重组α-银环蛇毒素αBtx的编码序列及其表达载体的制作方法

重组α-银环蛇毒素αBtx的编码序列及其表达载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组α-银环蛇毒素αBtx的编码序列及表达载体，所述编码序列如SEQ ID NO.1—14所示。
【专利说明】重组α -银环蛇毒素 a Btx的编码序列及其表达载体

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种重组α -银环蛇毒素 a Btx的表达载体。

【背景技术】
[0002] α -银环蛇毒素 （a - B ungarotoxin, a Btx)是银环蛇（BungarusMulticinctus) 毒液中的重要成分，由73个氨基酸组成的蛋白质，分子量为8kDa。a Btx可特异性结合并阻 断哺乳动物神经肌接头处的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)，使神经-肌肉电化学偶联脱偶 联，导致骨骼肌无法收缩。a Btx对nAChR有非常高的亲和力和特异性，是研究nAChR的理 想工具。以往使用的aBtx均从银环蛇的毒液中提取，过程复杂、成本昂贵，加之银环蛇产 毒量底，因此商品化的a Btx非常昂贵。寻找并建立一个体外大量获得a Btx的方法和途 径是国内外许多实验室竞相努力的目标。由于a Btx合成加工的特殊性，由5对分子内二 硫键交联组成的特点，以及原核表达体系与蛇毒腺细胞的mRNA密码子的偏爱性的不同，缺 乏对真核基因翻译后的折叠伴侣，使以a Btx全序列cDNA作原核表达无法得到表达产物， 或即便得到了表达产物，也不具有野生a Btx的活性。


【发明内容】

[0003] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组α-银环蛇毒素 CiBtx的表达载 体。
[0004] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0005] 重组α -银环蛇毒素 a Btx的编码序列如SEQ ID NO. 14所示，可通过现有技术中 的载体构建含有SEQ ID NO. 4所示序列的表达载体，命名为表达载体BtxS12NcB2。
[0006] 重组α -银环蛇毒素 a Btx的编码序列如SEQ ID NO. 4所示，可通过现有技术中 的载体构建含有SEQ ID NO. 4所示序列的表达载体，命名为表达载体BtxNcB2。
[0007] 重组α -银环蛇毒素 a Btx的编码序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8,SEQ ID NO. 9,SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12或SEQ ID NO. 13所示；可通过现有技术中的载体构建含有 SEQ ID NO. U SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 或 SEQ ID NO. 13 所示 编码序列的表达载体。含有SEQ ID NO. 1所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNdB，含 有SEQ ID NO. 2所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNdB2,含有SEQ ID NO. 3所示序列 的表达载体命名为表达载体BtxNcB，含有SEQ ID NO. 5所示序列的表达载体命名为表达 载体BtxT60NcB，含有SEQ ID NO. 6所示序列的表达载体命名为表达载体BtxT60NcB2,含有 SEQ ID NO. 7所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS5NcB，含有SEQ ID NO. 8所示序列 的表达载体命名为表达载体BtxS5NcB2,含有SEQ ID NO. 9所示序列的表达载体命名为表达 载体BtxS7NcB，含有SEQ ID NO. 10所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS7NcB2,含有 SEQ ID NO. 11所示序列的表达载体命名为表达载体BtxSl INcB，含有SEQ ID NO. 12所示序 列的表达载体命名为表达载体BtxSllNcB2,含有SEQ ID NO. 13所示序列的表达载体命名为 表达载体BtxS12NcB。
[0008] 下面对本发明作进一步说明：
[0009] 本发明将基因工程和蛋白质工程技术相结合，通过将a Btx的基因编码序列按照 大肠杆菌偏爱密码子重新优化合成，并通过mRNA二级结构的分析，进一步对编码序列进行 优化突变，最终得到非融合表达方式的重组α-银环蛇毒素 aBtx。然后，利用蛋白质复性 技术，制备有野生活性的重组α-银环蛇毒素 aBtx蛋白。即，本发明所涉及的重组α-银 环蛇毒素 CiBtx的表达载体均是以SEQ ID NO. 15所示编码序列为基础进一步优化构建的， 这些表达载体均源于同一构思。
[0010] 具体来说，本发明按照重组α-银环蛇毒素 a Btx成熟肽的氨基酸序列，然后按 照大肠杆菌偏爱密码子合成编码此氨基酸序列的DNA序列BtxV31(SEQ ID NO. 15)，然后 按常规方法将该序列与市售的克隆载体（如PUC57等）构建成含有该序列的载体（如 BtxV31-pUC57)，然后以 Btxl6bNcoI(SEQ ID NO. 17)与 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19)为引 物构建表达载体 BtxNdB 和 BtxNdB2,以 Btxl6bNcoI (SEQ ID NO. 17)与 Btxl6bBamHI (SEQ ID NO. 18)为引物构建表达载体BtxNcB和BtxNcB2 ;这四个表达载体区别是，BtxNcB2编 码的是核心序列，其余的三个序列分别在其N末端，C末端加入了融合标签，用于提高表 达产量，BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB 和 BtxNcB2 的序列依次如 SEQ ID NO. 1-4 所示。再 分别以 BtxNcB 和 BtxNcB2 为基础，以 Btxl6bl67Tu(SEQ ID NO. 20)和 Btxl6bl67Td(SEQ ID NO. 21)为引物构建表达载体BtxT60NcB和BtxT60NcB2,进而分别以Btxl6S5m(SEQ ID N0·22)，Btxl6S7m(SEQIDN0·23)为上游引物，以Btxl6bBamHI(SEQIDN0·18)为下游引 物，分别以 BtxT60NcB 和 BtxNcB 为模板，构建表达载体 BtxS5NcB、BtxS7NcB、BtxSllNcB 和 BtxS12NcB，以 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19)为下游引物则构建表达载体 BtxS5NcB2、 BtxS7NcB2、BtxSllNcB2 和 BtxS12NcB2 ;BtxT60NcB、BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、 BtxS7NcB、BtxS7NcB2、BtxSllNcB、BtxSllNcB2、BtxS12NcB和BtxS12NcB2的序列如SEQID NO. 5 -14所示；这几个序列都是编码能够表达相同的a Btx的基因序列，每一个载体都能 够单独起做用，区别是编码序列稍有不同。然后以以上表达载体转化BL21(DE3)宿主菌，以 IPTG诱导表达、分离r a Btx蛋白质，并对得到的包涵体纯化、复性，纯化活性蛋白，最终得 到具有生物学活性的重组a -银环蛇毒素 r a Btx。
[0011] 所述的含有按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成的编码a Btx成熟肽的DNA序列 的表达载体BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB、BtxNcB2,是含有与上述a Btx编码DNA 90%以上 的同源性的DNA序列的表达载体，当然，构建表达载体包括但不限于pET、pBV220、pGEX、 PQE等系列载体。对a Btx编码序列对应的mRNA的二级结构优化后得到的表达载体 BtxT60B、BtxT60B2、BtxS5NcB，BtxS5NcB2, BtxS7NcB，BtxS7NcB2, BtxSlINcB，BtxSl1NcB2， 8七义512此8,8七1512此82，同样是含有与上述〇8七1编码0嫩90%以上的同源性的0嫩序列 的表达载体，当然，同样包括但不限于PET、pBV220、pGEX、pQE等系列载体。
[0012] 含有a BtX原核表达载体的宿主细胞，但不限于细菌、酵母细胞、昆虫以及哺乳动 物细胞。
[0013] 将a Btx表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，构建a Btx重组表达工程菌，培养这 些工程菌，以IPTG诱导蛋白表达。
[0014] r a Btx包涵体的提取中菌体的破碎，超声前先用含有lmg/ml溶菌酶，I % Triton X-100, IOmM 2-ME的缓冲液消化菌体15?30min，再使用超声法，并在裂菌缓冲液和包涵体 洗涤液中均加入浓度为IOmM的2-巯基乙醇。
[0015] r a Btx包涵体的分离纯化，即将提取得到的包涵体以含有8M尿素，50mM Tris-HCl (pH 8. 6)，IOmM 2-巯基乙醇的溶液变性处理后，12000rpm离心取上清，用阴离子 交换层析吸附杂蛋白，所用的离子交换层析柱为Q Sepharose FF (1.5 X 2cm)，方法为，用含 有50mM Tris-HCl (pH 8. 6)，8M尿素的缓冲液平衡离子交换层析柱，将变性上清上样，用平 衡缓冲液洗脱，收集穿透液和洗脱液，Bradford法确定蛋白峰。
[0016] r a Btx蛋白质的复性，即以Q Sepharose FF吸附后的变性包涵体溶液快速稀释， 使蛋白复性，包涵体溶液含有50mM Tris-HCKpH 8.6)，8Μ尿素，将Q S印harose FF吸附后 的变性包涵体快速稀释到冰冷的复性液中，使蛋白浓度降低至30?40 μ g/ml，4°C静置24h 左右，复性液含有 75mM Tris-HCl(pH 8. 8)，16mM 1-半胱氨酸，0. 2M NaCl。
[0017] r ciBtx蛋白质的复性后的浓缩纯化，将稀释、静置后的蛋白溶液以超滤膜（截 留分子量IkDa)超滤浓缩约500倍，13000rpm/10min离心，取上清进一步分离raBtx单 体，采用Pharmacia公司的AKTA FPLC系统，以IOOmM醋酸铵缓冲液（pH 4. 8)平衡130ml Superdex 75g PG (I. 6 X 65cm，Pharmacia)，然后将浓缩的复性蛋白样品上柱，以0. 8ml/min 的流速洗脱，收集洗脱液，根据A28tl吸收值确定蛋白峰，合并蛋白峰，冻干，再以1.2ml 20mM 醋酸钠缓冲液（pH 4. 8)溶解，将溶解的蛋白样品加载于以缓冲液A(20mM醋酸钠缓冲液（pH 4. 8))平衡的mono S 5/5柱（Pharmacia)，以缓冲液B(20mM醋酸钠缓冲液（pH 4. 8)，IM NaCl)经20倍柱体积至100% B，线性梯度洗脱结合在柱上的蛋白，根据A28tl吸收值确定蛋 白峰，收集蛋白峰。
[0018] 本发明通过研究进一步发现：大肠杆菌表达的raBtx，通过稀释复性和简单的纯 化方案，既可得到和天然α-银环蛇毒素 aBtxOiaBtx)相似的蛋白。由于其生产工艺更 简单，成本更低廉，有望取代天然α-银环蛇毒素 n aBtx。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1是本发明raBtx(V31)制备流程图；
[0020] 图2是r a Btx(V31)重组表达载体及对应的表达蛋白的名称以及蛋白结构域示意 图；
[0021] 图3是r a BtX (V31)融合及非融合表达载体的构建；
[0022] 图 4 是 BtxT60NcB 和 BtxT60NcB2 的构建；
[0023] 图5是r a Btx (V31)编码基因 mRNA二级结构优化表达载体的构建；
[0024] 图6是1\^1^131：1^&8，]\^1^叉和11(11^1的反向]3:>]^纯度检测六：11(11^1;13:]\^1^叉； C：MGBtxStrtag ；
[0025] 图7是MGBtxStrtag，MGBtx和η a Btx的nAChR特异性结合活性比较。

【具体实施方式】
[0026] 实施例1
[0027] -、技术路线：如图1所示的ra Btx (V31)制备流程图：
[0028] I. a Btx(V31)成熟肽编码基因的密码子优化合成；
[0029] 2. pET16b_r a Btx重组融合表达质粒的构建；
[0030] 3. pET16b_r a Btx重组非融合表达质粒的构建；
[0031] 4. r a Btx非融合表达编码序列的mRNA二级结构的优化；
[0032] 5. BL21 (DE3) -r a Btx 工程菌的构建；
[0033] 6. r a Btx预表达及高表达克隆的筛选和r a Btx包涵体的分离纯化；
[0034] 7. r a Btx蛋白质的复性条件的优化和大量复性制备。
[0035] 8. r a Btx单体蛋白的纯化和分离和纯度及活性检测。
[0036]二、步骤：
[0037] I. r a Btx编码基因的优化合成及重组表达质粒的构建。
[0038] ⑴r a Btx编码基因的优化合成。
[0039] 根据a Btx(V31)的氨基酸序列（SEQ ID NO. 16)(如图2所示），由南京金斯瑞生 物公司按照大肠杆菌偏好密码子优化并在其3'端融合一段编码（G4S 1)2连接的Strep-tag 的序列（如图2所示），合成全序列BtxV31，序列如SEQ ID NO. 15所示。
[0040] ⑵r a Btx重组表达质粒的构建。
[0041] ①克隆基因片段的制备：
[0042] 在 1.5ml EP 管 内，力口 入 2μ1 Nde I , 2 μ I BamHI , 4 μ I 10XK, 10μ lBtxV31-pUC57, 22μ 1灭菌去离子水，37°C孵育4h，电泳证实酶切完全后，切胶 回收约300bp的片段，以30μ1无菌去离子水从柱上洗脱。以2μ1 BtxV31-pUC57质粒 为模板，分别加入 2· 5μ 1 引物 Btxl6bNcoI(SEQ ID NO. 17) (25μΜ)与 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19) (25μ Μ)，1〇μ I 5X PrimeSTAR* Buffer(Mg2+plus)，4μ I dNTP Mixture(各 2· 5mM), PrimeSTAR? HS DNA 聚合酶 0· 5μ 1。反应条件为 98°C /10s，68°C /lmin(30 循环）， 电泳，切胶回收约300bp的片段，以30 μ I无菌去离子水从柱上洗脱。按前述方法用Ndel， BamHI双酶切回收的PCR片段20 μ 1，反应体系为40 μ 1。电泳，切胶回收约300bp的片段。
[0043] ②Ndel，BamHI双切载体pET16b的制备：
[0044] 在 I. 5ml EP 管内，加入 2μ I Ndel，2y I BamHI，4y I 10XK，16μ 1 小提的质粒 pET16b，37°C孵育4h，电泳证实酶切完全后，切胶回收纯化线性化片段。以20 μ 1无菌去离 子水从柱上洗脱。
[0045] ③克隆基因片段与线性化载体pET16b的连接、转化及阳性克隆的筛选：
[0046] 分别将第一步回收的两个酶切后的300bp片段20. 5μ 1与1μ 1线性化载体 pET16b，2. 5μ1 10ΧΤ4连接酶反应缓冲液及Ιμ? T4DNA连接酶混匀，16°C孵育16h， 5 μ 1连接混合物进行转化克隆宿主JM109。取200 μ 1转化混合物均匀涂布于含100 μ g/ ml氨苄青霉素的90mm直径琼脂板上，37°C温育过夜。分别挑取数个克隆快速提取质粒， 进行Ndel，BamHI双切鉴定分析，确定连接位点正确，将构建的载体分别命名为BtxNdB和 BtxNdB2。鉴定完成后，挑取含有正确重组质粒的转化菌，大量提取质粒，-20°C保存（如图 3所示）。
[0047] 2. r a Btx非融合表达载体的构建及编码序列mRNA二级结构的优化突变。
[0048] ⑴r a Btx非融合表达载体的构建。
[0049] ① r a Btx编码序列的PCR克隆及Ncol，BamHI双酶切：
[0050] 以 2 μ I BtxV31-pUC57 质粒为模板，分别加入 2· 5 μ 1 引物 Btxl6bNcoI (SEQ ID NO. 17) (25μΜ)与 Btxl6bBamHI(SEQ ID NO. 18) (25μ Μ)，1〇μ I 5X PrimeSTAR* Buffer (Mg2+plus)，4 μ I dNTP Mixture (各 2· 5mM)，PrimeSTAR? HS DNA 聚合酶 0· 5 μ 1。 反应条件为98°C /10s，68°C /lmin(30循环）。按照相似的方案以引物Btxl6bNcoI与 Btxl6bBamHI扩增r a Btx的编码基因序列，将上述的PCR产物电泳切胶回收，分别取10 μ 1 回收的PCR片段，加入4μ1 10ΧΚ，4μ1 0. l%BSA，2yl NcoI，2yl BamHI，灭菌去离子水 18 μ 1，混匀后37°C孵育4h，电泳回收，以20 μ I灭菌去离子水从柱上洗脱。
[0051] ②Ncol，BamHI双切载体pET16b的制备：
[0052] 于 I. 5ml EP 管内，加入 2μ I NcoI，2y I BamHI，16y 1 小提的质粒 pET16b，4y 1 10ΧΚ，4μ I 0. 1% BSA，37°C孵育4h，电泳证实酶切完全后，切胶回收纯化线性化片段。以 20 μ 1无菌去离子水从柱上洗脱。
[0053] ③克隆基因片段与线性化载体pET16b的连接、转化及阳性克隆的筛选：
[0054] 将回收的300bp片段20·5μ1与Ιμ?线性化载体pET16b，2.5yl 10XT4连接酶 反应缓冲液及1 μ I T4DNA连接酶混匀，16°C孵育16h，5 μ 1连接混合物进行转化克隆宿主 JM109。取200 μ 1转化混合物均匀涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素的90mm直径琼脂板上， 37°C温育过夜。分别挑取数个克隆以5ml 2X T T (含1〇〇μ g/ml氨苄青霉素）培养，快速 提取质粒，进行Ncol、BamHI双切鉴定分析，确定连接位点正确。将构建的载体分别命名为 BtxNcB和BtxNcB2。鉴定完成后，挑取含有重组质粒的转化菌，大量提取质粒，-20°C保存 (如图3所示）。
[0055] (2) PCR点突变对表达序列mRNA二级结构的优化。
[0056] ①将r a Btx (V31)编码序列第60位G突变为T :
[0057] 分别以 2 μ I BtxNcB 和 BtxNcB2 质粒为模板，加入引物 Btxl6bl67Tu (SEQ ID NO. 20)和 Btxl6bl67Td(SEQ ID NO. 21) (20mM)各 2· 5μ 1，4μ I dNTP 混合物（2. 5mM)扩 增，10μ1 5XPrimeStar 缓冲液，0·5μ1 PrimeStar DNA 聚合酶，反应条件为 98°C， 68°Clmin(25循环），反应结束后，分别取Ιμ?扩增产物，加入Ιμ? Dpnl，lyl IOXDpnI 缓冲液，9μ 1无菌去离子水，37°C消化2h后，取5μ 1反应液转化克隆宿主菌JM109。挑取 阳性克隆测序。以此方案，将raBtx(V31)编码序列的G60突变为T60,突变后的表达载体 命名为BtxT60NcB和BtxT60NcB2 (如图4所示）。
[0058] ②将r a Btx编码序列的5 '端进行优化突变：
[0059] 分别取 0· 1 μ 1 质粒 BtxNcB，加入 2· 5μ 1 引物 Btxl6S5m(SEQ ID NO. 22)和引物 Btxl6bBamHI(SEQ ID Ν0·18)(20ηΜ)，4μ1 (1ΝΤΡ(250μΜ)，10μ1 5XPrimeStar 缓冲液， 0.5μ I PrimeStar DNA聚合酶，反应条件为98°C 15s，68°C Imin(25循环），回收扩增到的 序列，分别取 1〇μ1 回收的 PCR 片段，加入 4μ1 10ΧΚ，4μ1 0.1%BSA，2yl NcoI，2yl BamHI，灭菌去离子水18μ 1，混匀后37°C孵育4h，电泳回收，以30μ I灭菌去离子水从柱上 洗脱。取20. 5μ1回收后的PCR片段，NcoI和BamHI双切线性化的pET16b，2. 5μ1 10XT4 连接酶反应缓冲液和1 μ I T4DNA连接酶，混匀，16°C孵育16h。以5 μ 1连接混合物转化 大肠杆菌JM109。取200 μ 1转化混合物均匀涂布于含100 μ g/ml氨苄青霉素的90mm直 径琼脂板上，37°C温育过夜。分别挑取数个克隆以5ml 2X T T (含100 μ g/ml氨苄青霉 素）培养，快速提取质粒，进行Nde、BamHI双切鉴定分析，确定连接位点正确。鉴定完成后， 挑取含有重组质粒的转化菌，大量提取质粒，-20°C保存。将得到的表达载体分别命名为 BtxSllNcB (如图5所示），按照类似的方案，得到BtxS5NcB、BtxS7NcB和BtxS12NcB。若采 用 Btxl6bBamHI2(SEQ ID NO. 19)为下游引物，则得到 BtxS5NcB2、BtxSllNcB2、BtxS7NcB2 和BtxS12NcB2。经测序证明所构建的载体的插入片段与预期一致，未引入额外突变。
[0060] 3. r a Btx工程菌的构建及高表达克隆的筛选。
[0061] ⑴重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0062] ①感受态工程菌制备（以下步骤需在无菌条件下进行）：
[0063] a.用接种环分别从含有工程菌BL21 (DE3)的2ΧYT琼脂培养板上挑取单菌落， 接种于含有5ml 2 X YT培养基的试管中，37 °C /220rpm振荡培养4?6h，然后分别吸取 0. 1,0. 5, Iml上述培养物至100ml 2XYT培养基中，23°C过夜培养。
[0064] b.第二日测定培养物OD6c?，取值最为0.55的一瓶，迅速放在冰浴中15min， 5000rpm/4°C /IOmin离心，收集菌体，尽量吸弃上清，加入30ml冰冷的Inoue转化液（含 有 IOmM PIPES，55mM MnCl2，15mM CaCl2, 250mM KC1)，然后 5000rpm/4°C /IOmin 离心。
[0065] c.小心仔细吸弃上清液。加入8ml冰冷的Inoue转化液，轻轻吹吸重悬。200 μ I/ 支分装于I. 5ml预冷的EP管中，然后每管加入14 μ I DMS0,轻弹混勻，于冰上放置约5min, 液氮速冻。于液氮中保存。
[0066] ②重组表达载体转化工程菌：
[0067] a.取感受态菌200μ 1，握在手心中解冻，50μ 1/支分装于预冷的EP管中，加入重 组质粒（这里指的是BtxSllNcB2或BtxS12NcB2) 0. 5 μ 1，轻轻指弹，使之混匀，在冰浴上放 置 20min。
[0068] b. 42°C水浴静置 9〇s。
[0069] c.每管加 37°C预热的 2XYT 培养基 800 μ 1，140rpm/37°C震摇 40min。
[0070] d.取200μ 1转化产物，涂布于含氨苄青霉素（100μ g/ml)2XYT琼脂板表面。37°C 倒置培养12h以上，待菌落形成后取出，4°C冰箱保存。
[0071] ③重组表达载体的预表达分析：
[0072] 挑取单个转化菌落以5ml含100 μ g/ml的2XYT培养液小量培养至OD6tltl ^ 0. 8 时，加入IPTG至ImM，继续培养4h诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析，籍此挑选高表达克隆。
[0073] 4. r a Btx蛋白质的表达和分离纯化。
[0074] ⑴重组蛋白的大肠杆菌诱导表达。
[0075] 挑取重组质粒转化的BL21 (DE3)菌落克隆至5ml含氨苄青霉素（100 μ g/ml)的 2 X YT培养基中，37°C培养4?6h左右，当OD6tltl。0. 8时，取3ml接种于31含氨苄青霉素 (100μ g/ml)的 2XYT 培养基中，260rpm/37°C 震摇培养，OD6tltl ^ L 0 时加入 IPTG 至 ImM，继 续震摇4h，诱导重组蛋白表达。然后离心（10000rpm/5min)，弃上清，将菌体冻存于-20°C备 用。
[0076] ⑵菌体破碎。
[0077] 解冻菌体，加入 30ml 含有 50mM PBS，IOmM 2-ME, 1 % Triton X-100, lmg/ml 溶菌酶 的裂菌液，吹打菌体混匀，冰上放置15min消化裂解菌体，然后以50%波幅，按照占3s/空 12s/总5min的方案，于冰上超声裂解菌体并切断基因组DNA。10000rpm/4°C /IOmin离心收 集沉淀，重复以上步骤1遍，弃上清。然后加入30ml含50mM PBS，IOmM 2-ME，1% Triton X-IOO的包涵体洗液，剧烈吹吸沉淀，10000rpm/4°C /5min离心，弃上清，重复上述步骤3遍， 即得到粗包涵体。
[0078] ⑶包涵体的粗提取和纯化。
[0079] 以 30ml 含 50mM Tris-HCl (pH 8. 6)，8M 尿素 ，IOmM 2-ME 的缓冲液溶解包涵体， 室温下震荡约2h，使包涵体溶解。15000g/10min离心，将上清加载于吸附缓冲液（50mM Tris-HCl (pH 8·6)，8Μ尿素）平衡后过的Q Sepharose FF柱（4X2. 8cm)，收集穿透液，再 以吸附缓冲液洗30ml，以Bradford法确定蛋白峰所在组分，合并含有蛋白的组分，用于复 性。
[0080] 5. r a BtX蛋白质的复性条件的优化。
[0081] ⑴透析复性r a Btx (MGBtxStrtag)条件的优化。
[0082] 将Q Sepharose FF吸附后的MGBtxStrtag装入透析袋（截留分子量3kDa),于4°C 下分别对冰冷的折叠缓冲液透析过夜。折叠缓冲液包括以下四种：①去离子水；②5mM2-巯 基乙醇；③0. 5M NaCl ;④0. 5M NaCl和1% Tween-20。然后对冰冷的去离子水透析4h，重 复一次。最后将透析后的蛋白溶液13000rpm/4°C /IOmin离心，将上清以超滤管（截留分子 量3kDa)浓缩。以非还原SDS-PAGE分析上清中的可溶性蛋白。
[0083] ⑵快速稀释复性r a Btx (MGBtxStrtag)的条件优化。
[0084] 配制以下缓冲液，分别含有①75mM Tris-HCl (pH?8. 8);②75mM Tris-HCl (pH? 8. 8)和 0· 2M NaCl (pH ?8. 8);③ 75mM Tris-HCl (pH ?8. 8)和 0· 5M NaCl ;④ 0· 5M NaCl。 在以上缓冲液中加入不同浓度的1-半胱氨酸，以此作为折叠液。分别取〇. 5ml上述的折叠 缓冲液，加入IOul Q Sepharose FF吸附后的MGBtxStrtag(蛋白浓度大约2mg/ml)，使蛋 白终浓度约为30?40μ g/ml。4°C静置放置7d左右，13000rpm/4°C /IOmin离心，取50μ 1 折叠产物做IiAChR125I- a Btx结合抑制试验。
[0085] 6. r a Btx的大量制备及纯化。
[0086] ⑴r a Btx包涵体的快速稀释复性。
[0087] 将 Q Sepharose FF 吸附后的 r a Btx (MGBtxStrtag 或 MGBtx)溶液按照 I :50 (ν/ ν)的比例快速稀释于冰冷的复性液（含75mmol/l Tris-HCl(pH 8·8)，0·2Μ NaCl，16mM 半胱氨酸）中，4°C静置24h以上，然后以超滤膜（截留分子量IkDa)超滤浓缩约500倍。 13000rpm/10min离心，取上清进一步分离r a Btx单体。
[0088] ⑵复性后的r a Btx的纯化。
[0089] 采用Pharmacia公司的AKTA FPLC系统，以IOOmM醋酸铵缓冲液（pH 4. 8)平衡 130ml Superdex 75g PG(1.6X70cm，Pharmacia),然后将浓缩的复性蛋白样品上柱，以 0. 8ml/min的流速洗脱，收集洗脱液，根据A28c!吸收值确定蛋白峰。合并蛋白峰III，冻干， 再以I. 2ml 20mM醋酸钠缓冲液（pH 4. 8)溶解。将溶解的蛋白样品加载于以缓冲液A(20mM 醋酸钠缓冲液（pH 4. 8))平衡的mono S 5/5柱（Pharmacia)，以缓冲液B (20mM醋酸钠缓冲 液（pH 4. 8)，IM NaCl)经20倍柱体积至100 % B，线性梯度洗脱结合在柱上的蛋白。根据 A28tl吸收值确定蛋白峰，收集蛋白峰，以非还原SDS-PAGE分析每一步的可溶性蛋白。
[0090] 本发明的关键之一在于复性缓冲液的配方，即：75mM Tris-HCKpH 9)，0· 2M NaCl, 16mM半胱氨酸，经过优化试验证实此配方用于折叠 r a Btx效果最佳。
[0091] 7.纯度测定。
[0092] 以 Waters 1525 高效液相色谱仪，采用反相柱（XTerra1^RPlSSym, 4.6 X 150mm) 分析mono S柱纯化的到的MGBtxStrtag和MGBtx。试验方案为：流速lml/min，以缓冲液 98%A(0. 1%三氟乙酸），2%B(0. 1%TFA，99. 9%乙腈）平衡柱，检测波长214nm，上样。然 后30min内至62% B线性梯度洗脱，最后以90% B洗柱IOmin,检测波长214nm(如图6所 示），结果显示，ra Btx与na Btx的洗脱行为非常相似,纯度达到95%以上。
[0093] 8.活性测定。
[0094] (I)125I 标记 n a Btx。
[0095] ①准备工作：将装有Na125I溶液的铅罐置于冰上预冷约半小时，同时以 Iml/ 管的量分装 Triton 缓冲液（含 0· 5 % TritonX-100, IOmM 叠氮钠 ，10mMPBS(pH 7.5)，100mMNaCl) ;1.6mMChloramineT(氯氨 T)，分大约 10 管。以 25ml Triton buffer 平 衡ro-10脱盐柱。取4. 5mg氯氨T溶解于IOml去离子水中，新鲜配制，避光。
[0096] ②标记：取20 μ I Na125I溶液，打入预冷的EP管中，然后加入60 μ 1 0. 5M PBS (ρΗ7· 5)，混匀，然后加入100 μ I a Btx (3. 5mg/ml)，轻弹，混匀，再加入20 μ 1氯氨Τ，混 匀,放冰上,放置5min,然后移入4冰箱，放置20min,不时轻弹混匀。
[0097] ③脱盐去除游离的125I ^离子：加入100 μ I PBS，混匀。加载于预先平衡好的- 10柱上，弃穿透液。以Triton缓冲液洗脱，lml/tube收集穿透液。
[0098] ④计算特异性活度：分别取5 μ 1穿透液稀释于Iml Triton缓冲液中，取10 μ 1稀 释液测定cpm值。合并高值峰，然后以同样的方法测定cpm值。若标记的效率按100%算，蛋 白浓度为x(mg/ml)，体积为：v(ml)，蛋白的分子量为8000, cpm值为c。则标记的125I- a Btx 的特异性活度为：SA = 1.6 X IO11X c/x。
[0099] ⑵去神经支配大鼠骨骼肌nAChR提取物的制备。
[0100] ①准备工作：配制一下溶液：肌肉裂解母液（含〇· IM NaCl，0. OlM PBS(pH 7. 5)， 0· OlNaN3, 0· OlM EDTA, 0· OlM EGTA)和 20% Triton X-100 溶液（含 0· 1% EDTA)，提前置 于4°C冰箱预冷。IM碘乙酰胺，200mM PMSF(溶解于异丙醇中），-20°C冻存。
[0101] ②大鼠双侧股神经和坐骨神经离断：取800g左右的雄性SD大鼠，于戊巴比妥麻醉 下双侧离断坐骨神经和股神经，缝合好伤口，饲养IOd后，处死，取双下肢骨骼肌，液氮速冻 后保存于_45°C，备用。
[0102] ③骨骼肌nAChR提取物的制备：大鼠肌肉破碎前以肌肉裂解母液，IM碘乙酰胺和 IOOmM PMSF 溶液配制肌肉裂解液（含 0· IM NaCl，0. OlM PBS(pH 7.5)，0· OlM NaN3, 0· OlM EDTA，0. OlM EGTA，0. OlM碘乙酰胺，ImM PMSF。溶液配制好以后。称取150g冻存的去神经 支配大鼠骨骼肌，加600ml肌肉裂解液，以高速搅拌机（Philip HR2094)的最高速打碎肌肉 组织，直至大块肌肉组织消失，然后17, 000g/4°C /30min离心，弃上清，加入150ml肌肉裂解 液和 20ml 20% Triton X-100 溶液，于 4°C震荡 1 - 4 小时。然后 17000g/4°C /30min 离 心，弃沉淀，进一步取上清以l〇〇〇〇〇g/4°C /30min离心以去除脂质。最后小心以注射器吸取 剩下的清亮溶液，加入溶液1/10总体积的甘油，混匀，以〇. 5ml/支冻存于-70°C冰箱中。
[0103] ⑶r a Btx蛋白质的活性测定。
[0104] 取大鼠骨骼肌nAChR提取物0.5ml，室温下解冻后放置于冰上，然后加入 1 μ lmab35 (5. 3mg/ml)，1 μ I125I- a Btx 及不同量的 r a Btx 或 η a Btx,混勻后 4°C孵育过夜， 然后加入兔抗大鼠 IgG 10μ 1，4°C孵育2h，13000rpm/5min离心收集沉淀，尽弃上清。然后 以 Triton 缓冲液（含 0· 5% TritonX-100, IOmM 叠氮钠，10mMPBS(pH 7· 5)，IOOmMNaCl)洗 涤沉淀两遍。最后以Y计数仪测定沉淀的cpm值，据此判断raBtx的活性。
[0105] 以含有1% Triton X-100的缓冲液提取去神经支配大鼠肌肉的nAChR。以放免沉 淀法测定r a Btx和η a Btx与nAChR的竞争性结合。可知MGBtx的nAChR结合活力等于甚 至高于η a Btx,而MGBtxStrtag的nAChR结合活力略低于η a Btx (如图7所示）。
【权利要求】
1. 重组a-银环蛇毒素a Btx的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO. 14 所示。
2. 重组a-银环蛇毒素a Btx的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有SEQ ID NO. 14所示的编码序列。
3. 重组a-银环蛇毒素a Btx的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO. 4 所示。
4. 重组a-银环蛇毒素a Btx的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有SEQ ID NO. 4所示的编码序列。
5. 重组a-银环蛇毒素a Btx的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 或 SEQ ID NO. 13 所示。
6. 重组a-银环蛇毒素a Btx的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、 SEQ ID N0.9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 或 SEQ ID NO. 13 所示的编码序 列。
【文档编号】C12N15/12GK104372008SQ201410481648
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月19日 优先权日:2014年9月19日
【发明者】徐江, 陈永恒, 陈主初, 陈林, 李柱一, 徐志凯, 吴兴安, 李佳, 李俊 申请人:中南大学湘雅医院