检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明公开一种可用于检测口蹄疫A型、O型和Asia?1型病毒的引物，由包括有这一引物的试剂盒及制备方法。本发明的用于检测口蹄疫A型、O型和Asia?1型病毒的引物基因序列共6条，再加两条通用引物。相关的实验表明，本发明的引物序列可特异性快速扩增口蹄疫A型、O型和Asia?1型病毒的核酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但同等条件下不能扩增水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒的核酸。本发明可用于快速鉴别口蹄疫A型、O型、Asia?1型病毒，并在口蹄疫病毒流行病学研究中应用。
【专利说明】检测口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可用于检测口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的引物，由包括有 这一引物的试剂盒及制备方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的动物急性、烈性传染病，主要危害猪、牛、羊痘偶蹄动物，发病 率极高，造成了巨大的政治、经济损失，因此被世界卫生组织（0ΙΕ)列为A类传染病的首位。 FMDV可以分为7个血清型，即A型、0型、C型、Asia 1型、SAT 1型、SAT 2型和SAT 3型， 每个血清又有许多不同的亚型，且各血清型之间没有交叉性免疫，同一血清型的各亚型之 间仅有部分交叉免疫。
[0003] 由于快速鉴别诊断结果有利于特定型疫苗的选择和控制疫病蔓延，口蹄疫病毒的 分型鉴别诊断一直是研究的热点。由于口蹄疫各血清型之间没有交叉保护，同一血清型的 各亚型之间仅有部分交叉免疫，这使得口蹄疫的诊断和控制更加困难。补体结合试验曾被 用于口蹄疫诊断和病毒分型，直到1970s该方法仍在一些流行病地区使用，但是该方法的 灵敏度比较低。Roeder和Le Blanc Smith通过使用兔和豚鼠抗纯化146S 口蹄疫病毒颗粒 高滴度抗血清的ELISA方法成功地检测了口蹄疫病毒抗原。该方法的灵敏度比补体结合试 验高125倍，并且被用作常规口蹄疫的诊断和病毒分型。但是ELISA方法检测含病毒的上皮 悬浮液只有约70-80%阳性结果，因此病毒必须在组织培养中进行增殖后，再通过ELISA中 进行检测和血清型分型。基于单抗的ELISA也被开发用于口蹄疫的诊断和病毒分型（Chen， Η, et al.，2012; Morioka K, et al.，2009)。最近，有人研发了基础整联蛋白 a v β6和 血清特异性单克隆抗体的夹心ELISA方法，并将该方法与普通的多克隆抗体夹心ELISA方 法进行了比较。整合蛋白/单克隆抗体的ELISA可以识别FMDV的多种抗原和不同的血清 型，虽然该方法在同一灵敏度的条件下比常规的多克隆ELISA具有更高的特异性，但是仍 然有一些FMDVs不能被检测出来，（Ferris NP，et al·，2011)。
[0004] 由于RT-PCR快速，灵敏和可靠性的优点，该方法已被广泛地用于口蹄疫诊断。近 年来各种RT-PCR检测方法已用于早期上皮细胞，细胞培养分离和其组织中口蹄疫病毒RNA 的检测（Meyer RF, et al.，1991)。Rodriguez等首次可通过RT-PCR对口蹄疫病毒0型、 A型和C型进行分型检测（Rodriguez A, et al. ,1992)。自此以后不同血清型特异性 引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7个血清型份分型检测（Callens, et al.，1997; Vangrysperre, et al.，1996)。这些检测引物位于口蹄疫病毒基因组的不同位置，包括5' 非编码区、开放阅读框和3'端非编码区。为了提高RT-PCR诊断灵敏度，多组引物结合的多 重检测也被用于口蹄疫的检测（Giridharan P，et al.，2005; Bao H，et al.，2008)，但是 这些RT-PCR方法的灵敏度依然有限，若前期再结合ELISA方法一起使用必然会使该过程更 加耗时费力。
[0005] 最近，实时荧光定量RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒的检测，该方法不需要PCR 后期处理(例如凝胶分析)且通过应信号来直接监视目标cDNA的扩增。TaqMan实验的检测 效果同抗原结合ELISA的病毒分离实验一样（Reid SM, etal. ,2003)。目前，两种不同的 实时荧光定量RT-PCR TaqMan实验已普遍使用，一种针对5'非编码区的内部核糖体进入位 点（IRES) (Reid SM，et al.，2002)和第二种针对3D (RNA聚合酶）的编码序列。实时荧 光定量RT-PCR方法的速度和准确性可以从样品核酸提取到实验建立的计算机操作的偶联 进一步提高。这使得该检测适合于主要指示病例诊断和在持续疫情中的检测。实时/定量 RT-PCR试验目前在许多发达国家作为一种口蹄疫病毒诊断和定量的常规测试。但是，这些 实验不是专门设计用于的区分口蹄疫病毒血清型。已经证明5'端非编码区检测在A血清 型病毒的检测中更敏感，而在3D检测试验对检测SAT病毒具有更高的灵敏度（King DP, et al.，2006)。另外，由于探针靶向区域的核苷酸错配，这些检测方法不能检测少量的FMDVs。 因此，任何一种单独的检测方法不能100%的检测FMDV。最近，Tam等报道了用于口蹄疫病 毒检测和病毒分型荧光多重rRT-PCR检测方法，该方法具有更高的检测灵敏度，但却不能 区分某些血清型之间的交叉反应性（Tam S，et al.，2009)。
[0006] rRT-PCR便携式设备使得FMDV野外样品的检测成为可能，然而这种设备比较昂 贵、比较脆弱且精密度要求比较高。因此，其他的方法，如环介导扩增的方法被用来进行野 外样品的检测。LAMP在一个恒定的温度扩增特异性核苷酸序列，因此不需要热循环仪。该 方法基于DNA序列通过一自动循环链置换反应扩增的原理，使用一组两个特别设计的内引 物和两个外引物和具有链置换高活性的DNA聚合酶进行该测定法et al.，2000)。引物在初 始阶段识别6个独立的靶序列和在LAMP反应的后期阶段识别4个独立的序列，使用标准的 水浴或加热块进行该反应少于一个小时，然后对结果用肉眼进行可视化观察。其优点为其 简单操作，反应快速且结果直观，这使得该方法已被许多疾病流行国家进行野外样品检测。 已有口蹄疫病毒高通量的RT-LAMP的建立，然而该方法由于容易污染造成假阳性，就尚未 得广范的认可（Dukes JP, et al·，2006)。
[0007] ELISA和RT-PCR结合的口蹄疫检测方法具有很高的可靠性和准确性，但样品从采 样点到实验室的运输问题成为口蹄疫病毒早期诊断的最大障碍。因此，在疑似疫情点急需 一种可以用于疾病快速诊断和特异性检测的方法。由Reid等人建立一种基于单克隆抗体 的口蹄疫层析试纸条技术（Reid SM，et al.，2001)。该试纸条检测上皮悬浮液测试中的口 蹄疫病毒抗原灵敏性与常规抗原ELISA灵敏性一样，且对口蹄疫病毒血清型0，A，C和Asia 1在细胞培养上清有着100%等效的敏感性，但是却不能够对这些血清型进行区分。因此， 急需一种灵敏度高的能够特异性区分不同FMDV型别的高通量的检测方法。
[0008] 研究表明，口蹄疫病毒的A、0、Asia 1三种血清型的RNA序列同源性约为70%左 右，然而其编码结构蛋白的P1区域的差异比较好，该区域的核苷酸序列也常常被用来进行 口蹄疫病毒的分型及进化分析。在病毒的这些基因中，VP1蛋白参与病毒的吸附、入侵、免 疫反应，并且与病毒的血清型特异性有关。因此VP1的基因序列通常被用来进行FMDV不同 毒株之间的亲缘关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和 弄清其来源将有助于口蹄疫的流行病学分析，具有重要意义。根据口蹄疫病毒VP1基因组 序列构建进化树分析发现，A型有10个亚型（I - X);0型也有10个亚型，即欧洲-南美洲 型（Euro-SA)、中东-南非型（ME-SA)、东南亚型（SEA)、中国型（CHY)、西非型（WA)、东非1型 (EA-1)、东非 2 型（EA-2)、东非 3 型（EA-3)、印尼 1 型（ISA-1)和印尼 2 型（ISA-2);Asia 1 有6个亚型（I -VI)。此外，VP1基因也常被用来进行A、0、Asia 1的分型检测。因此，本 发明分别选择口蹄疫病毒的Asia 1型、0型和A型VP1序列作为靶基因的区域，根据GeXP 多重PCR检测体系引物的要求设计出能够鉴别检测口蹄疫Asia 1型、0型和A型病毒的特 异性引物，并建立三个型病毒鉴别诊断的GeXP体系。
【发明内容】
[0009] 本发明提供一种可克服现有技术不足的用于分型鉴别检测口蹄疫A型、0型和 Asia具体1型病毒的技术，具体讲是是可用于检测口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的引 物，包括有这种引物的检测试剂盒，及其制备方法。
[0010] 本发明的用于检测口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的引物基因序列分别为： SEQ ID No. 1，可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAGG GTGATCTAGGGTCTCTCGC，在本发明中被命名为 FMDV-A-F ; SEQ ID No. 2,可特异性扩增口蹄疫A型病毒核酸的下游引物GTACGACTCACTATAGGGACA GGAGCTGCTTTGCAGGTGCAAT，在本发明中被命名为 FMDV-A-R ; SEQ ID No. 3,可特异性扩增口蹄疫0型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGAATAG TGACTGAACTGCTTTACCGCAT，在本发明中被命名为 FMDV-0-F ; SEQ ID No. 4,可特异性扩增口蹄疫0型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATAGGGAG ACATGTCCTCCTGCATCTG，在本发明中被命名为 FMDV-0-R ; SEQ ID No. 5,可特异性扩增口蹄疫Asia 1型病毒核酸的上游引物：AGGTGACACTATAGA ATAACTGCCTACCAGAAGCAACC ;在本发明中被命名为 FMDV-Asia 1-F ; SEQ ID No. 6,可特异性扩增口蹄疫Asia 1型病毒核酸的下游引物：GTACGACTCACTATA GGGAAGTATGTCTCCGCACGCTTC，在本发明中被命名为 FMDV-Asia 1-R。
[0011] SEQ ID No. 7,通用上游引物：AGGTGACACTATAGAATA，在本发明中被命名为UWD-F ; SEQ ID No. 8,通用下游引物：GTACGACTCACTATAGGGA，本发明中被命名为UEV-R 本发明的口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的检测试剂盒中包括有前述的八条可用于 GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No.l、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID Νο·4 、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8,其中 SEQ ID No. 7 的 5' 端添 加有Cy5荧光标签。
[0012] 本发明的试剂盒疾病诊断目的的使用方法是以被检样品的RNA为模板，用引物 SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3,,SEQ ID No. 4 ,SEQ ID No. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛细管电泳信号分 析图中241bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒A型阴阳 性；根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样 品的口蹄疫病毒Asia 1型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中287bp处是否出现峰值， 且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒0型阴阳性。
[0013] 根据相关的研究，口蹄疫病毒，P1蛋白参与病毒的吸附、入侵、免疫反应，并且与病 毒的血清型特异性有关。因此VP1的基因序列通常被用来进行FMDV不同毒株之间的亲缘 关系分析，从而研究口蹄疫的分子流行病学规律。准确鉴定分离株种属和弄清其来源将有 助于口蹄疫的流行病学分析，具有重要意义。根据口蹄疫病毒VP1基因组序列构建进化树 分析发现，A型有10个亚型（I - X) ;0型也有10个亚型，即欧洲-南美洲型（Euro-SA)、 中东-南非型（ME-SA)、东南亚型（SEA)、中国型（CHY)、西非型（WA)、东非1型（EA-1)、东非 2型（EA-2)、东非3型（EA-3)、印尼1型（ISA-1)和印尼2型（ISA-2) ;Asia 1有6个亚型 (I -VI)。此外，VP1基因也常被用来进行A、0、Asia I的分型检测。因此，本发明选择口 蹄疫病毒的A型VP 1序列作为靶基因的区域，根据GeXP多重PCR检测体系引物的要求设计 口蹄疫病毒A型的特异性引物。
[0014] GeXP 多重基因分析系统（GeXP Genetic Analysis System)是美国 Beckman Coulter公司研发的用于多基因表达定量分析的平台。该系统将毛细管电泳分离技术和 高灵敏的激光诱导荧光技术相结合，使基因表达定量分析实现了更高的灵敏度和更快的速 度。该系统以mRNA为模版，在同一 PCR反应体系中由突光标记的通用引物和特异性嵌合引 物引发的多种PCR反应，随后经毛细管电泳分离技术进行分析。该方法具有高通量、高准确 性、高灵敏度等优点，目前已被逐步应用于各种疾病病原的检测中。在我国已经先后建立了 水泡带状疱疹病毒、流感病毒、呼吸道病毒、手足口病以及乳头瘤病毒的GeXP多重PCR检测 体系，但是目前国内外尚无基于GeXP鉴别诊断口蹄疫病毒试剂盒和检测方法的报道，同样 单独或者联合使用可以鉴别检测口蹄疫病毒的GeXP方法也尚无报道。
[0015] 相关的实验表明，本发明的序列 FMDV-A-F、FMDV-A-R、FMDV-O-F、FMDV-0-R、 FMDV-Asia 1-F、FMDV-Asia 1-R、可特异性快速扩增口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的核 酸，通过核酸电泳检测到特异性条带，但同等条件下不能扩增水疱性口炎病毒和猪水泡病 病毒的核酸。
[0016] 相关的实验提示本发明的序列可在制备快速鉴别口蹄疫A型、0型、Asia 1型病毒 的GeXP诊断试剂盒中的应用，并在口蹄疫病毒流行病学研究中应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为口蹄疫A型病毒引物特异性验证的核酸电泳检测结果。其中口蹄疫A型病 毒引物可以特异性地扩增出FMDV-A型的基因组片段，而口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫A型 病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒均无特异性条带产生，说明口蹄疫A型病毒的GeXP 引物的特异性非常高。
[0018] 图2是本发明FMDV-Asia 1引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker ;1 : FMDV-Asia 1;2: FMDV-A; 3: FMDV-0; 4: VSV; 5 :SVDV，可以看出 FMDV-Asia 1 引物具有 很好的特异性，并没有出现非特异性扩增。
[0019] 图3是本发明FMDV-0引物特异性验证的电泳图，图中M: DL500 Marker ;1 : FMDV-0;2: FMDV-A; 3: FMDV-Asia 1; 4: VSV; 5:SVDV，可以看出 FMDV-0 引物具有很好的 特异性，并没有出现非特异性扩增。
[0020] 图4为口蹄疫A型病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中Μ为DL2000 Marker ;1为109个拷贝；2为108个拷贝；3为107个拷贝；4为10 6个拷贝；5为105个拷贝； 6为104个拷贝；7为103个拷贝；8为10 2个拷贝；9为10个拷贝。由图可见109~104个拷 贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发明所 设计的口蹄疫A型病毒GeXP引物在58°C条件下PCR反应最少可以检出10 4个拷贝的模板。
[0021] 图5为口蹄疫0型病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中Μ为DL2000 Marker ;1为109个拷贝；2为108个拷贝；3为107个拷贝；4为10 6个拷贝；5为105个拷贝； 6为104个拷贝；7为103个拷贝；8为10 2个拷贝；9为10个拷贝。由图可见109~104个拷 贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发明所 设计的口蹄疫〇型病毒GeXP引物在58°C条件下PCR反应最少可以检出10 4个拷贝的模板。
[0022] 图6为口蹄疫Asia 1型病毒引物PCR灵敏性验证的核酸电泳检测结果。其中Μ为 DL2000 Marker ;1为109个拷贝；2为108个拷贝；3为107个拷贝；4为10 6个拷贝；5为105 个拷贝；6为104个拷贝；7为103个拷贝；8为102个拷贝；9为10个拷贝。由图可见10 9~104 个拷贝的模板均由特异性产物产生，随着模板量的减少，产物条带变暗。从图可以看出本发 明所设计的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在58°C条件下PCR反应最少可以检出105个拷 贝的模板。
[0023] 图7为口蹄疫A型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出口 蹄疫病毒A型241bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用口蹄疫A型 病毒的引物对口蹄疫〇型病毒、口蹄疫Asia 1型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒基 因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明口蹄疫A型病毒的GeXP引物具有非常 好的特异性。
[0024] 图8为口蹄疫0型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以看出口 蹄疫病毒〇型287bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时用口蹄疫0型 病毒的引物对口蹄疫Asia 1型病毒、口蹄疫A型病毒、水疱性口炎病毒和猪水泡病病毒基 因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明口蹄疫0型病毒的GeXP引物具有非常 好的特异性。
[0025] 图9为口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物的GeXP-PCR特异性检测结果。从图可以 看出口蹄疫病毒Asia 1型280bp处出现峰值，且信号大于2000时认为是阳性结果。同时 用口蹄疫Asia 1型病毒的引物对口蹄疫0型病毒、口蹄疫A型病毒、水疱性口炎病毒和猪 水泡病病毒基因组进行GeXP反应时没有任何信号峰出现，这说明口蹄疫Asia 1型病毒的 GeXP引物具有非常好的特异性。
[0026] 图10至图13为口蹄疫A型病毒GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其中图 10 为 104copies/ML，图 11 为 103copies/ML，图 12 为 102copies/ML，图 13 为 10copies/ML。 结果显示104C〇pieS/>L~102 copies/^L的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的 检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在10 copies/KL时特异性的信号峰值不足2000。从 图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫A型病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测 出10copies/>L的模板。
[0027] 图14至图17为口蹄疫0型病毒GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其中图 14 为 104copies/ML，图 15 为 103copies/ML，图 16 为 102copies/ML，图 17 为 10copies/ML。 结果显示104C〇pieS/>L~102 copies/^L的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量的 检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在1〇2 copies/KL时特异性的信号峰值不足2000。从 图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫〇型病毒GeXP引物在本发明检测体系中可以检测 出 102 copies/^L 的模板。
[0028] 图18至图21为口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物的GeXP-PCR灵敏性检测结果，其 中图 18 为 104copies/ML，图 19 为 103copies/ML，图 20 为 102copies/ML，图 21 为 lOcopies/ KL。结果显示104C〇pieS/>L~102 copies/^L的模板均可以检测到特异性的峰值，随着模板量 的检测，峰值的信号强度也不断的减弱，在1〇2 copies/KL时特异性的信号峰值不足2000。 从图中可以看出本发明中所设计的口蹄疫Asia 1型病毒GeXP引物在本发明检测体系中可 以检测出1〇2 copies/>L的模板。
[0029] 图22至图25是本发明GeXP多重PCR灵敏性验证图，从图中可以看出在105 copies/ML、104 copies/ML、103copies/ML 和 102copies/ML 水平都能同时检测到 3 种病毒 RNA，其中在102copies/^L水平时，FMDV-0型扩增片段的信号强度低于2000,无法对下一个 稀释梯度的混合样品进行检测。因此，GeXP多重基因检测系统同时检测3种病毒的灵敏性 为 102copies/ML。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合实施例对本发明进行详细解说。
[0031] 1.序列的制备 根据GeXP引物设计要求和NCBI公布的FMDV-A型、FMDV-0型、FMDV-Asia 1的基因组， 选择保守区域设计特异性引物，并通过添加通用引物形成特异性嵌合引物，而通用引物序 列属于非生物源性的核苷酸序列，此外合成通用引物序列，并在上游通用引物的5'端添加 Cy5荧光标签。
[0032] 2.病毒基因组提取 单层细胞长至80%以上融合后，接种病毒，37°C孵育30min后弃去毒液。加入细胞维持 液，37°C 5% C02培养，定期观察细胞病变（CPE)，待90%以上细胞出现CPE后收毒。将病毒 反复冻融3次，置-20°C冰箱保存备用。使用TaKaRa公司DNA提取试剂盒提取细胞毒株中 的 RNA。
[0033] 3. FMDV引物特异性验证 以提取纯化的病毒RNA为模板进行扩增，实验体系如下：
【权利要求】
1. 用于检测口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的引物，其特征在于引物基因序列为SEQ ID No.l、SEQ ID No.2、SEQ ID Νο·3、和 SEQ ID Νο·4、SEQ ID Νο·5、和 SEQ ID No. 6。
2. -种口蹄疫A型、0型和Asia 1型病毒的检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括有 八条用于GeXP多重基因分析系统的扩增引物SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8,其中 SEQ ID No. 7 的5'端添加有Cy5荧光标签。
3. 权利要求2所述试剂盒非疾病诊断目的的使用方法，其特征在于以被检样品的RNA 为模板，用 SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、、SEQ ID Νο·4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8引物进行扩增，扩增产物进行毛细管电泳分析，根据毛 细管电泳信号分析图中241bp处是否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫 病毒A型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中280bp处是否出现峰值，且信号大于2000 时判定被检样品的口蹄疫病毒Asia 1型阴阳性；根据毛细管电泳信号分析图中287bp处是 否出现峰值，且信号大于2000时判定被检样品的口蹄疫病毒0型阴阳性。
【文档编号】C12N15/11GK104195268SQ201410464443
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】张强, 卢昌, 赵志荀, 吴国华, 颜新敏, 李应国, 岳华, 周晓黎, 李健, 朱海霞, 代雪玲, 田波, 芦晓立, 高顺平, 王曼 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所