具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用遗传工程的方法在细胞内获得高效表达miRNAs的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物制备中的用途。用定向克隆、同源重组、转染、慢病毒包装等技术，获得重组慢病毒和真核表达质粒，即在同源重组位点插入miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p前体片段，所获得重组慢病毒和真核表达载体能在胶质瘤等肿瘤细胞内复制增殖；插入的片段在肿瘤细胞内高效表达成熟的miRNAs，升高肿瘤细胞内以上3个分子的表达水平。该慢病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物中具有独特的实用价值。
【专利说明】具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于与肿瘤相关的miRNA【技术领域】，涉及具有抑制神经胶质瘤作用的 miRNA及其构建的载体和应用。
【背景技术】
[0002] miRNAs是一类广泛存在于病毒、植物及动物细胞中长度约为22nt的序列高度保 守的非编码单链RNA，其表达具有组织及时相特异性，在调控生物生长发育、细胞分化、增 殖、凋亡、压力应激及免疫等多种生命活动中发挥重要功能。miRNAs与靶基因 mRNA3' UTR 或5' UTR互补对其进行转录后调控，主要通过诱导mRNA降解或者抑制基因翻译机制实现。
[0003] 近年来，miRNAs在各类疾病中的研究成为热点，尤其是miRNAs在肿瘤形成中的作 用越来越引起关注。目前报道显示多种肿瘤中都存在着miRNAs的异常表达，如胰腺癌、结 肠癌、乳腺癌、肺癌、白血病、膀胱癌、胶质瘤等，其在肿瘤形成中扮演着类似抑癌基因及癌 基因的双重角色，具有重要的肿瘤生物学意义。肿瘤中表达水平升高的miRNAs能负性调控 肿瘤抑制基因及与细胞分化有关基因从而促进肿瘤形成，这类miRNAs作用类似癌基因；同 样，表达水平降低的miRNAs能负性调控具有促肿瘤形成活性的各种蛋白，进而抑制肿瘤形 成发展，这类miRNAs作用类似抑癌基因。
[0004] 多项研究发现：50%以上的miRNAs位于染色体不稳定区，这些区域异常表达的 miRNAs调控癌基因及抑癌基因的表达，参与肿瘤的发生及形成；使用生物信息学方法分析 人类基因组中大约有一千余个miRNAs，其对人类基因组中近30 %的基因进行调控；并且目 前进行功能鉴定的肿瘤相关miRNAs只有数十个，已知的调控胶质瘤形成的miRNAs数目更 少。可见，miRNAs是人类基因组中一大类重要的调控基因，miRNAs之间及miRNAs与其靶基 因之间存在着复杂的调控网络，我们对其了解仍然很少。因此，对该领域深入探索或许可获 得肿瘤形成机制研究及治疗的突破。
[0005] 2005年，在胶质母细胞瘤与垂体腺瘤中首次报道了 miRNAs的异常表达，其后胶质 瘤中miRNAs的功能引起广泛关注。随着这类小分子在胶质瘤中功能的揭示，人们对胶质瘤 形成机制有了进一步了解并寄希望于将其开发作为治疗胶质瘤新的靶点。miR21是目前在 胶质瘤中研究最为深入的小分子，其参与调控肿瘤细胞凋亡、侵袭、增殖及耐药，这些作用 都是通过调控其下游靶分子TGFBR2/3、RECK、H)CD、LRRF1P1而实现，这表明miRNAs作用类 似于上游的一个多功能调节开关控制着下游一系列的基因通路，微调其状态将对细胞造成 复杂的影响。与此印证，在胶质瘤中随后发现细胞周期、血管形成、肿瘤扩散、干细胞更新这 些重要的肿瘤形成过程也受到miRNAs的调控。不仅如此，部分miRNAs分子在胶质瘤组织 中具有特异性表达，而且与肿瘤的恶性程度相关，提示这些小分子可以作为胶质瘤诊断及 预后的分子标志。可见，miRNAs在胶质瘤形成中发挥着重大作用。
【发明内容】
[0006] 本发明解决的问题在于提供具有抑制神经胶质瘤作用的miRNA及其构建的载体 和应用，该miRNA是神经胶质瘤的抑癌基因，可应用于神经胶质瘤的诊断和治疗。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0008] 一种神经胶质瘤的抑癌基因，为以下三种miRNA :miR-483-5p、miR-219-5p、 miR-338-3p中的一种或几种，其核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO. 1?SEQ. ID. NO. 3所示。
[0009] 所述表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，至少包含表达miRNA miR-483-5p、 miR-219_5p、miR-338_3p中的一种miRNA成熟体的前体序列。
[0010] 所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，所述的前体序列的核苷酸序列分别如 SEQ. ID. N0. 4 ?SEQ. ID. N0. 6 所示。
[0011] 所述的miRNA miR-483_5p、miR-219_5p、miR-338_3p的前体序列的核苷酸序列分 别如 SEQ. ID. NO. 7 ?SEQ. ID. NO. 9 所示。
[0012] 所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，是将前体序列分别克隆于真核穿梭质 粒载体PENTR3C中，获得pENTR3C-miR载体；
[0013] 再将pENTR3C-miR载体与pLenti6. 3/V5-DEST经LR同源重组，将前体序列克隆到 pLenti6. 3/V5-DEST 中，获得 pLenti6. 3/V5-DEST-miR 载体。
[0014] 基于所述pLenti6. 3/V5-DEST-miR载体的重组慢病毒，是将pLenti6. 3/ V5-DEST-miR载体与衣壳载体和包装载体共转染HEK293T细胞，收集培养上清，过滤后得到 的重组慢病毒。
[0015] 所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
[0016] 所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0017] 所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。
[0018] 所述的重组慢病毒在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0020] 本发明提供神经胶质瘤的抑癌基因为11^1?-483-5?、1^1?-219-5?、1^1?-338-3?，其中 miR-483-5p、miR-219-5p的表达可以使肿瘤细胞增殖减慢，而且能够抑制体内肿瘤体积、重 量的生长，可应用于制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是制备抗神经胶质瘤药物、诊断试剂中 的应用。
[0021] 本发明提供神经胶质瘤的抑癌基因的真核表达载体，并基于该载体构建了慢 病毒，通过在真核表达载体pLenti6. 3/V5-DEST同源重组位点分别插入miR-483-5p、 miR-219-5p、miR-338-3p这3个分子的前体序列片段，所获得的重组慢病毒和真核表达载 体能在胶质瘤等肿瘤细胞内复制增殖；插入的片段在肿瘤细胞内高效表达成熟的miRNAs， 升高肿瘤细胞内以上3个分子的表达水平。该慢病毒和真核表达质粒在肿瘤治疗药物中具 有独特的实用价值。
[0022] 本发明与化学合成的miRNAs模拟剂相比，以慢病毒和真核表达载体表达成熟 miRNAs具有高效的基因表达及模拟体内生物合成过程，能够产生明显的基因治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图 1-1 ?1-3 为 Real-time PCR 显示 miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p 在不 同病理级别胶质瘤（II级：T1-T3 ;III级：T4-T6 ;IV级：T7-T9)及胶质瘤细胞系（U87、U251、 SHG44)中表达水平显著低于正常脑组织（N1、N2、N3)。
[0024] 图2为miR真核表达载体及慢病毒穿梭载体构建图谱。
[0025] 图3为Xba I酶切鉴定分析目的基因片段DNA序列成功连接入慢病毒表达载体 pLenti6. 3/V5-DEST。
[0026] 图4为表达miR-483_5p慢病毒及阴性对照慢病毒分别感染或不感染（blank)胶 质瘤细胞U251、U87,用blasticidin筛选12天后在倒置荧光显微镜荧光视野及暗视野下 拍摄的细胞图片，细胞放大倍数为200倍。
[0027] 图5-1?5-3为Real-time PCR显示重组慢病毒感染胶质瘤细胞U87可以明显升 高细胞中 miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p 的表达。
[0028] 图6-1?6-3为Real-time PCR显示重组慢病毒感染胶质瘤细胞U251可以明显 升高细胞中 miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p 的表达。
[0029] 图7-1?7-2为表达miR-483-5p、miR-219-5p可以使肿瘤细胞U87、U251增殖减 慢。
[0030] 图8为表达miR-483-5p可以使肿瘤细胞U87在48h内增殖增快。
[0031] 图9为表达miR-483-5p可以明显抑制裸鼠移植瘤体积的生长。
[0032] 图10为表达miR-483-5p可以明显抑制裸鼠移植瘤重量的生长。
[0033] 图11为表达miR-483_5p的U87细胞及对照细胞在裸鼠体内形成肿瘤进行HE染 色和PCNA免疫组化染色。
【具体实施方式】
[0034] 本发明提供的miRNA是通过在胶质母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中miRNA表达差异 谱中筛选出的，包括差异表达最为显著的miR-483-5p、miR-219-5p和miR-338-3p ;并对筛 选的miRNA通过构建表达载体进行转染，验证了其抑癌作用。下面结合具体的实施例对本 发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0035] 1、差异表达miRNA的筛选
[0036] 首先采用miRNA基因表达谱芯片检测了 3例胶质母细胞瘤和瘤旁正常脑组织中 miRNAs表达谱的差异。具体方法如下：
[0037] 分别提取组织样品中的RNA (符合0D260/280要求），然后每个样本取1 μ g总RNA 作为模板制备Hy3或Hy5标记的miRNA祀物，再与芯片杂交（具体采用丹麦Exiqon公司生 产的miRNAs基因表达谱芯片，编号：208101 - A)，使用Agilent G2505B型扫描仪对杂交 图谱进行扫描，将获得的荧光信号数据再使用SAM 3. 0软件进行差异显著性分析，将fold change>2、Ρ〈0· 05表达差异miRNA作为显著改变的miRNA。
[0038] 结果上述筛选中共发现91个较之周围正常脑组织差异表达miRNAs，且多为表达 上调（58个），表达下调的miRNAs为33个，表达较为显著的一部分miRNAs如表1所示。
[0039] 表1.胶质母细胞瘤与正常脑组织差异表达miRNAs
[0040]
【权利要求】
1. 一种神经胶质瘤的抑癌基因，其特征在于，为以下三种miRNA :miR-483-5p、 miR-219-5p、miR-338-3p中的一种或几种，其核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO. 1?SEQ. ID. NO. 3 所示。
2. 表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，至少包含表达miRNA miR-483-5p、 miR-219_5p、miR-338_3p中的一种miRNA成熟体的前体序列。
3. 如权利要求2所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，所述的miRNA miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO. 4? SEQ. ID. NO. 6 所示。
4. 如权利要求2所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，所述的miRNA miR-483-5p、miR-219-5p、miR-338-3p的前体序列的核苷酸序列分别如SEQ. ID. NO. 7? SEQ. ID. NO. 9 所示。
5. 如权利要求4所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体，其特征在于，是将前体序 列分别克隆于真核穿梭质粒载体PENTR3C中，获得pENTR3C-miR载体； 再将pENTR3C-miR载体与pLenti6. 3/V5-DEST经LR同源重组，将前体序列克隆到 pLenti6. 3/V5-DEST 中，获得 pLenti6. 3/V5-DEST-miR 载体。
6. 基于权利要求5所述pLenti6. 3/V5-DEST-miR载体的重组慢病毒，其特征在于，是将 pLenti6. 3/V5-DEST-miR载体与衣壳载体和包装载体共转染HEK293T细胞，收集培养上清， 过滤后得到的重组慢病毒。
7. 权利要求1所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
8. 权利要求1所述的神经胶质瘤的抑癌基因在制备抗肿瘤药物中的应用。
9. 权利要求6所述的表达神经胶质瘤的抑癌基因的载体在制备抗神经胶质瘤药物中 的应用。
10. 权利要求6所述的重组慢病毒在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK104232647SQ201410474742
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】邓艳春, 王莉 申请人:邓艳春