一种灌木柳花粉离体培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种灌木柳花粉离体培养的条件，包括以下步骤：（1）花粉的采集；（2）培养基的制备；（3）培养方式；（4）培养温度和时间的设定。本发明所述的离体培养基测得的灌木柳花粉生活力比一般染色法测得的花粉生活力更为准确，灌木柳花粉在该培养基上萌发效果好，易观察，且花粉在固体培养基中培养避免了在因液体培养基流动而造成的试验误差，成本低，易操作，在灌木柳繁殖生产上具有重要的实践与推广意义。
【专利说明】一种灌木柳花粉离体培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物花粉离体培养的方法，具体是涉及一种灌木柳花粉离体培养 方法。
【背景技术】
[0002] 柳属L.)是杨柳科最大的属，约550种，我国柳属植物255种，约占全世 界总数的46%，是全世界柳属植物最多、最丰富的地区，在全国各省、区广泛分布，而柳属绝 大部分为灌木柳。灌木柳在欧美国家也是重要的能源树种。
[0003] 花粉作为灌木柳种质的形式之一，包含了灌木柳的所有基因类型，具有丰富的遗 传多样性，是灌木柳种质保存以及杂交育种的重要材料。但大多数灌木柳雌雄异株，花期不 遇，且花粉自然条件下寿命短，这给灌木柳种质研究及其杂交育种工作带来极大的不便，同 时也不利于灌木柳的遗传性状研究。虽然柳树花粉采集和贮藏在欧洲柳树繁殖中已有应 用，但对其提取和贮藏得方法没有具体描述。1996年，Stanto对杨树花粉的采集和贮藏作 了详细研究，该方法并不适用于柳树。杨树花是典型的风媒传粉，而柳树为虫媒传粉，且柳 树花粉表面有一层粘合物质。王源秀利用M&培养基检测五种柳树及其杂家后代的花粉活 力，发现柳树种间，杂交种间及亲本杂种之间的花粉生活力差异较大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种方便快捷、能准确测定灌木柳花粉生活力的离体培养 方法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案来实现的：一种灌木柳花粉离体培养方法，它包括如 下步骤： (1) 花粉的采集：将半开的灌木柳雄株花枝采回并置于温室内水培，待花盛开后，收集 花粉，备用； (2) 培养基的制备：培养基主要成分为蔗糖、硼酸、可溶性钙盐和琼脂，将培养基倒入培 养皿中备用； (3) 花粉培养：将步骤（1)采集的新鲜灌木柳花粉均匀散布在步骤（2)制备的培养基 上，置于光照培养箱中光照培养； (4) 设定培养温度和时间：将步骤（3)中的培养箱温度设定为20 ~ 25摄氏度，光照培 养时间为10 ~ 18小时后可进行萌发率观测，花粉活力可达60%-80%。
[0006] 步骤（1)中，所述灌木柳雄株花枝为春季在生长健壮的灌木柳雄株上，于萌条的 中、上部剪取花芽饱满、芽数较多的枝条。此枝条发育良好，营养充足，成熟度高，后期花粉 萌发率高。
[0007] 步骤（1)中，所述温室培养条件为：温度2(T25 °C，光照2000 Lux，光照时间16 h/ d，相对湿度659Γ75%。
[0008] 步骤（2)中，所述培养基为：200 mg/L硼酸+ 10(T200 mg/L硝酸钙+ 5(T200 g/ L蔗糖+ 7 g/L琼脂，培养基成分比例因灌木柳品种不同而存在差异。蔗糖为柳树花粉离 体萌发提供碳源；H3B03在花粉萌发中的主要作用是可以增加糖的吸收、运转和代谢，促进 构成花粉管壁的成分果胶物的合成；外源Ca 2+可通过钙通道调节花粉管内的动态来影响花 粉管的生长，低浓度的Ca2+浓度有利于柳树花粉萌发。
[0009] 步骤（4)灌木柳培养温度为20-25摄氏度。所述花粉萌发是花粉细胞内一系列生 化反应的结果，而适宜的温度是生化反应正常进行的基本条件之一。不同植物间花粉萌发 和花粉管生长的最适温度存在显著差异。
[0010] 步骤（4)中，所述花粉萌发需要一定的时间，灌木柳的培养时间为10?18h，随培 养时间的延长，花粉萌发率先呈逐渐升高趋势；一定时间后，萌发率不再增加，但随着培养 时间的延长，花粉管生长过长，不便于观测。最佳培养时间为12h。 toon] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于： 1、采用本发明所述的离体培养基培养花粉，可以在测灌木柳花粉生活力时直接观察到 花粉管的发育情况，较直观的反应出花粉的生活力。本发明中蔗糖、硼酸和硝酸钙三个影 响灌木柳花粉萌发的主要因素浓度适宜，避免了因过高浓度的蔗糖会致使花粉产生质壁分 离，造成原生质体脱水，抑制花粉萌发的现象。
[0012] 2、采用本发明所述的离体培养测灌木柳花粉生活力与其他染色法测定花粉生活 力相比，成本低，易操作，且避免了染色法中因统计萌发率过程中花粉细胞遭到破坏染液完 全进入细胞而造成的误差。
[0013] 3、采用本发明所述的离体培养基培养灌木柳花粉试验周期短，培养条件简单。
[0014] 综上所述：本发明所述的离体培养基测得的灌木柳花粉生活力比一般染色法测得 的花粉生活力更为准确，灌木柳花粉在该培养基上萌发效果好，易观察，且花粉在固体培养 基中培养避免了在因液体培养基流动而造成的试验误差，成本低，易操作，在灌木柳繁殖生 产上具有重要的实践与推广意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为培养时间对灌木柳花粉离体培养的影响；图中，P63表示簸箕柳；P102表示 银柳；2333表示蒿柳X毛枝柳；2383表示簸箕柳X蒿柳。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0017] 实施例1 (1) 花粉的采集：将半开的银柳（5： 雄株花枝采回并置于温室内水培至花 盛开，温度控制在20?25摄氏度，待花盛开后，收集花粉于5mL的离心管中， (2) 培养基的制备：筛选出银柳的最佳培养基为150g/L蔗糖+200mg/L硼酸+100mg/L 硝酸钙+7g/L琼脂，备用； (3) 花粉培养：将新鲜银柳花粉均匀散布在步骤（2)制备的培养基上，并置于LRH-300G 光照培养箱中光照培养，光照度为2000Lux ; (3) 设定培养温度：培养箱温度设定为25摄氏度； (4) 设定培养时间：随着培养时间的延长，花粉萌发率先呈逐渐升高趋势；12h后，萌发 率不再增加。结果如表1所示。
[0018] 表1培养时间与银柳花粉离体培养萌发率变化的关系
【权利要求】
1. 一种灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于，它包括如下步骤： (1) 花粉的采集：将半开的灌木柳雄株花枝采回并置于温室内水培，待花盛开后，收集 花粉，备用； (2) 培养基的制备：培养基主要成分为蔗糖、硼酸、可溶性钙盐和琼脂，将培养基倒入培 养皿中备用； (3) 花粉培养：将步骤（1)采集的新鲜灌木柳花粉均匀散布在步骤（2)制备的培养基 上，置于光照培养箱中光照培养； (4) 设定培养温度和时间：将步骤（3)中的培养箱温度设定为20 ~ 25摄氏度，光照培 养时间为10 ~ 18小时后可进行萌发率观测。
2. 根据权利要求1所述的灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（1)中，所述灌 木柳雄株花枝为春季在生长健壮的灌木柳雄株上，于萌条的中、上部剪取花芽饱满、芽数较 多的枝条。
3. 根据权利要求1所述的灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（1)中，所述温 室培养条件为：温度2(T25 °C，光照2000 Lx，光照时间16 h/d，相对湿度659Γ75%。
4. 根据权利要求1所述的灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（2)中，所述培 养基为：200 mg/L硼酸+ ΚΚΓ200 mg/L硝酸钙+ 5(T200 g/L蔗糖+ 7 g/L琼脂。
5. 根据权利要求1所述灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（3)中，光照度为 2000Lux〇
6. 根据权利要求1所述灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（4)中，灌木柳的 培养温度为25°C。
7. 根据权利要求1所述灌木柳花粉离体培养方法，其特征在于：步骤（4)中，灌木柳花 粉萌发的培养时间为12h。
【文档编号】C12N5/04GK104232561SQ201410491744
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】何旭东, 姚伶, 何开跃, 王保松, 王红玲, 黄瑞芳, 施士争 申请人:江苏省林业科学研究院