为无血清拟胚体形成培养基，培养条件是37°C、5%C02和95%饱和湿度，第3天可形成拟胚体并悬浮在培养液中，第5_7天形成大量的拟胚体； 步骤2)心肌细胞分化培养:收集拟胚体以I个/孔接种在12孔培养皿中，所用的心肌细胞分化培养基是以80%DMEM培养基为基础培养基，添加20%血清替代品，并添加了多种诱导物质；每天更换一次分化培养基，并添加强化营养物质，培养条件为37°C、5%C02和95%饱和湿度的条件下静态培养；跳动心肌细胞在培养的第3天出现，大量的心肌细胞在培养的第5天出现跳动，当大面积观察到节律性搏动细胞团的出现即完成了心肌细胞的分化。
2.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤I)中人胚胎干细胞是已经建系的人类胚胎干细胞、未分化的或分化早期的正常染色体核型的人类胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤I)中明胶包被的培养皿的制备步骤包括:制备(0.1~0.3)%的明胶溶液，使明胶溶液铺满无菌组织培养皿底部并孵育至少I小时，然后吸去多余明胶溶液，接着晾干备用，即制备完成明胶包被的培养皿。
4.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤I)中无血清拟胚体形成培养基包括:基础培养基用80% DMEM培养基；添加20%血清替代 品，lmmol/L必需氨基酸，2mmol/LL-谷氨酰胺，0.lmmol/L β -巯基乙醇，50IU/mL青霉素，10 μ g/mL链霉素。
5.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤2)中心肌细胞分化培养基添加的诱导物质分别是:L-谷氨酰胺2mmol/L、L丙酮酸钠0.182mmol/L、非必须氨基酸lmmol/L、β -巯基乙醇0.lmmol/L、转铁蛋白5.6mg/L、亚硒酸钠20mg/L和p38_MAPK抑制剂5 μ mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤2)中心肌细胞分化培养过程中添加的营养强化物质同时包括了维生素C、蛋白水解物和牛血清白蛋白，其浓度分别是维生素C0.lmmol/L、蛋白水解物.50 μ g/ml和牛血清白蛋白50 μ g/mL.
7.根据权利要求1所述的一种人胚胎干细胞体外分化为功能性心肌细胞的新型培养方法，其特征在于，所述步骤2)中分化形成的心肌细胞在37°C条件下可跳动30-45天，跳动次数可达60-80次/分钟，其自律性和节律性与正常人心脏一样。
【文档编号】C12N5/077GK104164402SQ201410427856
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】周萱 申请人:奥思达干细胞有限公司