一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应用。沙雷氏菌(Serratia?sp.)S，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC?1.12941。所述的沙雷氏菌S及其菌剂在降解雌激素尤其是降解己烯雌酚中应用。本发明筛选获得一株沙雷氏菌S，利用该菌株制备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为50mg?L-1的DES降解率可达80％以上。将固定化菌剂直接施用于DES污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使其中的DES残留降低90％以上，解决了雌激素DES对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害问题。
【专利说明】一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜禽粪便处理中的应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境污染生物修复领域，涉及一株己烯雌酚降解菌株及其在污水和畜 禽粪便处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 环境雌激素已成为继臭氧层破坏、全球气候变暖之后的第三大环境问题，被喻为 威胁人类存亡的定时炸弹。近年来，世界各国很多水体中均发现不同程度的雌激素污染，对 人类和动物的产生了不良影响。在我国的长江、黄河流域也有雌激素的检出。当水体中的 雌激素浓度为lng · Γ1时就会对鱼类的内分泌系统产生干扰作用，造成雄鱼的雌性化。人 类和动物正常的生理分泌排泄会释放雌激素，污水处理厂汇集了人类排放的雌激素，成为 了环境雌激素的一个重要来源。养殖业畜禽粪便是环境雌激素的重要来源之一，每年大量 的雌激素随畜禽粪便排入环境，对土壤、地表水和地下水环境造成污染，严重威胁人类和动 物的安全与健康；也制约了畜禽粪便的资源化利用。
[0003] 己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成雌激素，极微量就能对生 物体造成严重伤害。在人体医学上，DES曾被用于预防妊娠妇女自发性流产，但研究表明其 能增高女性后代患阴道腺癌的几率；在兽医上，DES也被用于诱导动物发情、促进生长，但 长期应用会损伤动物的肝脏。在环境中DES不易于降解，并在水体和畜禽粪便等固体废弃 物中富集，造成环境DES污染。人类和动物通过消化道、呼吸道、皮肤接触等多种途径暴露 DES，而其能在动物和人体脂肪组织中长期滞留，当体内蓄积的DES达到一定浓度时，其就 会从脂肪组织中释放出来进入血液，对生物体造成不良影响。近些年来，如何去除水体和固 体废物中DES备受关注。
[0004] 微生物降解修复技术是近几十年才兴起的一种新型的环境污染修复技术。该技术 和物理化学方法相比，具有很多无可比拟的优点，如处理效果好，适合有毒有害有机污染物 大面积面源污染的降解修复，修复费用较低（仅为传统的物理化学修复花费的10%左右）， 且不产生二次污染等。在国内外，生物修复技术已经广泛应用于环境有机污染物的清除。由 于DES性质稳定，不易发生自然降解，因此，对环境DES进行微生物降解的研究具有重要的 意义。而目前，国内外还未见关于DES微生物降解菌株的专利研究和应用报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种雌激素降解菌。
[0006] 本发明的另一目的是提供该降解菌生产的菌剂。
[0007] 本发明的又一目的是提供该降解菌的应用。
[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0009] 沙雷氏菌（Serratia sp. )S，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委 员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1. 12941。
[0010] 一种用所述的己烯雌酚降解菌沙雷氏菌S所生产的菌剂，所述的菌剂优选为固定 化菌剂。
[0011] -种用所述的沙雷氏菌（Serratia sp. )S所生产的固定化降解菌剂，是通过以下 方法生产而成：
[0012] 1)将保藏编号为CGMCC 1. 12941的沙雷氏菌（Serratia sp. )S试管种接种于发酵 培养基中，振荡培养至对数期；
[0013] 2)将上述培养好的菌种按5%的接种量接种入种子罐，培养至对数期；
[0014] 3)将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养；
[0015] 4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0. 6-1. 2,搅拌速度为 180-240转/分，培养温度为30°C，全流程培养时间为48-60小时，发酵结束后菌体数量达 到10亿个/ml以上；
[0016] 其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方 均为：蛋白胨 l〇.〇g · ΙΛ 酵母 5.0g · L'NaCl lO.Og · ?ΛρΗ 7.0-7.4 ;
[0017] 5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至0D600nm = 1. 0,将该 菌悬液与质量百分比为4%的海藻酸钠溶液按体积比2:1混合均匀，再以与混合液等体积 的质量百分比为4%的CaCl 2溶液为交联剂，交联6h，得到直径约为3?5mm固定化小球， 即为固定化修复菌剂。
[0018] 所述的保藏编号为CGMCC 1. 12941的沙雷氏菌（Serratia sp. )S在降解雌激素尤 其是降解己烯雌酚中的应用。
[0019] 所述的沙雷氏菌（Serratia sp. )S在降解水体环境或固体废弃物中雌激素尤其是 己烯雌酚中的应用。
[0020] 有益效果
[0021] 本发明筛选获得一株沙雷氏菌（Serratia sp.)S(CGMCC 1. 12941)，利用该菌株制 备的固定化菌剂在实验室摇瓶培养条件下7d内对初始浓度为50mg Γ1的DES降解率可达 80%以上。将固定化菌剂直接施用于DES污染的水体以及畜禽粪便中，能够在短时间内使 其中的DES残留降低90%以上，解决了雌激素 DES对水体环境，畜禽粪便和人体健康的危害 问题。
[0022] 本发明描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成 本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体环境以及畜禽粪便中DES造成的雌激素 污染。本发明中的技术可直接应用于我国畜禽粪便的无害化和资源化处理过程，具有广阔 的产业前景和重要的环境、经济和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1菌株S的菌落照片和透射电镜照片
[0024] A图为菌株S的菌落照片，B图为菌株S的菌透射电镜照片
[0025] 图2菌株S以50mg I^DES为唯一碳源时的生长和降解曲线
[0026] 生物材料保藏信息
[0027] 己烯雌酚降解菌S (Serratia sp.)，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通 微生物中心（CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏 编号为CGMCC 1. 12941，保藏日期为2014年8月26日。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1菌株的分离和鉴定
[0029] 取南京某污水处理站活性污泥5g，加入到100mL的无机盐培养基中，添加 DES至 50mg Γ1作为唯一碳源，于30°C，180r mirT1摇床培养7d，以5%的接种量转接到相同的培 养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取1(Γ 4-1(Γ7稀释度的富集液各0. lmL涂布于添 加 SOmgl^DES的无机盐平板上，于3(TC恒温培养4d后，挑取长出的单菌落接种于含有50mg L_1DES的无机盐液体培养基中，于30°C，180r mirT1摇床培养7d，验证其对DES的降解效果。 无机盐培养基配方为：ΝΗ4Ν0 31· 0g · ΙΛ ΚΗ2Ρ040· 5g · ΙΛ Κ2ΗΡ041· 5g · ΙΛ NaCl 1. 0g · ΙΛ MgS04 · 7Η20 0· 2g · ΙΛ pH 7· 0 ;固体培养基加 16g · Γ1 琼脂。
[0030] 降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min混匀， 12000r · mirT1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤（孔径0. 22 μ m)，用高效液相色谱法 测定其中的DES含量。高效液相色谱（岛津LC-20AT)设定参数为：Inertsil 0DS-SP-C18 反相色谱柱（150臟\4.6111111，5以111)，流动相为乙腈：水=80:20，流速1.0001]11^111；[]^ 1，柱温 40°C，紫外检测波长230nm。外标法按峰面积定量。
[0031] 从富集液中分离到一株DES降解菌，命名为菌株S。菌株S降解DES前后的液相色 谱检测结果表明菌株S 7d内对初始浓度为50mg Γ1的DES降解率大于65%。菌株S在固 体培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，呈红色，有光泽，菌体易挑起。在 透射电子显微镜下该菌呈短杆状，大小为（7. 0?8. 0) μ mX (12. 0?13. 0) μ m，无鞭毛，不 运动，不形成芽孢。（Γ，好氧生长，其生理生化特性见表1。菌株S的形态和生理生化特征和 Bergey'smanual of systematic bacteriology 上对沙雷氏菌的描述是一致的。
[0032] 以菌株S的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增， 得到长度为1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP数据库（https://rdp. cme.msu. edu/)中 进行Blast,结果表明菌株S与沙雷氏菌属菌株的同源性最近，与Serratia marcescens菌 株的序列相似性达到99%。结合生理生化特征将该菌鉴定为沙雷氏菌属（Serratia sp.)， 将该菌送交中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，保藏编号为 CGMCC 1. 12941，保藏日期为2014年8月26日。
[0033] 表1菌株S的生理生化特性
[0034]
【权利要求】
1. 一株雌激素降解菌沙雷氏菌（Serratia sp. )S，2014年8月26日保藏于中国微生物 菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1. 12941。
2. -种用权利要求1所述的雌激素降解菌沙雷氏菌S所生产的菌剂。
3. 根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述的菌剂为固定化菌剂。
4. 根据权利要求3所述的其特征在于所述的固定化菌剂通过以下方法生产而成： 1) 将保藏编号为CGMCC 1. 12941的沙雷氏菌S试管种接种于发酵培养基中，振荡培养 至对数期； 2) 将上述培养好的菌种按5%的接种量接种入种子罐，培养至对数期； 3) 将种子液按10 %的接种量接入生产罐培养； 4) 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0. 6 - 1. 2,搅拌速度为 180 - 240转/分，培养温度为30°C，全流程培养时间为48 - 60小时，发酵结束后菌体数量 达到10亿个/ml以上； 其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均 为：蛋白胨 10. 〇g · L-1，酵母 5. 0g · L-1，NaCl 10. 0g · L-1，pH 7. 0 - 7. 4 ; 5) 发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至0D600nm= 1.0,将该菌悬 液与质量百分比为4%的海藻酸钠溶液按体积比2:1混合均匀，再以与混合液等体积的质 量百分比为4%的CaCl 2溶液为交联剂，交联6h，得到直径约为3?5mm固定化小球，即为 固定化修复菌剂。
5. 权利要求1所述的沙雷氏菌S在降解雌激素己烯雌酚中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的沙雷氏菌S在降解水体环境或固体 废弃物中雌激素中的应用。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的雌激素为己烯雌酚。
8. 权利要求2所述的菌剂在降解雌激素中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求2所述的菌剂在降解水体环境或 粪便中雌激素中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的雌激素为己烯雌酚。
【文档编号】C12N1/20GK104195084SQ201410441021
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月1日 优先权日:2014年9月1日
【发明者】刘娟, 孙敏霞, 凌婉婷 申请人:南京农业大学