一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌种胚的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养等步骤。本发明方法可以快速获得大量的喙荚云实细胞，操作简单，细胞增殖率高，生长速度快，可以无限度的提供制药原料，利于工业化大规模生产。
【专利说明】 一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下喙荚云实悬浮细胞的培养，属于植物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]_荚云实，豆科，Caesalpiniaceae nom.cimserr,藤本，别名南蛇簕、石莲子，分布于产永胜、莲山、芒市、镇康、凤庆、孟连、西双版纳、景东、元江、蒙自、文山、河口、富宁；生于海拔200-1100 (- 1700)米山坡灌丛中或山谷、溪旁、路边及疏林下。种子入药，名石莲子，性寒无毒，有开胃、清心解热、除湿之效。民间用于治咽炎、无名肿毒、外敷蛇伤；叶可洗疮癞，治皮肤过敏等。目前主要产用野外采集，自然繁殖，利用组培技术培养愈伤组织及悬浮细胞可以提高喙荚云实的利用率，有利于其药用资源的开发。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供喙荚云实细胞悬浮培养的快速繁殖方法，可以快速获得大量的喙荚云实细胞，操作简单，细胞增殖率高，生长速度快，可以无限度的提供制药原料，利于工业化大规模生产。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用下列技术方案:
取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗30min，超净工作台上次氯酸钠处理15min，无菌水冲洗5-7遍，消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25°C，增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.5mg/L+KTl.0mg/L+0.2mg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm，附加蔗糖 25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
[0005]采用本发明制备的喙荚云实悬浮细胞，生长速度快，操作简单，能耗小，可筛选出次生代谢物含量高的细胞株。
[0006]下面将结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
【具体实施方式】
[0007]实施例1
取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗30min，超净工作台上次氯酸钠处理15min，无菌水冲洗5-7遍，消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25°C，增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.3mg/L+KT0.5mg/L+0.lmg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm，附加蔗糖 25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
[0008]实施例2
取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗30min，超净工作台上次氯酸钠处理15min，无菌水冲洗5-7遍，消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25°C，增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.7mg/L+KTl.5mg/L+0.3mg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm，附加蔗糖 25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
[0009]实施例3
取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗30min，超净工作台上次氯酸钠处理15min，无菌水冲洗5-7遍，消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA 1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25°C，增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+0.2mg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm，附加蔗糖 25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
[0010]实施例4
取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min，毛刷去除表面污溃，流水冲洗30min，超净工作台上次氯酸钠处理15min，无菌水冲洗5-7遍，消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照ΙΟΟΟΙχ，温度25°C，诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25°C，增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.7mg/L+KTl.5mg/L+0.2mg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm，附加蔗糖 25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
【权利要求】
1.一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌种胚的获得、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、悬浮细胞的培养等，主要步骤如下: (1)取喙荚云实的幼嫩种胚，按照常规的消毒方法对其进行消毒处理； (2)将步骤(I)消毒处理过的喙荚云实种胚切碎接入培养基配方为MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+AC2g/L诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，附加蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L, PH5.85-5.95，光照 ΙΟΟΟΙχ，温度 25°C ； (3)取步骤(2)诱导出来的愈伤组织放入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBAl.0mg/L+AC2g/L进行增殖培养，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，PH5.85-5.95，光照20001x，温度25 °C ； (4)取步骤(3)增殖培养出来的愈伤组织放入液体培养基改良MS+NAA0.3-0.7mg/L+KT0.5-1.5mg/L+0.1-0.3mg/L花生四烯酸进行悬浮细胞培养，附加蔗糖25g/L，PH5.8，光照 25001x，温度 25。。。
2.按照权利要求1所述的一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(I)中所述喙荚云实无菌种胚的获得为:取喙荚云实的种胚，先在漂白粉中浸泡3min,毛刷去除表面污溃,流水冲洗30min,超净工作台上次氯酸钠处理15min,无菌水冲洗5~7遍。
3.按照权利要求1所述的一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(2)中所述愈伤组织的诱导，在培养基中附加AC2g/L，可以防止愈伤组织的褐化。
4.按照权利要求1所述的一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)所述的喙荚云实悬浮细胞按照下述方法得到:高压灭菌冷却后接入长势均一的悬浮细胞，每50ml悬浮细胞添加10ml培养液，接种于250ml锥形瓶中进行悬浮振荡培养，水平振荡90r/min，振幅3cm。
5.按照权利要求1所述的一种喙荚云实愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，其特征在于:步骤(4)中加入了花生四烯酸进行悬浮细胞培养，花生四烯酸可以调控次生代谢物的含量。
【文档编号】C12N5/04GK104263692SQ201410462997
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨存 申请人:南京通泽农业科技有限公司