一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方法

一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了提供一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方法。所述小鼠核糖体基因区打靶载体中含有如SEQ ID NO.1所示的同源臂序列。本发明在核糖体基因区较高的同源重组效率基础上，旨在针对核糖体基因区位点，利用本发明有效地将目的基因打靶到小鼠不同类型细胞的核糖体基因区，再通过启动子陷阱策略富集基因打靶阳性克隆，此外Loxp序列的引入可以实现之后不同基因在打靶位置高效替换。本发明后续主要应用小鼠胚胎干细胞的核糖体基因区打靶，再最终建立核糖体基因区打靶的小鼠模型，为验证以核糖体基因区基因打靶的有效性、生物安全性提供基础。
【专利说明】-种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建方 法。

【背景技术】
[0002] 2007年获得诺贝尔医学奖的基因打靶技术本身是生物医学研究领域具有开创性 的方法，该方法通过构建同源重组引导的打靶载体，将其导入细胞后，利用细胞内靶向的基 因组位点与载体间自发同源重组，再最终筛选出携带重组子的细胞，从而可在活细胞中精 确稳定的引入基因组修饰，例如可定向敲除（knock-out)特定的内源基因，也能定点将外 源基因靶入（knock-in)至基因组。打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的 位点及重组效率，因此打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。
[0003] 自1987年Thomas和Capecchi完成了世界第一例小鼠胚胎干细胞（mESC)基因打 靶实验以来，基因打靶技术就给应用小鼠进行的生物医学研究带来了革命，并为基因治疗 引入了新的手段。随着近30年的发展，科学家们利用基因打靶技术与mESCs的结合，针对 不同的基因，设计打靶载体，对小鼠近1万个基因进行了基因操作，并建立了 500多种人类 疾病的小鼠模型，其中包括心血管疾病，神经退行性疾病，糖尿病和癌症等。
[0004] 虽然基因打靶技术已经广泛应用于对mESC的基因操作中，但是最终获得稳定基 因修饰细胞的效率却不胜人意。基因打靶技术的关键是根据合适靶位点设计和构建打靶载 体。靶位点的选择可能直接影响到同源重组的效率，同时也涉及到外源基因靶入细胞后安 全性和有效性的问题。目前文献报道已经实现基因打靶的位点基本上都是具有特定生理功 能的结构基因，这类等位基因在基因组上大部分仅有两个拷贝，而基因打靶的成功将导致 其中一个拷贝甚至两个拷贝的失活，极大可能影响或改变打靶后细胞的生物学特性。因此 目前针对不同疾病所进行的基因打靶大多是利用其进行机制相关的研究，尚未能将基因打 靶载体介导的基因打靶技术直接进行疾病诊疗的临床转化。
[0005] 现有通过基因打靶载体介导的基因打靶技术主要缺点在于打靶效率低下，而制约 因素主要有几个方面，包括基因组打靶位点的选择，打靶载体的设计策略，载体导入细胞的 效率。其中靶位点的选择是基因打靶至关重要的一步，因为此因素可能直接影响到同源重 组的效率，同时也涉及到外源基因靶入细胞后安全性和有效性的问题。此外，目前文献报道 已经实现基因打靶的位点基本上都是具有特定生理功能的结构基因，这类等位基因在基因 组上大部分仅有两个拷贝，而基因打靶的成功将导致其中一个拷贝甚至两个拷贝的失活， 极大可能影响或改变打靶后细胞的生物学特性。因此如何在细胞中实现安全稳定的基因打 靶是能否将其应用于临床转化的关键问题。


【发明内容】

[0006] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种小鼠核糖体基因区打靶载体及其构建 方法。
[0007] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0008] 所述小鼠核糖体基因区打靶载体中含有如SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列。
[0009] 优选地，所述打靶载体的空载体为T载体，pEGFP载体或pcDNA3. 1载体等。
[0010] 优选地，所述打祀载体的序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0011] 上述打靶载体的制备方法包括如下步骤：
[0012] (1)以小鼠胚胎干细胞的gDNA作为模板，将SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列扩增 为AR1和AR2两段序列，AR1序列如SEQ ID N0. 3所示；AR2序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0013] (2)将AR1序列连接至打靶载体的空载体，得载体AR1 ;将AR2序列连接至打靶载 体的空载体，得载体AR2 ;
[0014] (3)待载体AR1和载体AR2测序正确后，通过Not I和BamH I将AR1序列从载体 AR1上酶切下来；通过Not I和BamH I将AR2序列从载体AR2上酶切下来；将酶切下来的 AR1和AR2连接，构建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的载体pMr ;
[0015] (4)在载体pMr中SEQ ID Ν0· 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位点出连入正选择 筛选基因 Neo,构建成小鼠核糖体基因区打靶载体pMrn。
[0016] 下面结合原理对本发明作进一步说明：
[0017] 针对现有技术的缺点，本发明选择核糖体基因区作为基因打靶的靶位点并设计构 建相应的基因打靶载体。通过早期的实验结果及生物信息学分析得知，核糖体基因区可能 是高效的基因打靶位点。一方面，在小鼠基因组中有50-100个拷贝的核糖体基因。如此 庞大的拷贝数为同源重组提供大量的重组位点，可能增加打靶的效率。另一方面，据报道， 在酵母和拟芥南细胞中，已经发现核糖体基因区有一段有刺激同源重组事件发生功能的序 列，由于真核细胞的核糖体基因区相当保守，这段序列很可能鼠细胞的核糖体基因区，从而 使之成为一个同源重组热点。此外，在细胞增殖快，细胞生命活动旺盛的干细胞中，rDNA区 的转录活跃，染色质松散，可能更易于同源重组的发生。
[0018] 其次，核糖体基因区是安全的基因打靶位点。由于小鼠与人核糖体基因区序列的 同源性高达95%以上，而人核糖体基因区拷贝数的变化是常见的多态现象，增加或减少对 人体无危害。另一方面小鼠每个细胞中都有许多拷贝的核糖体基因，破坏少数拷贝对细胞 维持正常的功能应该没有影响。
[0019] 基于上述分析和实验，本发明首先通过生物信息学方式查找到小鼠 rDNA单个拷 贝的全序列，选取其转录区下游+2506至+6875全长4370bp的一段序列作为同源臂序列。 抽提小鼠胚胎干细胞的gDNA作为模板，通过设计引物将该同源序列分为两段（AR1，AR2)进 行扩增，其中AR1长2428bp，AR2长2421bp。扩增后的DNA片段分别连接至T载体上。再 通过Not I和BamH I酶切AR2的一段序列连接到AR1之后，构建成包含4370bp全长同源 臂的载体pMr。在同源臂上的EcoR I酶切位点处（rDNA转录取下游+5646位点）连入正选 择筛选基因 Neo。Neo采用启动子陷阱策略，即上游未带启动子，而是利用EMCV-IRES (脑心 肌炎病毒内部核糖体进入位点序列）的作用依靠核糖体基因自身的启动子来驱动其表达， 以富集基因打靶阳性克隆。EMCV-IRES及Neo基因将全长同源臂分隔为1229bp的短同源臂 (SH)和3140bp的长同源臂（LH)，通过两个同源臂与基因组发生同源重组将Neo打靶至细 胞基因组rDNA中。EMCV-IRES-Neo序列的两端加上了 LoxP序列便于后续工作中去除筛选 基因或进行基因交换。
[0020] 本发明的目的在于证实该载体能高效介导外源基因靶入到小鼠胚胎干细胞的核 糖体基因区，并能稳定遗传，且该载体介导的基因打靶不影响小鼠胚胎干细胞的生物学特 性，初步证实具备安全性。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 1)通过测序证实构建好的小鼠核糖体基因区打靶载体pMrn的同源臂及其他序列 元件均无突变，将pMrn通过核转染的方式导入小鼠胚胎干细胞后，经G418药物筛选，能获 得大量抗性克隆，通过定点PCR，Southern blot的检测，确定pMrn能将外源基因定点靶入 到小鼠 rDNA区。
[0023] 2)通过计算，pMrn所获的打靶效率高于之前报道其他位点的打靶效率，具有高效 的优点。
[0024] 3)将打靶后的小鼠胚胎干细胞多次传代，并经核型检测和干细胞标志物的检测， 表明rDNA区打靶不仅能稳定遗传，而且不会改变干细胞的生物学特性。具有稳定安全的优 点。
[0025] 总之，本发明所述的小鼠核糖体基因区打靶载体pMrn包括5'同源臂和3'同源臂， 以小鼠 rDNA转录区下游+2506至+6875全长4370bp的一段序列作为同源臂序列，在同源臂 上的Xbal酶切位点的位置上连入正选择筛选基因 Neo。Neo基因采用启动子陷阱策略，艮P， 上游未带启动子，而是利用EMCV-IRES(脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点序列）的作用依 靠核糖体基因自身的启动子来驱动其表达EMCV-IRES-Neo筛选基因的两端加上了 Loxp序 列，便于后续工作中去除筛选基因或进行基因交换。本发明在核糖体基因区较高的同源重 组效率基础上，旨在针对核糖体基因区位点，利用本发明有效地将目的基因打靶到小鼠不 同类型细胞的核糖体基因区，再通过启动子陷阱策略富集基因打靶阳性克隆，此外Loxp序 列的引入可以实现之后不同基因在打靶位置高效替换。本发明后续主要应用小鼠胚胎干细 胞的核糖体基因区打靶，再最终建立核糖体基因区打靶的小鼠模型，为验证以核糖体基因 区基因打靶的有效性、生物安全性提供基础。

【专利附图】

【附图说明】
[0026] 图1AR1，AR2PCR凝胶电泳结果图；
[0027] 图2为pMr酶切鉴定结果图；
[0028] 图3为pMrn酶切鉴定结果；
[0029] 图4为pMrn测序鉴定图；
[0030] 图5为核转获得高效的转染率及药物筛选后的抗性mESCs克隆结果图；
[0031] 图6为Southern Blot鉴定定点整合克隆以及所获得的定点整合克隆数分析图；
[0032] 图7为定点整合克隆碱性磷酸酶呈阳性且核型正常的结果图； 图8为实施例1中2. 1第一次PCR循环条件； 图9为实施例1中2. 1第二次PCR循环条件； 图10为实施例1中3. 1的PCR循环条件； 图11为实施例1中4. 3的PCR循环条件。

【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 1小鼠胚胎干细胞全基因组DNA的抽提
[0035] (1)小鼠胚胎干细胞的培养3天，保证其未分化。
[0036] (2)弃去培养皿的培养基，加5ml DPBS洗涤2次。
[0037] (3)弃尽 DPBS,加 1ml 0.05% trypsin/EDTA 37°C培养箱消化 2-3min。
[0038] (4) 3min后加5ml培养基终止消化，用大tip把细胞吹洗下来，并将悬液转移至 15ml离心管。
[0039] (5) 1000rpm，室温离心5min，收集细胞。
[0040] (6)弃培养基后加3ml DPBS洗一次，lOOOrpm，室温离心5min。
[0041] (7)小心倒掉DPBS，加入含有200ug/ml RNA酶的0· 5ml lx细胞裂解液，剧烈振荡 重悬细胞
[0042] (8)每管加入20%的SDS 35ul，上下颠倒混匀，直至出现黏稠透明装。
[0043] (9)加入终浓度200ug/ml蛋白酶K并且颠倒混勻，于恒温床上lOOrpm，37°C消化 6小时以上（过夜）
[0044] (10)将溶液转移至EP管中，加入相同体积饱和酚，轻轻摇匀，直至乳浊液形成，然 后 13000rpm，4 度离心 lOmin.
[0045] (11)将上层水相转移至另一新的EP管中，加入相同体积的酚和氯仿（酚：氯仿= 1:1)摇勻后，13000rpm，4 度离心 lOmin。
[0046] (12)将上层液移至另一 EP管，加2倍体积预冷的乙醇，颠倒混匀，有少量的絮状 DNA沉淀.
[0047] (13)4 度 13000rpm 离心 lOmin,收集 DNA 沉淀。
[0048] (14)弃上清，加入500ul 70%乙醇洗0嫩一遍。
[0049] (15) 13000rpm 4 度离心 5min。
[0050] (16)弃上清，点离，用小tip吸尽残留的清洗液，室温下干燥，加入20ul ddH20，充 分溶解。
[0051] (17)取 2ul 测 0D 值，并稀释成 100ng/ul。
[0052] 2同源臂（pMr)载体的构建
[0053] 小鼠 rDNA区靶向载体（pMrn，pMr-GFP)同源臂总长度有4269sbp，为减少突变的可 能性，我们设计了利用BamH I和T-vector载体上Not I酶切位点分别把同源臂分成两段 (AR1、AR2)，然后利用酶切位点将它们拼接成pMr同源臂载体，所有PCR过程均用phusion 高保真酶来扩增。
[0054] 2. 1 PCR扩增小鼠 rDNA区同源序列AR1、AR2
[0055] 以上述抽的小鼠 gDNA为模板，利用下列引物扩增同源臂AR1
[0056] 由于rDNA区同源序列要求较高的保真性，扩增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶-Phusion酶，扩征片段2428bp
[0057] 其PCR扩增体系为：
[0058] SxPhusion HF Buffer 4ui Mouse gDNA (lOOn^til) 2ul Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID ().5ul N0.5) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.6)
[0059] dNTP(IOmM) 0.5 ul DMSO O.611I Phusion 0,2ui ddH^O 】1.7ui total 20ul
[0060] PCR循环条件如图8所示。
[0061]
[0062] 以上述抽的小鼠 gDNA为模板，利用下列引物扩增同源臂AR2 ;
[0063] 由于rDNA区同源序列要求较高的保真性，扩增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶--Phusion酶，扩增片段为2321bp。
[0064] 其PCR扩增体系为：
[0065] SxPhusion HF Buffer 4ul Mouse gDNA (1 OOng/ut) 2ui Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.7) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ui NO.8) dNTP(lOmM) 0.5ul DMSO 0/ml Phasion 0,2ul ddH20 11.7ul total 20ul
[0066] PCR循环条件如图9所示。
[0067]
[0068] 2. 2 PCR产物的纯化
[0069] 2· 2· 1胶纯化PCR产物
[0070] 实验采用试剂盒对胶中的目的片段进行回收（我室通常使用QIAGEN GEL extraction Kit)：
[0071 ] 1)制备0. 8 %的琼脂糖凝胶
[0072] 2)用0. 5 X TBE缓冲液中电泳上述的PCR产物；
[0073] 3)电泳结束后，取出凝胶在加有溴化乙锭（EB)染液中染色10?15min ;
[0074] 4)在长波长紫外灯照射下进行切胶回收目的条带，切胶时在保证条带完整的前 下，并且尽可能地减少琼脂糖的体积；
[0075] 5)称量切胶的质量，加入相当于胶质量3倍体积的buffer QG(lOOmg-lOOul)， 50°C水浴箱10min，每隔3min上下颠倒直至凝胶全部溶解。
[0076] 6)加1倍体积的异丙醇，混勻后，把液体移至纯化柱，室温13000rpm离心lmin。
[0077] 7)弃上清，加 500ul buffer QG，13000rpm 离心 lmin。
[0078] 8)弃上清，加 750ul buffer PE，13000rpm 离心 lmin。
[0079] 9)弃上清，13000rpm重新离心2min，保证无乙醇残留。
[0080] 10)将柱子转移至一新的EP管中，将15ul的灭菌水加于柱膜正中，溶解DNA2min， 室温 13000rpm 离心 lmin，
[0081] 11)测量 0D 值。
[0082] 2. 2. 2 PCR 产物加 A 尾：
[0083] Phusion酶扩增后的PCR产物其末端是平端，所以在T连之前需先在其3'端加 A 尾
[0084] 其体系如下：
[0085] 胶纯化产物 12ui dNTP(lOmM) 2ui 4χ Buffer 5 ui LATaq 1 ul Total 20 72°C 30ηι?η,37Γ 30mm,
[0086] 2. 2. 3酒精纯化加 A尾产物
[0087] 1)加入三倍体积的事先预冷的无水乙醇，放置_20°C 10min。
[0088] 2) 4°C 13000rpm 离心 10min，小心弃置悬液。
[0089] 3)力口 100ul 预冷的 75% 乙醇，放置-20°C 10min。
[0090] 4)4°C 13000rpm 离心 lOmin,小心弃置悬液。
[0091] 5)4°C 13000rpm离心lmin,用小枪吸尽上清液然后室温干燥。
[0092] 6)加入5ul灭菌水溶解DNA。
[0093] 2. 3 PCR产物连接、转化以及鉴定
[0094] 2. 3. 1 PCR 产物连接
[0095] PCR产物连接到T-vector上然后进行转化，抽提质粒酶切鉴定测序等步骤。
[0096] 连接体系
[0097] 2xbulTer 5ul DNA (ARL AR2) 3ml T4连接W lul T-vector lul Total lOul 16度水浴过夜
[0098] 2.3.2大量感受态的制备以及冻存。
[0099] 1)从JM109菌种悬液划线的培养皿中挑取一个单菌落，扩大培养，于37 °C， 280rpm，摇振培养约8个小时。
[0100] 2)把上述摇振的菌液接种于500ml的LB培养液中，37°C，280rpm摇振培养2个小 时。
[0101] 3)把上述摇振的菌液分装成10管50ml菌液，然后4°C，3000rpm离心lOmin。
[0102] 4)弃去上清液，用3ml的0· lmol/L CaC12，10%甘油重悬，冰置12小时，然后按照 每管100ul分装，冻存在-70°C。
[0103] 2. 2. 2. 3. 3 质粒转化
[0104] 1)取上述_70°C冻存的JM109感受态细胞置冰上溶解。
[0105] 2)取5ul连接产物或lul质粒（50-100ng)加到100ul感受态细胞中，轻轻混匀， 冰置30min。
[0106] 3)42°〇水浴9〇8，并迅速放到冰上2!1^11。
[0107] 4)加200ul液体LB，于摇床上37°C、180rpm摇振培养45min。
[0108] 5)4500rpm离心5min，倒掉上清，留100ul菌液，吹打混匀，在超净工作台铺皿。
[0109] 6)37°C 培养箱培养 12_16h。
[0110] 7)出现克隆后，挑取小的边缘不规整的克隆于含有氨苄青霉素抗性LB扩大培养。
[0111] 2. 3. 4质粒的小量制备
[0112] 质粒DNA小量制备用的是OMEGA公司的Plasmid mini kit I抽提，具体抽提按照 试剂盒protocol操作。
[0113] 1)将 1. 5ml 菌液加到 EP 管中，13000rpm 离心 lmin。
[0114] 2)倒掉上清，加250ul的Solution I溶液，剧烈振荡，使细菌重悬于其中（确保细 菌全部重悬）。
[0115] 3)加入250ul Solution II溶液（注意观察Solution II是否有絮状沉淀，若有 37°C水浴至絮状沉淀溶解），轻轻颠倒4-5次混匀（避免剧烈的振荡，以防染色体DNA断裂， 质粒溶度过低），室温孵育2-3min。
[0116] 4)加入350ul预冷的Solution III溶液，混勻，可见白色絮状沉淀生成，室温下 13000rpm 离心 10min。
[0117] 5)平衡 HiBind Miniprep Column I 柱子：往柱子加入 200ul GPS buffer，室温静 置 2_5min，室温下 13000rpm 离心 10min。
[0118] 6)小心地将上清转移到步骤（5)平衡好的柱子，13000rpm、室温离心lmin。
[0119] 7)弃去收集管的废液，再加入 500ul 的Buffer HB来洗HiBind Miniprep Column, 13000rpm、室温离心lmin(这步主要是将残余的蛋白质除去干净）
[0120] 8)弃去收集管的废液，再加入750ul的DNA Wash Buffer来洗HiBind Minipr印 Column，13000rpm、室温离心 lmin
[0121] 9)弃去收集管的废液，再13000rpm、室温离心2min以除净残留的乙醇（不要省略 这一步，对能否提出质粒这步很重要。）
[0122] 10)把收集柱子放置于新的1.5ml EP管用于收集质粒DNA。加入20ul ddH20与 柱子中间，室温放置2min溶解DNA。
[0123] 11) 13000rpm、室温离心2min，离心液即所抽提的质粒DNA。再测量0D值。
[0124] 2. 3. 5质粒的酶切鉴定：
[0125] 先用1 %的琼脂糖胶跑个质粒电泳，观察电泳条带，把疑似有插入片段的质粒进行 酶切鉴定。
[0126] 所用限制性内切酶均为NEB公司的酶，酶切体系如下：
[0127] lO^Buffer 2 Plasmid 5 ill Not I 0.5 ul BaniH I §,5ul iOOxBSA 0,2ul ddH：〇 11,8 ul Total 20 ul
[0128] 7°C反应2_3h，取10ul点样进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0129] 2. 3. 6同源臂的连接
[0130] 把酶切鉴定是阳性的质粒送到博尚公司测序。然后把经过测序鉴定没有突变的 AR1，AR2经过Not I、BamH I酶切，胶纯化以及连接构造 pMr同源臂空载体。酶切体系、胶 纯化步骤如上述相同。
[0131] 1)T-AR1质粒大小为5428bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到2096bp和3332bp 片段的两条片段，其中2096bp片段是目的片段，称为片段1。
[0132] 2)T-AR2质粒大小为5421bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到147bp和5273bp 片段的两条片段，其中5274bp片段是目的片段，称为片段2。
[0133] 3)用胶纯化回收片段1、片段2,并测0D值，记下其浓度。
[0134] 4)用以下体系把片段1、片段2连接。
[0135] 10^T4 Ligasc BulTcr 2ul
[0136] Μ'段 2 100 ng j',段 I variaWc (片段丨；片段2摩尔数比 ….…、 i ul 3:1-10:1) T4 DNA Ligase(5U/ul) To 20 ul ddH20 2〇 Ul Total volume
[0137] 16度水浴过夜。转化以及pMr载体质粒小量制备跟上述相同。
[0138] 2. 3. 7 pMr载体酶切鉴定
[0139] 取所制备的载体用Not I和EcoR I酶切，酶切体系跟上述相同。可以得到两个片 段，片段大小分别为3108bp，4232bp。
[0140] 3 pMrn载体的构建
[0141] 3. 1 Τ-Neo 载体构建
[0142] PCR扩增Neo基因，其中包括脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点序列 (EMCV-IRES)、新霉素磷酸转移酶基因开放阅读框和SV40polyA序列，简称Neo。并且在扩增 中利用上游引物依次加入了 EcoR I位点、野生型ΙοχΡ位点，下游引物依次加入了 EcoR I 位点、突变型l〇xP2272位点。
[0143] 在扩增之前由于上游引物和下游引物loxp之间的回文序列互补，不易扩增，所以 得对上下游引物预处理。99摄氏度5min后马上放置冰上3min。然后再按照以下体系扩增。 扩增利用了 NEB公司的Phusion酶，扩增出1904bp片段。其PCR扩增体系为：
[0144] 5X Phusion HF Buffer 4ul pHrNco (lOOng/ul) 2ui Primer F (lOuM ) (SEQ ID NO.9) ().5ul Primer R (lOuM) (SEQIDNO.10) 〇.5ul dKTP( H)mM) 0.5ul Phusion D.2ul dd H20 12,3ul total 20ul
[0145] PCR循环条件如图10所示。
[0146]
[0147] 3.2pMrn 构建完成
[0148] 1)将上述T-Neo用Ecorl酶切，然后在经过胶回收分别得到Neo基因。
[0149] 2)用EcoR I单酶切pMr，得到线性化pMr片段，为防止自连，对其骨架去磷酸化处 理。其体系为：
[0150] 1〇χ AP Buffer 2ul 线件.DMA l?ul ΠΑΡ lul Total 20 ul 37Γ 30min
[0151] 3)然后再胶纯化处理得到骨架去磷酸化的pMr线性化载体。
[0152] 4)分别将Neo和pMr连接，构建成pMrn载体。
[0153] 中间过程涉及到的胶纯化、连接、转化、质粒抽提以及鉴定过程同前述。
[0154] 小结：
[0155] pMrn载体构建结果：
[0156] 抽提小鼠胚胎干细胞gDNA，并以此作为模板，通过调整PCR体系以及温度条件，扩 增AR1，AR2,结果显示均能特异性扩增出片段。再按设计的流程相互连接，最终将4370bp的 HS连接至T载体上，构建成pMr。通过Not I和Nhe I对pMr进行酶切鉴定，结果显示酶切 后的条带符合预期大小，表明载体构建成功。最后通过EcoR I将EMCV - IRES连接至pMr 中，通过酶切及测序鉴定表明最终构建成pMrn载体（图1、2、3和4)。
[0157] 4 pMrn载体介导在小鼠胚胎干细胞内的基因打靶
[0158] 4. 1细胞准备
[0159] (1)在细胞传代培养中，把细胞接种在预先包被的matri胶中，每天换液观察细胞 生长状态。
[0160] (2)待培养3d左右，加入1ml 0· 05% trypsin/EDTA，放置于培养箱消化3-5min。
[0161] (3)用大枪吹打细胞，把mESCs细胞吹打成单细胞，然后转移置15ml离心管，混匀， 取100ul细胞悬液用计数板计数，取2xl0 7个细胞，以lOOOrpm离心5min。
[0162] (4)弃上清，再加入5ml D-PBS重悬细胞，以lOOOrpm离心5min。
[0163] (5)弃尽上清，用中枪小心的把上清吸干净，然后再加入800ul D-PBS重悬细胞， 并在冰上孵育10min，然后加20ug事先处理过的线性化打靶载体与之混匀。
[0164] (6)用移液枪把步骤（5)的细胞悬液转移置电转杯中。
[0165] (7)把电转杯置于电转仪中，以500V，250uF用电穿孔方法打靶小鼠胚胎干细胞， 使其利用同源重组方式定点整合到小鼠 rDNA区。
[0166] (8)将电转的细胞马上置于冰上孵育10min。
[0167] (9)把经电转并且孵育的细胞转移到事先准备好的MEF饲养层培养皿中培养，6h 后换液，去除死细胞。
[0168] 4.2细胞筛选
[0169] (1)电转的mESCs细胞，第二天换液用加有50ug/ml G418筛选，其他培养跟正常小 鼠胚胎干细胞一样。
[0170] (2)培养5-6天后可以看到有小克隆形成继续筛选培养，每天观察期状态，并且拍 照记下细胞生长状态
[0171] 4. 3定点PCR鉴定及Southern鉴定
[0172] 4. 3. 1 PCR鉴定定点整合克隆
[0173] 以抽提的细胞克隆gDNA为模板，用定点整合引物screen-rc/screen-dn进行扩 增，若为定点整合阳性，则扩增后PCR产物片段为1. 4kb。
[0174] PCR反应体系为：
[0175] 2x〇C Buffer I: ΙΟ.ΟμΙ dNTP: 1 ,ΟμΙ LA-Taq DNA polymerase: 0.2μ 1 scrccn-rc: 1,0 μ 1 sc rccn-dn: 1 .0 μ 1 gDNA: 2.0μΙ
[0176] ddH2〇： 4,8μΙ Total: 20,0μ1
[0177] PCR循环条件如图11所示。
[0178]
[0179] 反应结束后，取5 μ 1 PCR产物以0. 8 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。
[0180] 4. 3. 2 Southern blot 鉴定（参照 DIG HIGH PRME DNA LABELING试剂盒，Roche)
[0181] 小结：
[0182] pMrn打靶小鼠胚胎干细胞rDNA区的验证：
[0183] 采用电转或核转的方式将pMrn导入到mESCs中，经G418药物筛选出抗性的mESCs 克隆（图5)。再通过定点整合PCR以及Southern Blot鉴定，能检测到与整合基因组rDNA 后一致的片段大小（图6)。经打靶后的mESCs仍然保持细胞核型正常，且多能性标志物碱 性磷酸酶成强阳性，初步表明小鼠 rDNA区基因打靶的安全性（图7)。
【权利要求】
1. 一种小鼠核糖体基因区打靶载体，其特征在于，所述打靶载体中含有如SEQ ID NO. 1 所示的同源臂序列。
2. 如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的空载体为T载体，pEGFP 载体或pcDNA3. 1载体。
3. 如权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
4. 如权利要求1至3任一项所述打靶载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下 步骤： (1) 以小鼠胚胎干细胞的gDNA作为模板，将SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列扩增为AR1 和AR2两段序列，AR1序列如SEQ ID NO. 3所示；AR2序列如SEQ ID NO. 4所示； (2) 将AR1序列连接至打靶载体的空载体，得载体AR1 ;将AR2序列连接至打靶载体的 空载体，得载体AR2 ; (3) 待载体AR1和载体AR2测序正确后，通过Not I和BamH I将AR1序列从载体AR1 上酶切下来；通过Not I和BamH I将AR2序列从载体AR2上酶切下来；将酶切下来的AR1 和AR2连接，构建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的载体pMr ; (4) 在载体pMr中SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位点出连入正选择筛选 基因 Neo,构建成小鼠核糖体基因区打靶载体pMrn。
【文档编号】C12N15/66GK104232684SQ201410442448
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】梁德生, 李卓, 邬玲仟 申请人:中南大学, 湖南家辉生物技术有限公司家辉遗传专科医院