利用rt-pcr法进行家蚕相对强健品种选择的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法：选用饲养至5龄第2天的家蚕，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)～5)：1)将家蚕进行高温冲击处理；2)将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪体；3)对脂肪体进行RNA抽提；4)以提取的RNA为模板进行反转录；5)利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达量；5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为X1，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2，X1+2(X2－X1)＝Y；6)将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。
【专利说明】利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种家蚕品种的辅助选育方法，具体地说，是涉及一种利用RT-PCR法 进行家蚕强健性品种选择的方法。
【背景技术】
[0002] 中国是世界养蚕业的发源地，具有五千年的悠久历史。栽桑养蚕曾经是广大农村 经济发展的支柱和农民脱贫致富的重要手段；蚕丝业也是传统的出口创汇产业，为国民经 济建设作出了重要贡献。家蚕新品种选育是蚕丝业科技进步的基础和核心之一，在新中国 成立后，我国的家蚕品种选育取得了巨大的成就，在全国范围内先后进行了多次蚕品种的 更新换代，极大地促进了蚕丝业的发展。但随着农村经济的快速发展，第二、三产业的迅猛 崛起，大量农村劳动力涌入工商企业，从事养蚕业的大多为老弱及妇女，传统的精细饲养方 法已不适合当今时代发展的需要，需要有一种能适合省力化、粗放经营的蚕品种；另一方 面，家蚕作为实验材料及生物反应器的优异特性正逐步得到社会的肯定，利用家蚕生产具 有高科技含量的生物制品已经取得重大进展，迫切需要有一种能周年进行饲养的强健性蚕 品种。传统的强健性蚕品种的选育大多采用诱发鉴定方法，即人工创造所需的不良环境 (高温多湿、添食各种病毒、病菌及微量农药或污染物），促使参加鉴定的品种暴露出遗传 本质差异，达到筛选鉴定的目的，但这种方法需要将家蚕饲养至上簇、结茧及化蛹，通过调 查这些性状了解该品种的强健性，时间周期长，而且浪费大量的人力物力。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健性品种选 择的方法，采用本发明可选择得到相对强健的品种。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种 选择的方法：选用饲养至5龄第2天的家蚕，以至少2种的家蚕作为待测对象，对每种家蚕 均依次进行如下步骤1)?5) :
[0005] 1)、将家蚕进行高温冲击处理，所述高温冲击处理为：将饲养至5龄第2天的家蚕 于34. 5?35. 5°C放置3. 5?4. 5小时；
[0006] 2)、将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取 脂肪体；
[0007] 3)、对步骤2)所得的脂肪体进行RNA抽提；
[0008] 4)、以提取的RNA为模板进行反转录，得CDNA ;
[0009] 5)、利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表 达量；
[0010] 5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为XI，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2， X1+2(X2 - XI) =Y；
[0011] 6)、将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性 强健品种。
[0012] 备注说明：本发明是将所得的每种家蚕所对应的热激蛋白基因（Shsp23. 7)表达 量进行比对，选择大的热激蛋白基因表达量所对应的家蚕为家蚕相对性强健品种。
[0013] 荧光定量中目的基因（即，热激蛋白基因，亦称标记基因）表达量大的个体为抗 高温的个体，其对高温等不良环境的抵抗性强，因此作为强健性品种留种。高温指34. 5? 35. 5°C (特别指 35°C )。
[0014] 备注说明：待测对象最终所得的Y值之间的差距越大，越能精确的说明Y值大的所 对应的为家蚕相对强健品种。
[0015] 一般而言，Y大于10,可被认定为家蚕相对强健品种。
[0016] 作为本发明的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法的：
[0017] 所述步骤5)的PCR检测体系为
[0018]
【权利要求】
1. 利用RT-PCR法进行家蚕相对强健品种选择的方法，其特征是：选用饲养至5龄第2 天的家蚕，以至少2种的家蚕作为待测对象，对每种家蚕均依次进行如下步骤1)?5): 1) 、将家蚕进行高温冲击处理；所述高温冲击处理为：将饲养至5龄第2天的家蚕于 34. 5?35. 5°C放置3. 5?4. 5小时； 2) 、将高温冲击处理家蚕以及饲养至5龄第2天的家蚕分别处死后进行解剖提取脂肪 体； 3) 、对步骤2)所得的脂肪体进行RNA抽提； 4) 、以提取的RNA为模板进行反转录，得cDNA ; 5) 、利用所得的cDNA进行热激蛋白基因的荧光定量PCR检测，得热激蛋白基因表达 量； 5龄第2天家蚕的基因荧光表达量为XI，高温冲击后家蚕的基因荧光表达量为X2， X1+2(X2 - XI) = Y ； 6) 、将不同品种的家蚕所对应的Y进行比对，Y值大的所对应的家蚕为家蚕相对性强健 品种。
2. 根据权利要求1所述的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法，其特征 是： 所述步骤5)的PCR检测体系为
PCR 检测条件为：95°C，3min ;95°C变性 15sec，60°C退火 40sec，72°C延伸 40sec，共循 环 40 个循环；72°C lOmin。
3. 根据权利要求2所述的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法，其特征 是： 所述PCR检测体系中的引物为： 5' -ATGAAGAATTTCATTCC-3' 5' -TTATTGCATTTCTGAC-3'。
4. 根据权利要求2或3所述的利用RT-PCR法进行家蚕相对性强健品种选择的方法，其 特征是：所述高温冲击处理温度为35°C，时间为4小时。
【文档编号】C12Q1/68GK104293918SQ201410469260
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】屠振力 申请人:浙江大学