虾类偷死野田村病毒现场快速检测弓i物组及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种对虾偷死野田村病毒的现场快速检测弓I物组及高灵敏检测试剂盒。本发明的引物组包括6条引物，本发明的高灵敏检测试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的引物组能够特异性识另1J、高效扩增被检测CMNV的目标核酸，本发明的高灵敏检测试剂盒检测方法具有比电镜检测法、组织病理学检测费、病毒分离检测法等更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本低，使用方便，检测更准确、快速、灵敏度极高。
【专利说明】虾类偷死野田村病毒现场快速检测引物组及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋生物病原检测【技术领域】，具体涉及一种虾类偷死野田村病毒 (Covert mortality nodavirus，简称CMNV)场快速检测引物组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 2009年以来，越南、马来西亚和我国南方多省连续出现养殖对虾大批死亡的情况。 发病的养殖池塘中对虾摄食量不随着养殖时间的增加而增加，其中还有相当部分反而随着 养殖时间的延长而减少；养殖现场观察，通常发病对虾活动规律无十分明显的异常，检查饵 料台和养殖池底部时会发现死虾；发病严重时，死虾数量会在短短几天内大量增加。对虾 养殖者称之为对奸"偷死病（Covert mortality disease) "、"死底症"或"偷死症"。该病 爆发受环境条件如温度的影响：气温30°C以上，水温达28°C以上时，该病会导致死亡率大 大升高。对发病严重的对虾进行仔细检查可以发现虾体透明度下降，时常可见腹部肌肉发 白，肝胰腺颜色变浅或萎缩，总体上表现出一定程度的肝胰腺坏死和肌肉坏死症状；组织病 理学表现为肝胰腺坏死，骨骼肌肌肉也呈多病灶溶解样坏死，肝胰腺、淋巴器官和结缔组织 中可见嗜酸性包涵体。该病的病理学特征与对奸肌肉坏死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV)、凡纳滨对奸诺达病毒（Penaeus vannamei nodavirus，PvNV)和罗氏沼奸诺达 病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)所致的病理学特征很相似，但发病对 虾中检测不到MNV、PvNV和MrNV的存在。我们在进行该病研究的过程中，发现一种新型的 野田村病毒-命名为偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus，CMNV)是导致该病 发生的原因。截至目前，该病害在我国的大部分对虾养殖地区仍危害严重，所以研究并建立 该病原的快速检测预警技术，加强虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病 毒感染，有效切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展就显得尤为迫切和重要。
[0003] 进行虾类偷死野田村病毒早期检测并采取预防措施是水产养殖中降低偷死野田 村病毒流行风险、减少发病照成巨额经济损失的有效手段，所以建立简单、快速、高灵敏的 检查方法，并开发适于现场应用的偷死野田村病毒检测试剂盒就尤为必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的虾类偷 死野田村病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以 克服现有技术的不足，使CMNV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。
[0005] 发明人通过构建CMNV病毒全基因组cDNA文库克隆获得了 CMNV的RNA聚合酶基 因，通过对该基因保守区段序列的比对、分析，设计出4组可用于检测的引物组合，经过进 一步优化和灵敏度、特异性分析，从4组中筛选出1组共6条特异引物，能够灵敏、特异性 的检测用于该病毒的检测。在上述引物组的基础上，本发明还提供包含有反转录酶和一种 DNA聚合酶的试剂盒，该试剂盒无需单独对目的核酸（RNA)进行反转录，在恒定温度下保温 一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对CMNV的快速和高灵敏检测。
[0006] 本发明首先提供一种用于检测偷死野田村病毒的引物组，包括有如下引物：上游 引物 1-3(SEQ ID N0:1):
【权利要求】
1. 一种用于检测偷死野田村病毒的引物组，其引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:l-6。
2. 如权利要求1所述的引物组，其引物的具体信息如下：
3. 权利要求1所述的引物组在制备检测偷死野田村病毒的制品中的应用。
4. 一种用于检测偷死野田村病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要 求1所述的引物组。
5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含有： (1) 采样管，用来盛放、研磨待检样品； (2) 漂洗管，内装蒸馏水； ⑶核酸变性管，内装TE缓冲液； ⑷扩增检测管，内装扩增反应液和染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游 引物1-3和下游引物1-3各1?3 ii M，扩增引物的解链引物1-3和2-3各0. 5?I. 5 ii M， 扩增引物的上游引物2-3和下游引物2-3各0. 1?0. 5 ii M，dATP、dlTP、dGTP和dCTP各 0? 8 ?2. 2mM，MgCl22 ?8mM，Betaine 0? 6 ?I. 5M，Tris-HCllO ?40mM，KCl 10 ?20mM， MgSO4I ?6mM，（NH4)2S046 ?12mM，Triton X-1000. 05%?I. 0%，反转录酶 1 ?20U，Bst DNA聚合酶2?20U ; (5) 阴性对照管，内装无偷死野田村病毒核酸的FTA膜片； (6) 阳性对照管，内装吸附了偷死野田村病毒核酸的FTA膜片； (7) 快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质； (8) 分别封装于无菌袋中的FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管。
6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的染料为金属离子与钙黄绿素形成 的配合物或核酸染料。
7. 权利要求4所述的试剂盒在检测非养殖动物的样品中偷死野田村病毒的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104212915SQ201410459061
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月10日 优先权日:2014年9月10日
【发明者】张庆利, 黄捷, 杨昊霖, 刘爽 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所