一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性的检测方法，通过检测给予药物或活性物质后成骨细胞或成骨样细胞碱性磷酸酶(ALP)的含量，检测成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物(或活性物质)的生物活性。该方法简单、易行、专属性强，是对现有的生物活性的检测方法的创新。
【专利说明】一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物 活性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的生物活性的检测方法，更具体地说是一种对成骨细胞的增 殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性检测方法。
【背景技术】
[0002] 药物的生物活性检测法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特 定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。其测定方法包 括生物效价测定法和生物活性限值测定法。
[0003] 天然的、人工合成的生物活性物质、从动物脏器组织中提取制得的生化药品或多 组分生化药品、中药等，由于来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得其制剂的质量控制相对困 难，又往往因为含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全 控制其质量和反映临床疗效。为了使此类药物的质量标准能更好地保证每批药品的临床使 用安全有效，有必要在现有含量测定的基础上增加生物活性检测，以综合评价其质量。
[0004] 药物的生物活性检测方法可以运用多种常用的药理学方法进行，其中以动物实验 (整体实验）和细胞实验（离体实验）居多并且比较成熟，但是由于骨的生长周期比较长， 因此在对具有成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物质的生物活性检测时， 由于骨生长周期的限制，不适宜用整体实验进行；离体实验，由于组织和器官体外培养的难 度很大，所以多选择细胞作为实验载体进行试验。
[0005] 目前常规的公认的细胞生物活性的化学检测法有三种：①四唑盐（MTT)比色法 (原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶 物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶 物，用酶联免疫检测仪以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定 细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比）；②细胞蛋白质含量测定法（考马斯 亮蓝测定法，基本原理为：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈最大吸 收，其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定蛋白质、受体及细胞外代谢物的特异性活 性。）③细胞蛋白质合成测定法（H-亮氨酸掺入法，本原理为：细胞在合成蛋白质时需要摄 取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中，通过测 定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢情况。） 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和 成骨细胞凋亡四个阶段。成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分 泌I型胶原以便最终可以矿化形成骨结节。在细胞增殖晚期，与细胞周期与细胞增殖相 关的基因表达下降，而编码细胞外基质成熟的蛋白的基因开始表达，在分化早期主要是碱 性磷酸酶表达，因此碱性磷酸酶（ALP)被认为是细胞外基质成熟的早期标志，ALPmRNA表 达此时可增加10倍以上。成骨细胞分泌ALP和钙盐结晶体至细胞外基质中，ALP使局部 磷酸含量增高，促使基质矿化。在细胞外基质成熟期，胶原继续合成并相互交联、成熟。在 成骨细胞分化晚期，当培养细胞进入矿化期，细胞内的ALP活性下降，而与细胞外基质中 轻磷灰石沉积相关的基因表达达到高峰，如骨桥蛋白（osteopontin)、骨I丐素、骨唾液酸白 (bonesialoprotein)基因。骨I丐素等非胶原蛋白分泌至细胞外基质中，与I丐、磷结合，然后， 沿胶原分子的长轴，钙和磷结合到胶原分子的侧链的胶原氨基酸残基上，形成羟磷灰石结 晶。体外培养的成骨细胞在骨矿化期骨钙素高度增加，此后，骨钙素逐渐降低，与此同时，可 观察到胶原酶增加，成骨细胞开始凋亡，并出现代偿性细胞增殖和胶原合成。
[0006] 常用的比较成熟的三种检测方法均为检测细胞存活和生长情况，由于成骨细胞数 量的增加并不能全面反应药物对成骨细胞功能的影响情况，而成骨细胞的功能是反映药物 活性的重要指标，因此对于药物所具有的促进成骨细胞的特征性功能（碱性磷酸酶分泌、 骨钙素分泌、胶原蛋白合成等特征性功能）的活性来说，上述三种检测方法均存在专属性 不强，无法全面反应药物的实际活性的缺点。本发明的目的在于找到一种简单、快速、可操 作性强，可用于检测具有促进成骨细胞增殖和功能的药物或活性物质的活性的方法。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种简单、易行、专属性强的用于具有促进成骨 细胞的增殖和功能的作用的药物或活性物质的生物活性的检测方法。
[0008] 本发明方法是通过检测给予药物或活性物质后成骨细胞或成骨样细胞碱性磷酸 酶（ALP)的含量，检测成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物（或活性物质）的生物 活性。
[0009] 具体来说，本发明的方法包括以下步骤： (1) 复苏冻存细胞株或者进行细胞的原代培养，接种于培养瓶培养增殖；当细胞长满 单层后常规消化，以含1-25%小牛血清（胎牛血清、新生牛血清）的培养液调整细胞浓度为 (1-9) X 10(3_1(|)个，置培养箱培养； (2) 培养24小时后，弃培养液，按如下分组加入供试品：①细胞对照组：每孔加含 1-25%小牛血清（胎牛血清、新生牛血清）培养液的细胞悬液；②阴性对照组：加含1-25% 小牛血清（胎牛血清、新生牛血清）的培养液；③供试药物组：将供试药物以含1-25%小牛 血清（胎牛血清、新生牛血清）的培养液配置到合适的检测浓度（本领域技术人员根据公 知常识可确定此检测浓度；例如确定该浓度的方法可以是：将供试药物做适当梯度稀释， 获得连续稀释的药物后，加入到细胞中，按步骤（1)进行培养后测定上清液、细胞内或细胞 内及上清液的碱性磷酸酶含量，以碱性磷酸酶含量高并且重复试验后结果稳定的浓度为最 适宜检测浓度；也可以根据药效学实验的综合结果，确定最适宜检测浓度。）。
[0010] (3)将细胞培养板置37°C、5% CO2培养箱培养24-336小时后，测定上清液、细胞 内或细胞内及上清液的碱性磷酸酶含量（碱性磷酸酶的测定方法可以使用任何可行的检 测方法，例如可以用以下方法进行检测：培养结束前4小时，弃培养液，每孔加入0. Olmol/ L的磷酸盐缓冲液（pH7. 3)洗涤两次，每孔加入100 μ L、0. 1 %的Triton X-100溶液，放置 在-20°C冰箱中反复冻融2次以完全裂解细胞，每孔加入3 X Krtiol i1对硝基苯磷酸二钠 盐（PNPP)溶液及DEA缓冲液各50 μ L，于37°C温箱内反应30min后，每孔加入0. 2mol · L-1 的NaOH 50 μ L终止反应，于酶标仪405nm处测定OD值。）。
[0011] (4)用酶标仪测定各孔A值：检测波长405nm。对数据进行统计学处理：所有数据 以均数士标准差表示，以t检验比较差别的显著性，当P < 0. 05时有活性。
[0012] 还可包括步骤（5)根据公式计算刺激指数，用于判断在测药物的活性程度，刺激 指数的计算公式如下所示：
【权利要求】
1. 一种对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的检测方法，其特征 在于，该方法具体包括以下步骤： (1) 复苏冻存细胞株或者进行细胞的原代培养，接种于培养瓶培养增殖；当细胞长满单 层后常规消化，以含1-25%小牛血清的培养液调整细胞浓度为（1-9)X10 (34(|)个，加入96 孔细胞培养板中，置培养箱培养； (2) 培养24小时后，弃培养液，按如下分组加入供试品：①细胞对照组：每孔加含 1-25%小牛血清培养液的细胞悬液；②阴性对照组：加含1-25%小牛血清的培养液；③供 试药物组：将供试药物以含1-25%小牛血清的培养液配置到合适的检测浓度； (3) 将细胞培养板置37°C、5%C02培养箱培养24-336小时后，测定上清液、细胞内或细 胞内及上清液的碱性磷酸酶含量； (4) 根据以下公式计算刺激指数，用于判断在测药物的活性程度，刺激指数的计算公式 如下所示：
当刺激指数在1. 5-20时认定药物有活性。
2. 如权利要求1所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，其中步骤（3)中细胞培养板的培养时间是72小时。
3. 如权利要求1所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，其中上述对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物或活性物 质包括对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的天然的或人工合成的生物活性物质或多 组分生化药品以及中药制剂。
4. 如权利要求1所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，其中成骨细胞包括所有动物的成骨细胞原代细胞，及已经建立的成 骨或成骨样细胞系，所述已经建立的成骨或成骨样细胞系包括：成骨样细胞株MG-63、成骨 样细胞UMR106、人成骨样细胞OS-732、成骨细胞系hFOBl. 19、人成骨细胞系H0S-8603、新 生小鼠颅骨成骨细胞、新生大鼠颅骨成骨细胞、胎兔颅骨成骨样细胞、人成骨样细胞MMP、 大鼠骨肉瘤成骨样细胞MAPK、人成骨样细胞SA0S-2、成骨样细胞株R0S17/2. 8、小鼠骨样 细胞ML0-Y4、小鼠成骨样细胞MC3T3-E1、永生化大鼠成骨细胞系R0B-1、人成骨样细胞系 0S-732、大鼠R0S17/2. 8细胞系、成骨样细胞系rob-c20或成骨样细胞Hu09。
5. 如权利要求1所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，所述小牛血清为胎牛血清或新生牛血清。
6. 如权利要求3所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，所述多组分生化药品为动物骨多肽制剂，该动物骨多肽制剂包括骨 肽制剂、鹿瓜多肽制剂、复方骨肽制剂或骨瓜提取物制剂。
7. 如权利要求6所述的对成骨细胞的增殖和功能具有促进作用的药物的生物活性的 检测方法，其特征在于，所述骨肽制剂、鹿瓜多肽制剂、复方骨肽制剂或骨瓜提取物制剂为 注射剂或口服制剂。
【文档编号】C12Q1/42GK104480192SQ201410477083
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2010年12月20日 优先权日:2010年12月20日
【发明者】俞嘉林, 李丽静, 权晓丹, 丛艳, 张策, 刘少丽, 徐博, 吴晶晶 申请人:俞嘉林