人源化的FcγR小鼠的制作方法

人源化的FcγR小鼠的制作方法
【专利摘要】提供了遗传修饰的非人动物和用于产生和使用它们的方法和组合物，其中所述遗传修饰包括内源低亲和力FcγR基因座的缺失，并且其中小鼠能够表达功能性FcRγ链。描述了遗传修饰的小鼠，包括从内源FcγR基因座表达低亲和力人FcγR基因的小鼠，并且其中所述小鼠包含功能性FcRγ链。提供了在宿主免疫系统的辅助细胞上表达至多5个低亲和力人FcγR基因的遗传修饰的小鼠。
【专利说明】人源化的Fc γ R小鼠
[0001] 本申请是申请号为201080064262. 4、申请日为2010年12月17日、发明名称 为"人源化的Fc Y R小鼠"的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/ US2010/060925的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2009年12月21日，申请号为 61/288, 562的美国临时申请的优先权。 发明领域
[0002] 本发明领域是缺失内源鼠 Fc γ R基因的遗传修饰的非人动物，包括内源Fc γ R基 因被人Fc γ R基因替代的遗传修饰的动物，包括能够表达至少2、3、4或5种功能性人低亲 和力FcyR基因的小鼠，以及包括包含不表达内源低亲和力FcyR基因的免疫细胞的遗传 修饰的小鼠。
[0003] 背景
[0004] Fc受体（FcR)是在哺乳动物的进行免疫系统的多种功能的免疫系统的细胞的表 面上发现的蛋白质。FcR以多种类型存在于多种细胞上，并且介导多种免疫功能，例如结合 附着至被感染的细胞或侵袭性病原体的抗体、刺激吞噬细胞或细胞毒性细胞以通过抗体介 导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)破坏微生物或感染的细胞。
[0005] ADCC是这样的过程：免疫系统的效应细胞裂解被抗体结合的靶细胞。该过程依赖 于对外源抗原或细胞的先行接触，从而产生抗体应答。ADCC可通过效应细胞例如天然杀伤 (NK)细胞，通过效应细胞表面上表达的FcR对本身结合至外源抗原或细胞的抗体的Fc部分 的结合来介导。由于FcR在免疫应答中起着中心作用，因此需要有共表达多种人FcR的有 用的非人动物，包括共表达多种人低亲和力FcR的非人动物。存在对用于研究和阐明人疾 病治疗（特别是抗肿瘤治疗和用于治疗自身免疫疾病的治疗）和药物开发（特别是在人抗 体药剂的开发、设计和测试中）的人FcR功能和人的ADCC过程的非人动物模型。
[0006] 附图概述
[0007] 图1是小鼠的野生型低未和力Fc γ R基因座的不意图，显不了小鼠 Fc γ RIIB，Fc γ RIV和Fc γ RIII基因以及用于这些基因的靶向缺失的小鼠 Fc γ R靶向载体， 其包括侧翼连接有位点特异性重组位点的新霉素盒。
[0008] 图2显示了就B细胞（抗-⑶19)，NK细胞（抗-NKp46)和巨噬细胞（抗-F4/80) 门控的脾细胞的直方图，包括野生型和低亲和力FcYRa链基因缺陷型小鼠 （mFcYR K0) 的内源mFc YRII和mFc YRIII基因的表达。
[0009] 图3A-3D显示了在人源化CD20小鼠（hCD20)和培育成Fc γ R敲除小鼠的人源化 0)20小鼠（hO)20/FcYR K0)中在几个淋巴细胞区室（lymphocyte compartment):骨髓（图 3A)、血液（图3B)、淋巴结（图3C)和脾（图3D)中利用具有小鼠 Fc(Ab 168)或人Fc(Ab 735)的人抗-人⑶20抗体对B细胞进行的体内耗尽。对于每一个图，y-轴显示门控的B 细胞（B220+/IgM+或B220+/CD19+)的百分比，X-轴显示每一个动物组的抗体剂量：10mg/kg 对照抗体（C)，2mg/kg人抗-人⑶20抗体（2Ab和10mg/kg人抗-人⑶20抗体（10Ab)。 [0010] 图4是低亲和力小鼠 FcyR基因座的新霉素靶向缺失和用于将两个人低亲和力 Fc YR基因 （hFc YRIIIA和hFc YRIIA)插入缺失的小鼠基因座的第二靶向载体的示意性描 述，所述第二靶向载体包括侧翼连接有位点特异性重组位点的潮霉素盒。为了在血小板上 表达hFc γ RIIA，使用了可操作地连接于人Fc γ RIIIA-IIA靶向载体的hFc γ RIIA基因的延 长的启动子区域；为了阻止在血小板上表达hFcYRIIA，删除或实质上删除所述启动子区 域。
[0011] 图5A显示针对NK细胞（抗-NKp46和巨噬细胞（抗-F4/80)的门控的脾细胞的 直方图，包括野生型和人？(^1?11从-1从纯合子小鼠（人？(^1?11从/^(^1?1从！10)的人 Fc YRIIIA的表达。
[0012] 图5B显示针对嗜中性粒细胞（抗-Ly6G)和巨噬细胞（抗-F4/80)的门控的脾细 胞的直方图，包括野生型和人？(^1?11从-1从纯合子小鼠（人？(^1?11从/^(^1?1从！10)的 人Fc YRIIA的表达。
[0013] 图6为包括两个低亲和力人Fc γ R基因 （hFc γ RIIIA和hFc γ RIIA)的插入的低 亲和力小鼠 Fc γ R基因座的潮霉素靶向缺失以及用于插入3个额外的低亲和力人Fc γ R基 因 （hFc γ RIIB、hFc γ RIIIB和hFc γ RIIC)的第三靶向载体和侧翼连接有位点特异性重组 位点的新霉素盒的不意图。
[0014] 图7显示针对B细胞（抗-CD19)和嗜中性粒细胞（抗-Ly6G)的门控的脾细胞 的直方图，包括野生型和人Fc γ RIIIA-IIIB-IIA-IIB-IIC纯合子小鼠（人Fc γ RIIIA/ Fc γ RIIIB/Fc γ RIIA/Fc γ RIIB/Fc γ RIIC H0)的人 Fc γ RIIB 和人 Fc γ RIIIB 的表达。
[0015] 概述
[0016] 提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物以及用于产生和使用它们的方法和 组合物。在不同的方面，非人动物包含人FcyR受体、内源低亲和力FcyR受体的缺失和/ 或人Fc γ R受体在内源小鼠低亲和力Fc γ R基因座上对内源Fc γ R受体的替代。
[0017] 在一个方面，提供了包含功能性FcRY链的遗传修饰的细胞、非人胚胎和非人动 物，其中所述细胞、胚胎和动物包含进一步修饰，包括用一个或多个低亲和力人Fc γ R基因 序列（例如，选自 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、Fc γ RIIIB 及其组合）对低 亲和力内源非人？(^1?基因序列（例如，？(^1?118、？(^1^和？(^1?111)的替代。
[0018] 在一个实施方案中，细胞、非人胚胎和非人动物为鼠。在一个实施方案中，功能性 FcRy链为小鼠 FcRy链。在一个实施方案中，小鼠 FcRy链为对于小鼠、细胞或胚胎而言 是内源性的FcRy链。
[0019] 在一个实施方案中，细胞、胚胎和动物为小鼠，并且小鼠表达人低亲和力FcyR受 体的功能性α链和功能性内源小鼠 Y链。
[0020] 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠不表达选自FcYRIIBa链、 FcYRIVa链、FcYRIIIa链及其组合的内源α链；其中小鼠表达功能性内源小鼠 Y链。
[0021] 在具体的实施方案中，小鼠不表达功能性Fc γ RIIB a链，不表达功能性 FcyRIVa链，并且不表达功能性FcyRIIIa链。
[0022] 在一个实施方案中，小鼠基因组包含内源FcYRIIBa链的缺失、内源FcYRIVa 链的缺失和内源FcYRIIIa链的缺失。
[0023] 在一个实施方案中，小鼠包括内源FcYRIIBa链的缺失、内源FcYRIVa链的缺 失和内源Fc γ RIII a链的缺失，并且还包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较减 小的对抗原产生免疫应答的能力。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括减小的抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。在一个实施方案中，减小的免疫应答包括在细胞杀伤测 定中减小的实现抗体依赖性NK细胞杀伤的能力。在具体的实施方案中，ADCC或抗体依赖 性NK细胞杀伤的减小为至少50%，在一个实施方案中是至少75%，在一个实施方案中是至 少 90%。
[0024] 在一个实施方案中，小鼠包含内源FcyRIIBa链的缺失、内源FcyRIVa链的缺 失和内源Fc γ RIII a链的缺失，以及还包括在用抗原免疫后与野生型小鼠例如不包含缺 失的相同或相似品系的小鼠相比较，增强的体液抗体应答。在一个实施方案中，增强的体液 抗体应答为野生型小鼠的2倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的 3倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野生型小鼠的5倍。在一个实施方案中， 增强的体液抗体应答为野生型小鼠的7倍。在一个实施方案中，增强的体液抗体应答为野 生型小鼠的10倍。在具体的实施方案中，体液抗体应答通过每微克小鼠的血清蛋白特异性 结合抗原（已用其免疫小鼠的）的抗体的微克数来测量。在一个实施方案中，增强的体液 抗体应答是就野生型小鼠对其展示耐受性的抗原或野生型小鼠对其展示较弱或最小的体 液免疫应答的抗原而言的。在具体的实施方案中，抗原是小鼠抗原。在具体的实施方案中， 抗原是展示与小鼠蛋白具有至少约95%、96%、97%、98%或99%的同一性的人抗原。
[0025] 在一个方面，提供了包含低亲和力人FcYRa链基因对低亲和力小鼠 FcYRa链 基因的替代的遗传修饰的小鼠，其中所述替代在内源小鼠 FcYRa链基因基因座上。在一 个实施方案中，低亲和力小鼠？(3^1^链基因选自？(3￥1?118、？(3￥1?1￥和？(3￥1?111〇链基 因。在具体的实施方案中，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠表达内源FcRy链，并且 其中低亲和力人FcYRa链基因为FcYRIIIAa链。在另一个具体的实施方案中，遗传修 饰的小鼠在NK细胞上表达内源FcRy链和功能性人FcYRIIIAa链。在具体的实施方案 中，NK细胞上的FcYRIIIAa链的功能性反映在人抗体介导的NK杀伤（例如，由人抗体介 导的ADCC)。
[0026] 在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中所述遗传修饰包 括人FcYRa链基因对至少一个内源低亲和力FcYRa链基因的替代，并且所述细胞、胚胎 或动物表达功能性FcRy链。在一个实施方案中，功能性FcRy链为内源FcRy链。在一 个实施方案中，低亲和力人FcYRa链基因选自FcYRIIAa链基因、FcYRIIIAa链基因及 其组合。在具体的实施方案中，人FcyRIIA基因包含多态性，其中多态性选自131His低应 答者多态性和131Arg高应答者多态性。在具体的实施方案中，Fc γ RIIA多态性为131His 低应答者多态性。在一个实施方案中，Fc γ RIIIA基因为特定等位基因变体，其中等位基因 变体选自158Val变体和158Phe变体。在具体的实施方案中，FcyRIIIA等位基因变体为 158Val 变体。
[0027] 在一个实施方案中，低亲和力人Fc YR基因选自Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIB 基因及其组合。在具体的实施方案中，人FcyRIIB基因包含氨基酸置换，其中所述置换选 自232Ile或232Thr置换。在另一个具体的实施方案中，氨基酸置换为232Ile置换。在具 体的实施方案中，FcyRIIIB基因为特定等位基因变体，其中所述等位基因变体选自NA1变 体和NA2变体。在另一个具体的实施方案中，Fc γ RIIIB等位基因变体为NA2变体。
[0028] 在一个实施方案中，低亲和力人FcyRa链基因选自FcyRIIA、FcyRIIB、 Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、Fc γ RIIIB α 链基因及其组合。
[0029] 在一个实施方案中，低亲和力小鼠 FcYRIVa链基因和FcYRIIIa链基因被至 少一个低亲和力人FcYRa链基因替代。在一个实施方案中，低亲和力小鼠 FcYRIVa链 基因和FcYRIIBa链基因被至少一个低亲和力人FcYRa链基因替代。在一个实施方案 中，低亲和力小鼠 FcyRIIBa链基因和FcyRIIIa链基因被至少一个低亲和力人FcyRa 链基因替代。在具体的实施方案中，至少一个低亲和力人FcYRa链基因选自FcyRIIA、 FcYRIIB、FcYRIIC、FcYRIIIA、FcYRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案 中，至少一个低亲和力人FcyRa链基因选自FcyRIIAa链基因、FcyRIIIAa链基因及 其组合。在另一个具体的实施方案中，至少一个低亲和力人Fc γ R a链基因选自Fc γ RIIB、 FCYRIIC、FCYRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，低亲和力小鼠 FcyR基因被人FcYRIIAa链基因和人FcYRIIIAa链基因替代。在另一个具体的实施方 案中，低亲和力人FcyRIIA和FcyRIIIAa链基因包含变体，其中FcyRIIAa链基因包含 131His变体并且FcYRIIIAa链基因包含158Val变体。在另一个具体的实施方案中，低亲 和力小鼠 FcyRa链基因被下列低亲和力人FcyRa链基因替代：？〇^1?118、？(3￥1?11(：和 FcyRIIIB。在另一个具体的实施方案中，低亲和力人FcyRIIBa链基因和FcyRIIIBa 链基因包含变体，其中FcyRIIBa链基因包含232Ile变体并且FcyRIIIBa链基因包含 NA2变体。
[0030] 在一个实施方案中，遗传修饰包括小鼠和人染色体1的共线（syntenic)基因组 序列的替代。在具体的实施方案中，遗传修饰包括：包含低亲和力人FcyR基因的基因组 片段对包含内源低亲和力小鼠 FcyR基因的基因组片段的替代。在另一个具体的实施方 案中，来自染色体1:172, 889, 983至染色体1:172,989,911的小鼠基因组被包含人染色体 1:161，474, 729至染色体1:161，620, 458的人基因组片段替代。
[0031] 在一个方面，提供了遗传修饰的细胞、非人胚胎或非人动物，其中遗传修饰包括一 个或多个内源低亲和力受体a链基因的敲除、包含一个或多个人FcYRa链基因的附加体 的存在。在具体的实施方案中，所述细胞、胚胎或动物表达功能性FcRy链。在具体的实施 方案中，附加体为微小染色体。在一个实施方案中，功能性FcRY链对于所述细胞、胚胎或 动物是内源的。
[0032] 在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，包括用低亲和力人FcYRa链基因替代低 亲和力小鼠 Fc γ Ra链基因，小鼠包含小鼠 FcRy链基因，并且小鼠表达功能性人低亲和 力FcyR受体。在一个实施方案中，功能性低亲和力FcyR受体在其中低亲和力FcyR受 体在人中表达的细胞类型上表达。在具体的实施方案中，功能性人低亲和力Fc γ R受体为 Fc γ RIIIA并且Fc γ RIIIA在NK细胞上表达。
[0033] 在一个实施方案中，小鼠包含两个小鼠 FcyRa链基因的缺失。在另一个实施方 案中，小鼠包含3个小鼠 Fc γ R a链基因的缺失。
[0034] 在一个实施方案中，小鼠包括用至少1个人FcYRa链基因对3个小鼠 FcYRa 链基因的替代。在另一个实施方案中，小鼠包括用至少1个FcYRa链基因对2个小鼠 FcyRa链基因的替代。在具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人FcYRa链基因对3 个小鼠 FcYRa链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用3个人FcYRa链基因替 代3个小鼠 FcYRa链基因。在另一个具体的实施方案中，小鼠包括用至少2个人FcYRa 链基因对2个小鼠 FcYRa链基因的替代。在另一个具体的实施方案中，用至少3个人 FcyRa链基因替代2个小鼠 FcyRa链基因。
[0035] 在一个实施方案中，低亲和力小鼠 FcyRa链基因选自FcyRIIB、FcyRIV、 FcyRIIIa链基因及其组合。
[0036] 在一个实施方案中，低亲和力人FcyRa链基因选自FcyRIIA、FcyRIIB、 FCYRIIC、FCYRIIIA、FCYRIIIBa链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和力人 FcYRa链基因选自FCYRIIA、FCYRIIIAa链基因及其组合。在一个实施方案中，低亲和 力人？(^1?〇链基因选自？(^1?118^(^1?11(：、？(^1?1118〇链基因及其组合。
[0037] 在一个实施方案中，用至少1个人Fc YRa链基因替代低亲和力小鼠 FcYRIVa 链基因和FcYRIIIa链基因。在一个实施方案中，用至少1个人FcYRa链基因替代低 亲和力小鼠 FcYRIVa链基因和FcYRIIBa链基因。在一个实施方案中，用至少1个人 FcyRa链基因替代低亲和力小鼠 FcyRIIBa链基因和FcyRIIIBa链基因。在具体的 实施方案中，至少1个人Fc YRa链基因选自Fc yRIIA、Fc yRIIB、Fc yRIIC、Fc YRIIIA、 FcYRIIIBa链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少1个人FcYRa链基因 选自？〇^1?1从、？(3￥1?11从 〇链基因及其组合。在另一个具体的实施方案中，至少1个人 卩(^1^链基因选自？(^1?118、？(^1?11(：、？(^1?1118〇链基因及其组合。在另一个具体的 实施方案中，用下列人FcYRa链基因：FcyRIIA和FcyRIIIA替代小鼠 a链基因。在另 一个具体的实施方案中，用下列人FcyRa链基因：？(^1?118、？(^1?11(：和？(^1?1118替代 小鼠 a链基因。
[0038] 在一个方面，提供了包含低亲和力人FcYRa链和小鼠 FcRy链亚基的遗传修饰 的小鼠，其中所述小鼠在选自嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬 细胞、血小板、朗格汉斯细胞、树突细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞及其组合的细胞 上表达人FcYRa链。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒 细胞、血小板、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人FcyRIIA a链。在一个 实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人Fc γ RIIA a链起始或介导的吞噬作用、ADCC和 细胞活化。在一个实施方案中，小鼠表达在选自巨噬细胞、NK细胞、单核细胞、肥大细胞、 嗜酸性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞、至少一种T细胞类型及其组合的细胞上表达人 Fc γ RIIIA a链。在一个实施方案中，小鼠能够进行通过在NK细胞上表达的人Fc γ RIIIA a 链介导的ADCC。在具体的实施方案中，小鼠展示响应于包含人Fc的抗体的hFc YRIIIA-介 导的ADCC。
[0039] 在一个实施方案中，小鼠表达人FcyRIIAa链和人FcyRIIIAa链。在一个实 施方案中，人FcyRIIAa链在血小板上表达并且人FcyRIIIAa链在NK细胞上表达。在 一个实施方案中，小鼠能够进行由包含人Fc的抗体介导的ADCC，其中所述介导通过在辅助 细胞表面上表达的人FcYRIIAa链或人FcYRIIIAa链来进行。在一个实施方案中，人 FcyRIIAa链不在血小板上表达。在其中人FcyRIIAa链不在血小板上表达的具体实施 方案中，小鼠缺失或实质上缺失可操作地连接于人基因组中的人FcYRIIAa链的人启动 子序列。
[0040] 在一个实施方案中，小鼠在选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸 性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人Fc γ RIIB a 链。在具体的实施方案中，小鼠在B细胞和肥大细胞上表达人FcYRIIBa链。在另一个具 体的实施方案中，小鼠能够进行通过表达的人Fc γ RIIB a链介导的免疫复合物的吞噬作 用。在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、树突 细胞、朗格汉斯细胞及其组合的细胞上表达人FcyRIIC a链。在具体的实施方案中，小鼠 能够进行通过表达的人Fc γ RIIC a链启始的吞噬作用、ADCC和细胞活化。
[0041] 在一个实施方案中，小鼠在嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达人FcyRIIIB a 链。在具体的实施方案中，小鼠能够进行细胞活化、吞噬作用、ADCC和脱粒，其中活化、吞噬 作用、ADCC和脱粒通过表达的人Fc γ RIIIB a链介导。
[0042] 在一个方面，提供了包含内源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基因的缺失和人 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和Fc γ RIIIB基因的插入的小鼠，其中所述小鼠 包含功能性小鼠 FcR γ链基因。
[0043] 在一个实施方案中，小鼠包含由内源Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因编码的 a 链的缺失和由人 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA 和 Fc γ RIIIB 基因编码的 a 链的插入。
[0044] 在一个实施方案中，人 Fc YRIIA、Fc YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIA 和 Fc YRIIIBa 链基因的插入位于小鼠基因组的随机位置。
[0045] 在一个实施方案中，人 Fc YRIIA、Fc YRIIB、Fc YRIIC、Fc YRIIIA 和 Fc YRIIIBa 链基因的插入位于内源小鼠低亲和力Fc Y Ra链基因座。
[0046] 在一个实施方案中，小鼠在NK细胞和巨噬细胞上表达人FcyRIIIA。在具体的实 施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有NK细胞表达人Fc γ RIIIA。在具体 的实施方案中，来自小鼠的脾细胞样品的所有或大体上所有巨噬细胞表达人Fc γ RIIIA。
[0047] 在一个实施方案中，小鼠在选自嗜中性粒细胞、巨噬细胞及其组合的细胞类型上 表达选自人Fc γ RIIA、人Fc γ RIIIA及其组合的人Fc γ R。在具体的实施方案中，小鼠在 小鼠的脾细胞样品的全部或大体上全部嗜中性粒细胞和巨噬细胞上表达人Fc γ RIIA和人 Fc yRIIIAo
[0048] 在一个实施方案中，小鼠在来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的B细胞和B 细胞的嗜中性粒细胞上表达人Fc γ RIIB和人Fc γ RIIIB。在具体的实施方案中，小鼠在 来自小鼠的B细胞门控的脾细胞样品的全部或大体上全部B细胞和嗜中性粒细胞上表达 卩(^尺1118和卩(^1?118。
[0049] 在一个实施方案中，小鼠还包含人源化⑶20基因。在一个实施方案中，还包含人 源化CD20基因的小鼠在用包含Fc的抗-CD20结合蛋白处理后展示B细胞的（体内）耗尽。 在一个实施方案中，所述耗尽存在于选自骨髓、血液、淋巴结、脾及其组合的区室中。在一个 实施方案中，Fc为人Fc。在一个实施方案中，Fc为小鼠 Fc。在一个实施方案中，抗-CD20 结合蛋白为抗-CD20抗体。
[0050] 在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的细胞。在一个实施方案中，所述 细胞选自胚胎干细胞（ES)、多能细胞、诱导的多能细胞和全能细胞。在一个实施方案中，细 胞选自小鼠细胞和大鼠细胞。在具体的实施方案中，细胞为ES细胞。在更具体的实施方案 中，细胞为小鼠 ES细胞。
[0051] 在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的非人胚胎。在一个实施方案中， 非人胚胎选自小鼠胚胎和大鼠胚胎。
[0052] 在一个方面，提供了测定治疗剂的功效的方法。在一个实施方案中，治疗剂为包含 人Fc的抗体（例如，单、双、三、多特异性的）。在一个实施方案中，治疗剂为人抗体。在一 个实施方案中，功效为治疗剂介导的细胞杀伤（例如，ADCC)的功效。在具体的实施方案中， 人治疗剂是包含人免疫球蛋白重链的Fc的融合蛋白。在一个实施方案中，给本文中描述的 小鼠施用治疗剂并且测量治疗剂依赖性ADCC的水平。在一个实施方案中，通过给小鼠施用 治疗剂，随后检测（例如，从获自动物的样品（例如，血液）进行体外检测）治疗剂对表达 Fc γ R的细胞上的人低亲和力Fc γ R的结合来将小鼠用于评估治疗剂的ADCC活性。在具体 的实施方案中，从小鼠分离小鼠的辅助细胞，并且测试其在治疗剂存在和不存在的情况下 介导治疗剂依赖性ADCC的能力。
[0053] 在一个方面，提供了用于确定低亲和力FcyR是否与人疾病或障碍相关的方法， 包括测定根据本发明的小鼠的与人疾病或障碍相关的性状的步骤。在一个实施方案中，所 述性状为与一个或多个低亲和力Fc γ R的功能的不存在或丧失相关的表型。在具体的实施 方案中，疾病或障碍为自身免疫疾病或障碍。在具体的实施方案中，自身免疫疾病或障碍选 自类风湿关节炎（RA)、系统性红斑狼疮（SLE)、I型糖尿病、Guillain-Barr6综合征、硬化 症、多发性硬化、Goodpasture' s综合征、Wegener' s肉芽肿病和实验性自身免疫脑脊髓炎 (EAE)。在具体的实施方案中，小鼠包含低亲和力Fc γ R中的多态性，并且性状选自与大部 分不具有多态性的人群相比较增强的介导ADCC的能力以及与大部分不具有多态性的人群 相比较减小的介导ADCC的能力。
[0054] 在一个方面，提供了用于在小鼠中产生抗-人FcRa链抗体的方法，包括将根据本 发明的小鼠与本文中描述的人FcR接触。在一个实施方案中，识别人的FcR的抗体分离自 小鼠。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码识别人FcR的抗体的全部或部分可变区的 核酸序列。
[0055] 在一个方面，提供了用于测定抗-人FcR抗体将分子靶向表达FcR的细胞以吞噬 靶分子的能力的方法，包括将本文中描述的小鼠与包含抗-人FcR抗体的试剂接触，并且测 量革G分子的吞噬。
[0056] 在一个方面，提供了用于在小鼠中产生针对抗原的抗体的方法，所述抗原在对于 一种或多种Fc Y R为野生型的小鼠中具有差的免疫原性，所述方法包括将本文中描述的缺 失小鼠低亲和力FcR但表达Fc γ R γ链的小鼠与在对于一种或多种Fc γ R为野生型的小鼠 中具有差免疫原性的抗原接触，并鉴定识别所述差抗原性的抗原的抗体。在一个实施方案 中，所述方法包括从小鼠分离抗体。在另一个实施方案中，鉴定和克隆了编码抗体的全部或 部分可变区的核酸序列。
[0057] 在一个方面，提供了用于产生能够产生包含人可变区的抗体的小鼠的方法，包括 将本文中描述的第一小鼠与第二小鼠交配的步骤，所述第二小鼠包含（a) -个或多个人免 疫球蛋白可变区基因区段和一个或多个人恒定区基因；或（b)可操作地连接于小鼠恒定区 基因的一个或多个人免疫球蛋白可变区基因区段，其中所述人基因区段在小鼠可变区基因 区段的基因座上替代可变区基因区段。
[0058] 在一个实施方案中，第二小鼠（a)包含含有一个或多个人免疫球蛋白轻链可变区 基因区段和人轻链恒定基因的转基因和含有一个或多个人免疫球蛋白重链可变区基因区 段和一个或多个人重链恒定基因的转基因。在一个实施方案中，包含一个或多个人免疫球 蛋白重链可变区基因区段的转基因包两个或更多个重链恒定基因并且能够进行类别转换 (class switching)。在具体的实施方案中，小鼠包含失活的内源轻链基因座和/或失活的 内源重链基因座。在具体的实施方案中，小鼠包含内源轻链基因座的缺失和/或内源重链 基因座的缺失。
[0059] 在一个实施方案中，第二小鼠（b)分别在小鼠重链和轻链基因座上包含人重链和 人轻链可变区基因区段。
[0060] 在一个方面，提供了用于选择抗肿瘤抗体的方法，包括测定抗体介导ADCC的能力 的步骤，其中通过测定由本文中描述的小鼠的细胞介导的ADCC来测试抗体介导ADCC的能 力，如果抗体利用本文中描述的遗传修饰的小鼠的细胞介导ADCC，则选择该抗体。在具体 的实施方案中，测定抗体对遗传修饰的小鼠的细胞的结合，并且就其结合细胞上的人Fc γ R 的能力选择抗肿瘤抗体。在具体的实施方案中，人FcyR为低亲和力FcyR。
[0061] 在一个实施方案中，抗肿瘤抗体通过与抗肿瘤抗体通过野生型小鼠的细胞介导 ADCC的能力相比较的增强的通过小鼠的细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施 方案中，抗肿瘤抗体通过其通过NK细胞介导ADCC的能力来进行鉴定。在具体的实施方案 中，所述NK细胞表达人Fc γ RIIIA。
[0062] 在一个实施方案中，提供了用于选择抗肿瘤试剂的方法，包括给第一非人动物施 用包含人Fc或修饰的人Fc的试剂的步骤，其中第一非人动物按照本发明进行了遗传修饰 并且包含人肿瘤；给包含肿瘤的第二非人动物施用试剂的步骤；和测定第一非人动物和第 二非人动物在施用试剂后延缓人肿瘤生长的能力，其中如果试剂在第一非人动物中但非在 第二非人动物中展示增强的延缓人肿瘤生长的能力，则其被选择为抗肿瘤试剂。
[0063] 在一个实施方案中，第一非人动物经修饰包含内源FcRa -亚基的缺失，并且经修 饰包含选自 Fc γ RIIA a -亚基、Fc γ RIIB a -亚基、Fc γ RIIC a -亚基、Fc γ RIIIA a -亚基、 Fc γ RIIIB a -亚基及其组合的人FcR a -亚基。在一个实施方案中，第二动物为野生型动 物。在一个实施方案中，第一非人动物表达内源FcRy链。
[0064] 在一个实施方案中，第一非人动物表达功能性内源Fc YRI。
[0065] 在一个方面，提供了用于产生小鼠的方法，所述小鼠缺失低亲和力小鼠 FcyR，表 达功能性 FcR γ 链并且包含编码人Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和 Fc γ RIIIB 的a链的基因，包括用人FcYRa链在小鼠 FcYRa链基因座上替代低亲和力小鼠 FcyRa链的步骤。
[0066] 在一个实施方案中，第一步骤包括缺失内源FcyRIIB、FcyRIV和FcyRIII基 因的a链和插入人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的a链；第二步骤包括将人FcyRIIB、 FcyRIIC和FcyRIIIB基因的a链插入由第一步骤产生的小鼠的基因组；其中所述小鼠 包含功能性小鼠 FcRy链基因.在具体的实施方案中，第二步骤的人FCyRIIB、FcyRIIC 和FcyRIIIB基因的a链插入在相对于第一步骤的人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的a 链的5'。
[0067] 在一个方面，提供了用于测定人治疗剂在非灵长类动物中的细胞杀伤的方法，包 括将细胞、非人胚胎或非人动物与包含人Fc的人治疗剂接触的步骤，其中所述细胞、胚胎 或动物包含功能性FcRy链并包含一个或多个人FcYRa链对一个或多个内源低亲和力 Fc Y R α链基因的替代，以及测定人治疗剂通过细胞、胚胎或动物的低亲和力人Fc γ R介导 细胞杀伤的能力。
[0068] 在一个实施方案中，非灵长类动物为小鼠。在具体的实施方案中，内源小鼠 Fc γ R α 链基因 Fc γ RIIB、Fc γ RIV 和 Fc γ RIII 被人 Fc γ R α 链基因 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、 Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA 和 Fc γ RIIIB 替代。
[0069] 在一个实施方案中，细胞选自B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性 粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞及其组合。在具体的实施方案中，细胞为NK 细胞并且测定通过人或人源化抗体产生的NK细胞介导的ADCC。在具体的实施方案中，低亲 和力人Fc γ R为人Fc γ RIIIA。
[0070] 在一个方面，提供了用于测定治疗剂依赖性血栓形成的方法，包括将在血小板上 表达人Fc γ RIIA的第一非人动物与治疗剂接触；将不在血小板上表达人Fc γ RIIA的第二 非人动物与所述治疗剂接触；在第一非人动物和第二非人动物中测量治疗剂依赖性血栓形 成的量；和测定治疗剂依赖性血栓形成的差异。
[0071] 在一个实施方案中，非人动物选自小鼠和大鼠。
[0072] 在一个实施方案中，将治疗剂依赖性血栓形成的测定的差异用于鉴定与向人施用 该治疗剂相关的风险。在一个实施方案中，测定的差异导致治疗剂给有此需要的人患者的 施用的改变。
[0073] 发明详述
[0074] 本发明不限于描述的特定方法和实验条件，因为这样方法和条件可改变。本文中 使用的术语仅为了描述特定的实施方案，无意起限制作用，因为本发明的范围将仅由权利 要求限定。
[0075] 除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域内 的技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方 法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出 版物通过引用方式全文并入本文。
[0076] 短语"靶向构建体"包括含有靶向区域的多核苷酸分子。靶向区域包含与靶细胞、 组织或动物中的序列实质上同源的序列并且提供了靶向构建体至细胞、组织或动物的基因 组内的位置的整合。在具体的实施方案中，靶向构建体还包括特定目标核酸序列或基因、 选择标记、控制和/或调节序列以及允许通过蛋白质的外源添加介导的重组的其它核酸序 列，所述蛋白质帮助或促进牵涉这类序列的重组。在另一个具体的实施方案中，靶向构建体 还包含目标基因，其中所述目标基因为编码与由内源序列编码的蛋白质具有相似功能的蛋 白质的异源基因。
[0077] 除非另外明确地指出，否则术语"替代"包括其中将DNA序列以这样的方式置于细 胞的基因组内：用异源序列（例如，小鼠中的人序列）在基因组序列的基因座上替代基因组 中的序列。这样放置的DNA序列可包括作为用于获得这样放置的序列的源DNA的一部分的 一个或多个调控序列（例如，启动子、增强子、5'_或3'-非翻译区等）。例如，在不同的实 施方案中，替代是异源序列对内源序列的置换，该置换导致基因产物从这样放置的DNA序 列（包括异源序列）产生，但不表达内源序列；替代是用DNA序列置换内源基因组序列，所 述DNA序列编码具有与内源基因组序列编码的蛋白质相似的功能的蛋白质（例如，内源基 因组序列编码低亲和力小鼠 Fc γ R受体，DNA片段编码一种或多种人低亲和力Fc γ R受体， 例如 Fc γ RIIC 和 / 或 Fc γ RIIIB)。
[0078] 术语"FcyR"包括Fc、例如IgG免疫球蛋白的Fc部分的受体。FcyR基因包括 α链，所述α链在细胞表面上表达并且用作配体结合结构域，并与FcRY链的同二聚体或 FcRY链与δ链的异二聚体结合。存在几种不同的FcyR基因并且可根据在免疫复合物 中与IgG的优先结合将它们分成低亲和力和高亲和力类型。人的低亲和力Fc γ R基因包括 Fc γ RIIA、Fc γ RIIB、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA和Fc γ RIIIB，并且已在患有自身免疫疾病的人 受试者中描述了在大多数此类基因内天然存在的遗传差异或多态性。在阅读本公开内容后 本领域技术人员将认识到基因组中的一个或多个内源低亲和力FcyR基因（或全部）可被 一个或多个异源低亲和力Fc γ R基因（例如，变体或多态性例如等位基因形式、来自另一物 种的基因、嵌合形式等）替代。
[0079] 术语"等位基因变体"包括基因的正常序列的变异，其导致同一基因的一系列不同 形式。所述不同形式可在来自基因的蛋白质序列中包含至多20个氨基酸的差异。例如，等 位基因可被理解为相同物理基因基因座上的可选择的DNA序列，其可以导致或可以不导致 不同的性状（例如，可遗传的表型特征）、例如对某些疾病或病况的易感性，其不导致相同 基因的其它等位基因或在不同程度上导致其它等位基因。
[0080] "辅助细胞"包括参与免疫应答的效应子功能的免疫细胞。示例性免疫细胞包括淋 巴样或骨髓样来源的细胞，例如淋巴细胞、天然杀伤（NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性 粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、血小板、郎格汉斯细胞、树突细胞、肥大细胞等。辅助 细胞通过在它们的表面上表达的受体例如FcR进行免疫系统的特定功能。在具体的实施方 案中，辅助细胞能够触发通过在细胞表面上表达的FcR例如低亲和力Fc γ R介导的ADCC。 例如，表达FcR的巨噬细胞参与吞噬作用和破坏抗体包被的细菌。辅助细胞还可能能够释 放介导其它免疫过程的试剂。例如，肥大细胞可被结合至FcR的抗体激活以在感染的部位 释放颗粒例如炎症分子（例如，细胞因子）。在不同的其它实施方案中，FcR在辅助细胞上 的表达可受其它因子（例如，细胞因子）调节。例如，FcyRI和FcyRIII表达可通过利用 干扰素 -Y (IFN- γ )的刺激诱导。
[0081] 小鼠和人FcR
[0082] 免疫球蛋白的Fc区（S卩，恒定区）的受体（FcR)在免疫应答的调节中起着重要作 用。FcR存在于宿主免疫系统的辅助细胞上以有效地除去被抗体结合的外源抗原。FcR也在 平衡免疫系统的辅助细胞的激活和抑制应答中起着重要作用。FcR参与巨噬细胞的吞噬作 用、肥大细胞的脱粒、抗体-抗原复合物的摄取和免疫应答的调节以及其它免疫系统过程。
[0083] 在小鼠和人中，不同的FcR在不同辅助细胞的表面上差异性表达，所述辅助细 胞各自对于存在于表达的抗体库中的免疫球蛋白同种型是特异性的。例如，免疫球蛋白 G(IgG)抗体通过IgG受体（Fc γ R)介导效应子功能。Fc γ R已被分成3类：高亲和力激活性 Fc γ RI (CD64)、低亲和力抑制性Fc γ RII (CD32)和低亲和力激活性Fc γ RIII (CD16)。虽然 每一类都存在于小鼠和人中，但它们所存在于的免疫细胞的同种型和亚组的数目不同。例 如，FcyRIIA和FcyRIIIB在人的辅助细胞上表达但据报道不存在于小鼠中。此外，不同 IgG同种型（例如，IgGl)对每一种FcyR的亲和力在人和小鼠中不同。
[0084] 通过Fc γ R的细胞信号转导的激活或抑制和与抗体对Fc γ R的结合相关的效应 子功能据认为由FcyR的细胞内结构域的特定序列基序或共受体（co-receptor)的亚基 的特定序列基序介导。激活受体最常见地与包含免疫受体基于酪氨酸活化基序（ITAM)的 常见Y链（FcRy链）相关。ITAM包含约9-12个氨基酸的特定序列，该序列包括响应 于抗体对FcR的结合而被磷酸化的酪氨酸残基。磷酸化导致信号转导级联。已报道了缺 失编码FcRy链的基因的小鼠（FcRy链K0)(例如，参见Takai等人（1994)FcRychain Depletion Results in Pleiotrophic Effector Cell Defects, Cell 76:519-529; van Vugt 等人（1996) FcR γ-chain Is Essential for Both Surface Expression and Function of Human FcyRI(CD64) In Vivo, Blood 87(9):3593-3599 ;和 Park 等人（1998) Resistance of Fc Receptor-deficient Mice to Fatal Glomerulonephritis, J. Clin. Invest. 102 (6) :1229-1238)。FcR γ链据报道为大多数FcR的正确表面表达和功能（例 如，信号转导、吞噬作用等）所必需的；根据一些报道FcRy链K0小鼠缺失FcyRI。然 而，其它报道显示FcR γ链K0小鼠确实在某些辅助细胞的表面上表达Fc γ RI，并且表达 的FcyRI据报道显示具有功能，功能在于其在表达的FcRy链不存在的情况下在小鼠中 结合 IgG (Barnes 等人（2002) FcyRI-Deficient Mice Show Multiple Alterations to Inflammatory and Immune Responses, Immunity 16:379-389)。
[0085] 相反地，Fc γ RIIB是在其细胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序 (Ι--Μ)的抑制性受体。与ITAM-样，ITIM是包含可磷酸化的酪氨酸残基的序列基序。然 而，在ITM的磷酸化后的下游事件导致免疫细胞功能的抑制而非激活。Fc γ RIIB缺陷型小 鼠据报道展示与野生型小鼠相比较增强的抗体应答（Takai等人（1996) Augmented humoral and anaphylactic responses in FcgRII-deficient mice, Nature 379:346-349),此为支 持Fc γ RIIB作为B细胞抗体应答的下游调节剂的观察。
[0086] 在人中，FcyRIIA、FcyRIIB、FcyRIIC、FcyRIIIA 和 FcyRIIIB 被认为是经典 低亲和力FcyR基因并且一起位于相同染色体上（Su等人（2002) Genomic organization of classical human low-affinity Fc y receptor genes, Genes and Immunity 3 (Supple 1) :S51-S56)。这些基因展示出几个与独特表型例如受体的配体结合和功能的改变相关的 多态性。一些多态性与自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮（SLE)、类风湿关节炎（RA)和多 发性硬化（MS)相关。针对不同的人FcYR(hFcYR)的转基因小鼠已被开发并且用作疾病模 型、产生高亲和力抗体、测试治疗性抗体引发特异性细胞应答的能力、筛选缓解异常免疫应 答的化合物（例如，参见 Heijnen 等人（1996)A Human FcgRI/CD64Transgenic Model for In Vivo Analysis of(Bispecific)Antibody Therapeutics, J. Hematother. 4:351-356 ； Heijnen 和 van de ffinkel(1996)Antigen Targeting to Myeloid-specific Human FcgRI/CD64 Triggers Enhanced antibody Responses in Transgenic,J. Clin. Invest. 97 (2) : 331-338 ;美国专利 No. 6, 111, 166、6, 676, 927、7, 351，875、7, 402, 728 和 7, 416, 726)。
[0087] 尽管FcR在提供免疫系统的抗体与辅助细胞之间的桥梁中起着重要作用，但目前 仍然不存在其中所有低亲和力hFc γ R都表达的模型系统。其中所有低亲和力hFc γ R共表 达的小鼠（包括缺失内源小鼠 FcyR的小鼠）在不同的实施方案中可用于精确地反映人 抗体治疗剂的效应，包括ADCC介导的效应。这样的小鼠可在用于治疗人疾病例如RA、I型 糖尿病、SLE和自身免疫性的治疗性抗体的工程改造、分析和评估中用作至关重的工具：提 供能够实现人的免疫过程的更精确评估（特别地在测试人抗体治疗剂的情景中）的动物模 型。小鼠还可以是具有低亲和力受体的细胞的有价值的来源，所述细胞可在体外测定中用 于评估结合低亲和力受体的治疗剂的治疗剂依赖性细胞杀伤，并因此而被用于鉴定有用的 人治疗剂。
[0088] 内源低亲和力Fc γ R基因缺陷型小鼠
[0089] 提供了不表达内源低亲和力小鼠 FcyR基因但表达内源小鼠 FcRY链的遗传修 饰的非人动物。在不同的实施方案中，FcRy链以与野生型小鼠中相同或大体上相同的分 布（即，在细胞类型中）和水平在小鼠中表达。内源低亲和力FcyR基因可在免疫细胞的 表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。用于产生不表达内源低亲和力小鼠 FcyR基因的非人动物的遗传修饰通过使用小鼠为例子来方便地说明。可以以多种方式，特 别是实施方案已在本文中进行了描述的方式产生根据本发明的遗传修饰的小鼠。
[0090] 图1中（顶部）提供了显示FCYR基因在内源基因座中的排列的低亲和力小鼠 Fc γ R基因基因座的示意图（未按比例的）。如图所示，低亲和力小鼠 Fc γ R基因 Fc γ RIIB、 Fc γ RIV和Fc γ RIII -起紧密地存在于一条染色体上。这些基因中的每一个基因包含负责 结合抗体分子的Fc部分的α链或配体结合结构域。
[0091] 缺失编码内源低亲和力FCYR基因的α链的核苷酸序列的遗传修饰的小鼠可通 过本领域已知的任何方法来产生。例如，可制备缺失低亲和力小鼠 FcYRa链基因的具有 选择标记基因的靶向载体。图1举例说明了被靶向构建体靶向的小鼠基因组（底部），所述 构建体具有包含内源低亲和力Fc γ Ra链基因座的上游序列的5'同源臂，后接药物选择盒 (例如，侧翼连接有loxP序列的新霉素抗性基因）和包含内源低亲和力FcYRa链基因座 的下游序列的3'同源臂。于基因座上同源重组后，内源低亲和力FcYRa链基因座被药物 选择盒替代（图1的底部）。内源低亲和力Fc γ R a链基因基因座因此被缺失，从而产生不 表达内源低亲和力小鼠 FcYRa链基因的细胞或非人动物。可作选地通过随后添加重组酶 (例如，通过Cre处理）除去药物选择盒。
[0092] 在不同实施方案中，遗传修饰小鼠以使内源低亲和力小鼠 FcYRa链基因失去功 能，产生展示免疫应答的缺陷的小鼠，从而使得小鼠对于评估内源低亲和力小鼠 FcyR基 因在正常和紊乱的免疫功能、IgG-介导的过程以及自身免疫疾病中的协同以及单独的作用 是有用的。在不同的实施方案中，修饰内源低亲和力小鼠 FcyR基因的a链但非FcRy链， 避免了需要FcRy链以进行表面表达和功能的其它内源FcR基因（例如，高亲和力FcyRI) 的潜在减少，从而维持通过Y链依赖性过程介导的各种其它免疫功能和过程。
[0093] 根据一些方面，FcRy链缺陷型小鼠缺失FcyRIII和FcyRI的表面表达。然而， 已报道在FcR γ链缺陷型小鼠的细胞表面上检测到Fc γ RI，所述Fc γ RI据报道具有至少部 分功能。相反地，根据本发明的小鼠包含未修饰的内源FcRy链，其保持天然细胞表面表达 模式和需要FcRy链的其它FcR基因的细胞功能。
[0094] 在不同的实施方案，本发明的小鼠显示了优于其它FcyR基因-缺陷小鼠的有利 方面，所述有利方面在于它们所具有的遗传修饰导致不完全贡献于低亲和力Fc γ R基因的 其它免疫功能所必需的其它基因的维持。例如，通过功能性FcRy链，其它γ链依赖性蛋 白（例如，FcyRI)将能够与FcRy链结合并且在免疫应答中参与效应细胞功能。在根据本 发明的各种遗传修饰的小鼠中，据认为维持此类功能（归因于功能性FcRy链的存在）同 时缺失内源低亲和力FcyR基因（一个或多个α-亚基）使得能够更精确地阐明FcR在自 身免疫中的作用。
[0095] 低产和力Fc γ R人源化小鼠
[0096] 提供了表达低亲和力人FcyR基因的遗传修饰的非人动物。低亲和力人FcyR基 因可在动物免疫系统的辅助细胞的表面上表达或在动物的周围组织中以可溶性方式表达。
[0097] 在不同的实施方案中，遗传修饰包含一个或多个低亲和力小鼠 Fc Y R基因的功能 性α链的缺失，并且在一些实施方案中包含含有以两个或更多个、三个或更多个、四个或 更多个或五个低亲和力人Fc Y R α亚基基因的替代的其它修饰，其中非人动物表达功能性 小鼠 FcRY链基因。还提供了遗传修饰的非人胚胎、细胞和用于产生非人动物、非人胚胎和 细胞的靶向构建体。
[0098] 提供了用于制备表达人FcyR基因（包括特定多态性形式或等位基因变体（例 如，单个氨基酸的差异））的小鼠的组合物和方法，包括用于制备从人启动子和人调控序 列表达此类基因的的小鼠的组合物和方法。所述方法包括选择性地使内源低亲和力小鼠 FcyR基因失去功能（例如，通过其α链的缺失）以及在内源低亲和力小鼠 FcyR基因的 基因座上利用低亲和力人FcyR基因的α链在小鼠中表达低亲和力人FcYRa-亚基基 因。通过缺失一个或多个a链基因但非FcRy链基因来产生低亲和力小鼠 FcyR基因的 缺失。所述方法选择性地使一个或多个内源低亲和力FcYRa链基因失去功能而同时保留 功能性内源FcRy链。
[0099] 在不同的实施方案中，内源FcyRa链替代方法对动物中的天然FcyR介导的信 号转导产生的破坏相对最小，因为FcYRa链的基因组序列在单个片段中被替代，从而通 过包含必需调控序列保留正常功能性。因此在这样的实施方案中，FcYRa链修饰不影响 其它依赖于功能性FcRy链分子的内源FcR。此外，在不同实施方案中，修饰不影响包括 FcYRa链和内源FcRy链的功能性受体复合物的装配，所述复合物据认为是一些FcYRa 链在细胞表面上的正确表达以及由激活的受体产生的下游信号转导所需要的。因为FcRy 链未缺失，在不同实施方案中，包含人FcYRa链基因对内源FcYRa链基因的替代的动物 应当能够通过IgG免疫球蛋白的Fc部分对存在于辅助细胞表面上的人Fc YRa链的结合 来处理来自抗体的正常效应子功能。
[0100] 在图4中（上部）提供了缺失的内源低亲和力小鼠 FcyR基因的示意图（未按 比例的）。如图所示，通过用包含人低亲和力人FcyRIIA和FcyRIIIA基因的基因组片 段以靶向构建体（人Fc γ RIIIA-IIA靶向载体）将人低亲和力人Fc γ R基因 Fc γ RIIA和 Fc γ RIIIA插入缺失的内源低亲和力小鼠 Fc γ R基因的基因座。这些基因的每一个基因包 含负责结合抗体分子的Fc部分的人FcyR基因的a链或配体结合结构域。
[0101] 在内源低亲和力小鼠 FCYR基因座上表达低亲和力人FCYR基因的遗传修饰的小 鼠可通过本领域内已知的任何方法来制图。例如，可制备引入低亲和力人FcyR基因（例 如，FcyRIIA和FcyRIIIA)和选择标记基因的靶向载体。图4(顶部）举例说明了包含内 源低亲和力FcyR基因座的缺失的小鼠基因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲 和力小鼠 FcyR基因座的上游序列的5'同源臂、后接药物选择盒（例如，两侧连接有ΙοχΡ 序列的潮霉素抗性基因）、包含人Fc γ RIIA基因、人HSP76基因和人Fc γ RIIIA基因的基因 组片段以及包含内源低亲和力小鼠 FcyR基因座的下游序列的3'同源臂。于缺失的基因 座上同源重组后，药物选择盒被包含在靶向载体中的序列替代（图4的底部）。内源低亲和 力Fc γ R基因基因座因此被低亲和力人Fc γ R基因替代，产生表达低亲和力人Fc γ R基因 的细胞或动物。可任选地通过随后添加重组酶（例如，通过Cre处理）除去药物选择盒。
[0102] 为了在血小板上表达hFc γ RIIA，靶向构建体人hFc γ RIIA-IIA靶向载体包含延 长的序列，该序列包括例如与人基因组中的hFc γ RIIA基因可操作地连接的全部或大体上 全部人启动子区域。为了阻止hFc γ RIIA在血小板上表达，靶向构建体缺失可操作地连接 于人的hFc γ RIIA基因的全部或大体上全部启动子区域。
[0103] 可使用对于利用两个人Fc γ R基因的替代所描述的相似技术实现对嵌合基因座 的其它修饰（图4的底部）。用两个人Fc γ R基因替代内源低亲和力Fc γ R基因基因座的 修饰还可提供用于整合其它低亲和力人FcyR基因的起始点。例如，图6(顶部）中提供 了用两个人低亲和力Fc γ R基因替代的内源低亲和力Fc γ R基因座的示意图（未按比例 的）。如图所示，通过另一个具有包含低亲和力人Fc γ RIIB、Fc γ RIIC和Fc γ RIIIB基因 的基因组片段的靶向构建体（人FcyRIIB-IIIB-IIC靶向载体）将低亲和力人FcyR基因 Fc γ RIIB、Fc γ RIIC和Fc γ RIIIB插入修饰的内源低亲和力小鼠 Fc γ R基因的基因座。这 些基因的每一个基因包含负责结合抗体分子的Fc部分的人FcyR基因的α链或配体结合 结构域。
[0104] 在内源低亲和力小鼠 Fc γ R基因座上表达5个低亲和力人Fc γ R基因的遗传修饰 的小鼠可通过本领域已知的任何方法来产生。例如，可制备引入低亲和力人Fc γ R基因（例 如，FcyRIIB、FcyRIIC和Fc YRIIIB)的具有选择标记基因的靶向载体。图6(顶部）举 例说明了包含以2个低亲和力人Fc γ R基因对内源低亲和力Fc γ R基因座的替代的小鼠基 因组。如图所示，靶向构建体包含含有内源低亲和力小鼠 Fc Y R基因座的上游序列的5'同 源臂、后接药物选择盒（例如，两侧连接有ΙοχΡ序列的新霉素抗性基因）、包含人Fc γ RIIB 基因、人FcyRIIIB、人HSP77基因、人FcyRIIC基因的基因组片段，后跟含有存在于内源基 因座上的低亲和力人FcyRIIIA基因的下游序列的3'同源臂。于修饰的基因座上同源重 组后，人Fc γ RIIB、Fc γ RIIIB和Fc γ RIIC基因通过靶向载体中包含的序列被插入先前存 在于内源低亲和力Fc γ R基因基因座上的人Fc γ RIIIA和Fc γ RIIA基因的5'（图6的底 部）。因此对修饰的内源低亲和力Fc YR基因基因座进一步修饰以整合3个额外的低亲和 力人Fc γ R基因，从而产生表达5个低亲和力人Fc γ R基因的细胞或动物。药物选择盒可 任选通过随后添加重组酶（例如，通过Cre处理）来除去。图6(底部分）显示所得的基因 座的结构，其将表达可在动物的免疫系统的辅助细胞的表面上检测到的并且适当时与内源 FcR γ链独立结合的5个低亲和力人Fc γ R基因。
[0105] Fc γ R缺陷型小鼠和Fc γ R人源化小鼠的实验模型
[0106] 不表达内源低亲和力小鼠 FcyR基因的遗传修饰的非人动物是有用的，其用于例 如阐明单个低亲和力FcyR基因在免疫应答中的各种功能、通过细胞介导的免疫（例如， ADCC)测量人治疗性抗体的功效、测定Fc γ R在免疫疾病或障碍中的作用、用作免疫疾病或 障碍的模型、产生抗一种或多种FcyR蛋白的抗体、以及用作产生其它目标遗传修饰的小 鼠的交配配偶。
[0107] 在一个实施方案中，根据本发明的小鼠可用于通过给不表达低亲和力Fc γ R基因 的小鼠施用试剂来测定这样的小鼠的细胞毒性效应的丧失（与野生型小鼠相比较），其中 已知所述试剂在野生型小鼠中触发Fc γ R-依赖性细胞毒性效应。在一个实施方案中，将 肿瘤细胞植入本发明的小鼠，在随后的一段时间后，用特异于在肿瘤细胞表面上表达的抗 原的抗体注射小鼠。抗体的同种型在注射前是已知的并且通过与在野生型动物中观察到的 ADCC相比较来分析动物的Fc γ R-依赖性ADCC的减弱。
[0108] 在另一个方面，可将内源低亲和力受体缺陷型小鼠与其它免疫缺陷型小鼠组合 (例如，通过交配）以产生自身免疫疾病的体内模型。例如，重症联合免疫缺陷（SCID)小鼠 在本领域常规地用作用于研究免疫系统的模型生物。SCID小鼠具有受损的产生T或B淋巴 细胞或激活补体系统的一些组分的能力，并且不能高效地抵抗感染、排斥肿瘤和排斥移植 物。可将本发明的低亲和力Fc γ Ra -亚基基因缺陷型小鼠培育成SCID小鼠以确定宿主动 物响应于抗体治疗剂（例如，抗肿瘤抗体）的施用的细胞耗尽，这可测定ADCC和补体依赖 的细胞毒性（CDC)在体内肿瘤细胞耗尽中的作用。
[0109] 在另一个方面，提供了包含低亲和力人Fc γ R基因对内源低亲和力Fc γ R基因的 替代的遗传修饰的非人动物。此类动物对于研究完全人抗体和hFc γ R介导的ADCC的药代 动力学是有用的。此外，已显示人FcyR基因展示与疾病（例如，SLE，RA，Wegener' s肉芽 肿病、Guillain-Barr6综合征和多发性硬化）相关的多态性或等位基因变体。因此，包含 人Fc γ R基因的特定等位基因或多态性形式对内源低亲和力Fc γ R基因的替代的遗传修饰 的非人动物可用于在动物中研究人自身免疫疾病和与多态性相关的性状。在具体的实施方 案中，人FcyR基因的等位基因形式与对于人IgG的增强的功效相关。
[0110] 在另一个具体的实施方案中，测定人低亲和力FcyR多态性对人抗体治疗剂的功 效的影响。在具体的实施方案中，给包含人FcyR的第一多态性的第一人源化小鼠施用抗 肿瘤抗体，也给包含人FcyR的第二多态性的第二人源化小鼠施用抗肿瘤抗体，其中第一 和第二小鼠各自包含人肿瘤细胞；并且在第一小鼠和第二小鼠中评估抗肿瘤抗体的抗肿瘤 活性。在具体的实施方案中，由医生基于抗肿瘤抗体在第一小鼠和第二小鼠中的功效的评 估选择关于治疗具有第一或第二多态性和具有相应于人肿瘤细胞的肿瘤的人的治疗选择。
[0111] 人FCYR基因的适当多态性包括本领域已知的全部多态性。对于人FCYRIIA基 因，多态性包括例如通过T细胞响应于IgG增殖的能力报道的高应答者表型和低应答者表 型。高应答者多态性的特征在于位点131上的精氨酸残基（131Arg)，而低应答者的特征在 于位点131上的组氨酸残基（131His)。在具体的实施方案中，人Fc γ RIIA序列包含131His 多态性。人FcYRIIAa链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID N0:32中。
[0112] 人FcyRIIB基因的单核苷酸置换在配体结合结构域（a链）中导致错义置换 并且推定其影响IgG的Fc部分结合细胞表面上的FcyRIIB的a链的结合能力。例如， 已显示小鼠的FcyRIIB基因的跨膜结构域内的位点232上的苏氨酸对异亮氨酸的置换 (Ile232Thr)削弱了受体的信号转导能力。在具体的实施方案中，人FcyRIIB基因包含异 亮氨酸变体（232Ile)。人FcγRIIBa链的代表性蛋白质序列示于SEQIDN0 :33中。
[0113] 有人提出人FcyRIIIA基因的等位基因变体牵涉SLE和RA的易感性。该等位 基因变体包括位点158上苯丙氨酸对缬氨酸的置换（Vall58Phe)。缬氨酸等位基因变体 (158Val)经表征具有比苯丙氨酸等位基因变体（158Phe)更高的对IgGl和IgG3的亲和力。 已有人提出158Phe等位基因变体导致减少的免疫复合物的清除。在具体的实施方案中，人 FcyRIIIA基因包含158Val等位基因变体。人FcyRIIIAa链的代表性蛋白质序列示于 SEQ ID N0:35 中。
[0114] 人FcyRIIIB基因的等位基因变体包括嗜中性粒细胞抗原1(NA1)和嗜中性粒细 胞抗原2(NA2)等位基因。已有人提出这些等位基因变体牵涉输血反应、同种免疫嗜中性白 血球减少症（alloimmune neutropaenia)、SLE和Wegener's肉芽肿病。NA2等位基因变体 的特征在于减小的介导吞噬作用的能力。在具体的实施方案中，人FcyRIIIB基因包含NA2 等位基因变体。人FcYRIIIBa链的代表性蛋白质序列示于SEQ ID N0:36中。
[0115] 在一个方面，遗传修饰的非人动物对于最优化通过治疗性抗体的Fc部分触发的 FcyR介导的功能是有用的。可利用本领域已知的任何方法修饰抗体的Fc区域。例如，可 修饰Fc部分（例如，CH2和CH3结构域）中的氨基酸残基以选择性增强对人Fc γ RIIIA的 结合亲和力。因此，所得的抗体应当具有增强的Fc γ RIIIA依赖性ADCC。在具体的实施方 案中，将表达本发明的人Fc γ RIIIA的动物用于评估修饰的人抗体的增强的ADCC能力（通 过给动物施用修饰的人抗体，检测（例如，体外）抗体对表达Fc γ RIIIA的细胞的结合和将 观察到的ADCC活性与从野生型动物的测定观察到的ADCC活性相比较）。 实施例
[0116] 实施例1:低亲和力FcyR基因缺失型小鼠的产生
[0117] 构建用于引入内源低亲和力小鼠 FcyR基因座的缺失的靶向构建体（下文中描述 的）（图1)。
[0118] 使用VELOCIGENE⑩技术（参见，例如，美国专利No. 6, 586, 251和 Valenzuela 等人（2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6) :652-659)制备革巴向 构建体以修饰细菌人工染色体（BAC)RP23-395f6(Invitrogen)。修饰RP23-395f6BAC DNA 以缺失内源低亲和力Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因（包括每一个Fc γ R的α链）。
[0119] 简而言之，分别利用引物 mFcR5-up-l(5' -ACCAGGATAT GACCTGTAGA G ; SEQ ID N0:1)和 mFcR3-up-la(GTCCATGGGT AAGTAGAAAC A;SEQ ID N0:2)以及 mFcR5-DN(ATGCGAGCTC ATGCATCTATG TCGGGTGCGG AGAAAGAGGT AATGCATTCT TGCCCAATAC TTAC;SEQIDN0:3)和mFcR3-DN(ACTCATGGAGCCTCAACAGGA ;SEQIDN0:4)产生上游和下 游同源臂。这些同源臂被用于产生缺失内源低亲和力Fc γ RIIB、Fc γ RIV和Fc γ RIII基因 的α链的盒。靶向构建体包括l〇x化的新霉素抗性基因，其包含相对于内源基因座的5' 和3'区域同源的序列的同源臂。内源FcyRIIB基因的上游和内源FcyRIII基因的下游 的基因和/或序列（参见图1)不被该靶向构建体修饰。
[0120] 使用在缺失区域外部和在靶向构建体内部的引物，通过聚合酶链式反应（PCR)来 确认靶向缺失。使用针对mFcR-up-detect(ATCCTGAGTATACTATGACAAGA ;SEQIDN0:5)和 PGK-up-detect(ACTAGTGAGA CGTGCTACTT C;SEQ ID N0:6)的引物通过 PCR 来确认缺失的 基因座的上游区域；使用引物pA-DN-detect(CTCCCACTCATGATCTATAGA ;SEQIDN0:7)和 mFcR-DN-detect(TGGAGCCTCA ACAGGACTCC A;SEQ ID N0:8)来确认缺失的基因座的下游区 域。横跨上游缺失点的核苷酸序列包括下列序列，所述序列表示与存在于缺失点上的盒序 列连续连接的Fc γ RIIB基因的下游内源小鼠序列（包括在下面的括号内）：(GTCCATGGGT AAGTAGAAACA)TTCGCTACC TTAGGACCGT TA(SEQ ID N0:9)。横跨下游缺失点的核苷酸序列包 括下列序列，其表示与FcyRIII基因上游的内源小鼠序列（包括在下面的括号内）连续的 盒序列：CGGGTGCGGA GAAAGAGGTA AT(GCATTCTT GCCCAATACT TA) (SEQ ID N0:10)。
[0121] 通过将靶向BAC DNA(上文中描述的）电穿孔入小鼠 ES细胞来产生FcyRIIB、 Fc γ RIII和Fc γ RIV缺陷小鼠。通过Taqman?筛选和核型分析确认阳性ES细胞克隆。随 后将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生一窝低亲和力Fc γ R基因缺陷幼鼠。
[0122] 实施例2:低亲和力Fc γ R基因缺陷型小鼠的表征
[0123] 从FcyR缺陷型小鼠和野生型小鼠收获脾，在无菌一次性袋中用10mL的胶原酶-D 灌注。随后将每一只包含单个脾的袋子置于Stomacher? (Seward)中，在培养基环境中 匀浆30分钟。将匀浆的脾转移至10cm培养皿，在37°C温育25分钟。使用1:50稀释度的 0. 5MEDTA，利用移液器分离细胞，随后在37°C再温育另外5分钟。随后通过离心（lOOOrpm 进行10分钟）沉淀细胞，将红细胞在4mL ACK缓冲液（Invitrogen)中裂解3分钟。用 RPMI-1640(Sigma)稀释脾细胞，再次离心。将沉淀的细胞重悬浮于10mL RPMI-1640中，利 用0. 2 μ m细胞滤过器进行过渡。
[0124] 流式细胞术。利用下列缀合有荧光团的细胞表面标记物：抗_CD19(B细胞）、 抗-CD3 (T细胞）、抗-NKp46 (NK细胞）和抗-F4/80 (巨噬细胞）在BD LSR II系统（BD Bioscience)上通过FACS鉴定淋巴细胞群体。针对特定细胞谱系门控淋巴细胞，利用大鼠 抗-小鼠 Fc γ RIII/II 抗体（克隆 2. 4G2, BD Biosciences)分析内源Fc γ RIII 和 Fc γ RIIB 的表达。克隆2.4G2识别鼠 FcyRIII和FcyRII的细胞外结构域上的共同多态性表位。 结果显示在mFcYR K0小鼠的B-细胞、NK细胞和巨噬细胞上不存在可检测的鼠低亲和力 FcyRIII 或 FcyRII (图 2)。
[0125] ADCC测定。从FcyR基因缺陷型小鼠和野生型小鼠分离脾细胞，在细胞杀伤测定 中分析它们进行ADCC的能力。使用MACS?技术（Miltenyi Biotec)分离和分开细胞 群体。简而言之，使用磁性标记的抗-小鼠 CD3珠粒从脾细胞耗尽T细胞。随后使用磁性 标记的抗-小鼠 CD49B珠粒就NK细胞富集T细胞耗尽的脾细胞。单独地，用不同浓度（范 围从〇· 1至10 μ g/mL)的小鼠抗-人⑶20抗体（克隆B1 ;Beckman Coulter)在4°C包被 Raji细胞（表达人CD20)30分钟。以100:1和50:1的比率（NK:Raji)将抗体包被的Raji 细胞与富集的NK细胞在37°C温育4小时。使用CytoTox-Glo?细胞毒性测定法（Promega) 测量细胞死亡。发光信号来源于裂解的细胞并且与死亡细胞的数目成正比。就每一个比率 的本底死亡细胞计数测定来自对照（无抗-CD20抗体）的发光，从野生型和K0小鼠的测 量扣除该发光。计算平均细胞死亡，通过与野生型相比较测定细胞杀伤的百分比减少 ADCC)。结果不于表1中。
[0126] 表 1
[0127]
【权利要求】
1. 一种制备包含遗传修饰的小鼠的方法，包括工程化小鼠以包含内源FcYRIIBa链 基因中的纯合破坏、内源FcYRIVa链基因中的纯合破坏、内源FcYRIIIa链基因中的纯 合破坏。
2. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包括与野生型小鼠对于相同抗原的能力相比较 减小的对抗原产生免疫应答的能力。
3. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包括至少50%减小的抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性（ADCC)。
4. 如权利要求1所述的方法，其中小鼠包含功能性的FcRy链。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中小鼠表达人⑶20。
6. -种遗传修饰的小鼠细胞，其基因组包含内源FcyRIIB a链基因中的纯合破坏，内 源FcYRIVa链基因中的纯合破坏，内源FcYRIIIa链基因中的纯合破坏。
7. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞包含功能性的FcRy链。
8. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞是胚胎干（ES)细胞。
9. 如权利要求6所述的细胞，其中细胞是天然杀伤（NK)细胞。
10. 如权利要求6至9中任一项所述的细胞，其中细胞包含人⑶20基因。
11. 一种鼠细胞，其基因组包含以至少两个低亲和力人FcYRa链基因替代内源低亲 和力FcYRa链基因，其中细胞包含功能性内源FcRy链并且功能性地表达至少两个低亲 和力人FcyRa链基因。
12. 如权利11所述的鼠细胞，其中细胞是淋巴细胞。
13. 如权利要求12所述的鼠淋巴细胞，其中淋巴细胞是B细胞。
14. 如权利要求12所述的鼠淋巴细胞，其中淋巴细胞是天然杀伤细胞。
15. 如权利要求11所述的鼠细胞，其中细胞是鼠胚胎干细胞。
16. 如权利要求11至15中任一项所述的鼠细胞，其中至少两个低亲和力人FcYRa 链基因选自下组：人FcyRIIAa链基因、人FcyRIIBa链基因、人FcyRIICa链基因、人 FcyRIIIAa链基因和人FcyRIIIBa链基因。
17. 如权利要求11至15中任一项所述的鼠细胞，其中至少两个低亲和力人Fc γ R基因 是人FcyRIIAa链基因和人FcyRIIIAa链基因。
18. 如权利要求17所述的鼠细胞，其中人FcYRIIIAa链基因包括在氨基酸位点158 上的苯丙氨酸。
19. 如权利要求17所述的鼠细胞，其中人FcYRIIIAa链基因包括在氨基酸位点158 上的缬氨酸。
20. 如权利要求11至15中任一项所述的鼠细胞，其中，鼠细胞的基因组包含人 FcyRIIBa链基因、人FcyRIICa链基因和人FcyRIIIBa链基因。
21. 如权利要求13所述的B细胞，进一步包含编码人⑶20蛋白的人核苷酸序列。
22. -种鼠胚胎，包括权利要求15所述的胚胎干细胞。
23. -种鼠天然杀伤细胞，其基因组包括替代内源FCyRIIB、FcyRIII和FcYRIVa链 基因的人FcYRIIIAa链基因，其中细胞功能性地表达人FcYRIIIAa链基因和在其表面 上的鼠 FcRy链。
24. -种制备遗传修饰的鼠科动物的方法，其基因组包含以至少两个低亲和力人 FcYRa链基因替代内源低亲和力FcYRa链基因，包括使用权利要求15所述的鼠胚胎干 细胞。
25. -种制备遗传修饰的鼠胚胎干细胞的方法，其基因组包含以至少两个低亲和力 人FcYRa链基因替代内源低亲和力FcYRa链基因，该方法包括以至少两个低亲和力人 FcYRa链基因替代鼠胚胎干细胞基因组中的内源低亲和力FcYRa链基因。
26. 如权利要求22所述的方法，其中内源低亲和力FcYRa链基因被人FcYRIIAa链 基因和人FcyRIIIAa链基因替代。
27. 如权利要求22所述的方法，其中内源低亲和力FcYRa链基因被人FcYRIIBa链 基因、人FcyRIICa链基因和人FcyRIIIBa链基因替代。
28. 如权利要求22所述的方法，其中内源低亲和力FcYRa链基因被人FcYRIIAa 链基因、人FcyRIIBa链基因、人FcyRIICa链基因、人FcyRIIIAa链基因和人 FcyRIIIBa链基因替代。
【文档编号】C12N5/10GK104232589SQ201410471291
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2010年12月17日 优先权日:2009年12月21日
【发明者】L·麦克唐纳, 涂纳新, C·古尔, S·史蒂文斯, A·J·墨菲 申请人:瑞泽恩制药公司