检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法
【专利摘要】本发明有关于检测艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027的序列、技术平台及其方法；此技术平台包括有与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，以及多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料；其方法是先取得检体DNA，于活体外以引物组进行扩增检体DNA，再检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合此特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027；藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
【专利说明】检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方 法
【技术领域】
[0001] 本发明有关于一种检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法， 于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，尤其指针对检测艰难梭状杆菌核 糖分型027特有的目标序列SEQ ID N0 :1所设计出的#1与#2引物对，并发展出一个单一 步骤、快速且灵敏的技术平台，通过聚合酶链式反应方式，即可检测检体是否具有目标序列 的特征，藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
【背景技术】
[0002] 由Holdeman于1977年首度发表的艰难梭状杆菌（Clostridium difficile)，属于 芽孢杆菌科（Bacillaceae)梭孢杆菌属（clostridium)，其属名来自希腊文，意指梭状物 (spindle)，种名源自拉丁文difficile,是艰难的意思，表示其在分离和研究上都比较艰难； 艰难梭状杆菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，在人体外环境或医疗环境中，会形成孢子体， 常透过医疗照护行为而传播。艰难梭状杆菌尚有不同分型的菌株，其具有不同的毒性能力， 其中有些亦为人体肠道中的正常菌群（normal flora)之一，由于其他肠道菌的竞争压抑才 使其不易致病；但于医院里，有些病患会因为抗生素使用而抑制体内的正常菌群，导致艰难 梭状杆菌伺机性感染，引起艰难梭状杆菌大量增生，由于艰难梭状芽孢杆菌主要的致病力 来自于分泌的毒素A与毒素B，毒素会引发肠黏膜发炎及受损，因此会引起病人伪膜性结肠 炎（pseudomembranous colitis)或严重腹泻等，并可能引起病人败血症，甚至死亡。另外， 曾有研究针对医疗机构所爆发艰难梭状杆菌相关疾病的临床菌株进行分析，发现这些类似 的菌株皆会分泌一种二元毒素⑶T (binary toxin⑶T)，并且于其致病基因tcdC上都有缺 失（deletion),如此的基因改变推测与毒素A与毒素B分泌增加相关。
[0003] 近年来，艰难梭状杆菌感染症（Clostridium difficile infection,0)1)流行病学 的改变与一株艰难梭状杆菌核糖分型（rib〇type)027流行性菌株的出现有关，已知核糖分 型027菌株具有高度毒性，并且由核糖分型027菌株引起的群体性突发事件中，常具有高致 死率与高复发率的情形，因此分析艰难梭状杆菌分型将有助于了解其感染症的流行病学信 息；现有艰难梭状杆菌首要的分型方法为聚合酶链式反应的核糖分型（PCR ribotyping)， 然全球却没有一套简易标准化的检测法可遵照。
[0004] 目前艰难梭状杆菌诊断技术中无法直接以细菌基因分子诊断方式直接判读是否 为核糖分型027,必须以传统聚合酶链式反应核糖分型方式，同时对比标准菌株的基因指纹 图谱才能获得解答。请参阅图7,为现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图，以现有方法进 行核糖分型分析时，其缺点为需要大量已知核糖分型的菌株作为分型的标准依据，并需要 强大的计算机分析，才有办法作标准化分析，实验室的再现性低，具有标准菌株是否购足的 限制且程序较为繁琐。
[0005] 因此，如何发展出可专一性且快速检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的方式， 找到一个特定的基因片段并发展成为单一步骤、快速且灵敏的诊断替代法，便成为此相关 领域发明人关注的焦点。
【发明内容】
[0006] 发明人即是鉴于上述现有的检测艰难梭状杆菌核糖分型的方法于实际实施使用 时仍具有多处缺失，于是本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验 所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。
[0007] 本发明主要目的为提供一种可专一性检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技 术平台及其方法，利用#1引物以及#2引物于活体外以聚合酶链式反应方式，检测检体是 否具有目标序列特征，藉此达到快速确认检体中有无包含艰难梭状杆菌核糖分型027的目 的。
[0008] 为了达到上述实施目的，本发明人提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型 027的技术平台及其方法，用以检测经过纯化和分离的目标序列；其中，目标序列可为脱氧 核糖核酸（DNA)序列，其具有与SEQ ID N0 :1至少85%的序列同一性，较佳是具有至少90% 的序列同一性，更佳是具有至少95%的序列同一性，或可为SEQ ID N0 :1序列。
[0009] -种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其包括：（1)对于艰难梭 状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应的引物对，其包含#1引物及#2 引物，其中#1引物包含SEQ ID N0:2,而#2引物包含SEQ ID N0:3,此引物对是针对艰难梭 状杆菌核糖分型027的SEQ ID N0 :1序列区域所设计；以及（2)多重聚合酶链式反应所需 的引物组及检测材料。
[0010] 本发明的又一目的为提供一种活体外检测艰难梭状杆菌及其核糖分型027的方 法，其包括下列步骤：先取得检体DNA;再于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分 型027基因具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，以检测检体是否含 有符合目标序列SEQ ID N0 :1的特征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型 027,其中，上述的特征是包括序列或序列的长度。
[0011] 于本发明之一实施例中，检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1 :本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图；
[0013] 图2a :本发明其一具体实施例的其中三十一种标准菌株核糖分型检测分析图；
[0014] 图2b :本发明其一具体实施例的其中二十种标准菌株核糖分型检测分析图；
[0015] 图3a :本发明其一具体实施例的第1至41号临床菌株检测分析图；
[0016] 图3b :本发明其一具体实施例的第42至73号临床菌株检测分析图；
[0017] 图3c :本发明其一具体实施例的第74至119号临床菌株检测分析图；
[0018] 图3d :本发明其一具体实施例的第120至149号临床菌株检测分析图；
[0019] 图3e :本发明其一具体实施例的第150至210号临床菌株检测分析图；
[0020] 图3f :本发明其一具体实施例的第211至273号临床菌株检测分析图；
[0021] 图3g :本发明其一具体实施例的第274至334号临床菌株检测分析图；
[0022] 图3h :本发明其一具体实施例的第335至380号临床菌株检测分析图；
[0023] 图3i :本发明其一具体实施例的第381至414号临床菌株检测分析图；
[0024] 图4 :本发明其一具体实施例的核糖分型检测分析图；
[0025] 图5 :本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素检测分析图；
[0026] 图6 :本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素及核糖027分型检测分析图；
[0027] 图7 :现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图。
【具体实施方式】
[0028] 本发明的目的及其结构功能上的优点，将依据以下附图所示的结构，配合具体实 施例予以说明，使审查员能对本发明有更深入且具体的了解。
[0029] 本发明提供一种经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目 标序列，其脱氧核糖核酸序列可例如为具有与SEQ ID N0 :1(请参阅序列表所示）至少85% 的序列同一性，较佳为具有至少90%的序列同一性，更佳为具有至少95%的序列同一性或 可为SEQ ID N0 :1核苷酸序列。
[0030] 首先，本发明提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其主 要包括有：
[0031] (1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应（PCR) 的引物对，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID N0 :2以及#2引物包含SEQ ID N0 :3,且#1引物与#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列SEQ ID N0 :1 序列区域所设计；以及
[0032] (2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
[0033] 请参阅图1所示，为本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图，其检测方法主要 包括有：
[0034] 步骤一（S1):取得检体DNA，其中此检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌，且为 艰难梭状杆菌或其毒素或两者组合已被确认的检体；以及
[0035] 步骤二（S2):于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的引 物组进行多重聚合酶链式反应扩增（amplification)检体DNA，并以上述技术平台（可例如 但不限定为一套件）检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID N0 :1的特征，可例如为序列 或序列的长度（2, 981bp)与SEQ ID N0 :1相符合者，若符合特征则表示检体含有艰难梭状 杆菌核糖分型027。
[0036] 此外，通过下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不以任何 形式限制本发明的范围。
[0037] 简言之，本发明有关于艰难梭状杆菌（Clostridium difficile)核糖分型027菌株 所特有的专一序列作为检测依据的技术平台；此技术平台包括：专一性检测艰难梭状杆菌 核糖分型027的特异性序列的引物设计，及应用于进行多重聚合酶链式反应的引物组，以 及此技术平台的检测流程。本发明人发展出一套多重聚合酶链式反应的检测法，其方法是 先从临床粪便样本分离出DNA，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，并 同时筛选出临床上是否存在艰难梭状杆菌核糖分型027菌株。其中，毒素基因分型的引物 设计是以毒基因型的艰难梭状杆菌致病基因座作为依据；另外还有一组引物利用核糖分型 菌株所特有的序列作为检测依据，可用以专一性的结合在标的序列SEQ ID N0 :1上。藉此 达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。因此，本发明人找到一个具有专 一性的基因位点，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台用于临床检测艰难梭状 杆菌核糖分型027菌株存在与否。
[0038] 实验一：取得检体DNA
[0039] 菌株来源是由美国加州大学洛杉肌分校（University of California, Los Angeles, UCLA)Prof. Goldstein实验室购得40株已知核糖分型的标准菌株，以及由瑞典 CCUG 种源库（Culture Collection, University of G^tebofg，Sweden)购得 11 株标准菌 株；另外，404株艰难梭状杆菌临床菌株取自署立台南医院病人的临床分离菌株；将上述菌 株皆保存于_80°C。
[0040] 于菌株培养时，直接自冻管取菌涂布于琼脂培养基（⑶C anaerobe 5 % sheep blood agar),并置于培养箱中的厌氧缸内，以37°C培养48小时；再取其中单一菌落接种到 50ml培养液（brain heart infusion(BHI)broth)内，密封后置于厌氧培养箱内，以37°C培 养48小时，上述培养液包含有37g/L的脑心浸液（brain heart infusion)、5g/L的酵母提 取物（yeast extraction)和 lg/L 的 L_ 半胱氨酸（L-cysteine)。
[0041] 接着，将培养于50mL离心管内的菌株以2, 500g离心10分钟，并去除上清液留下 沉淀物（pellet)，再以lmL PBS缓冲液回溶沉淀物后，取出200 y L，利用套件（Genomic DNA Mini Kit, Geneaid)所指示的步骤进行DNA萃取。
[0042] 进一步地，本发明利用六组引物（如表一）所建立的多重聚合酶链式反应 (multiplex-PCR)来检测艰难梭状杆菌的 16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及 tcdC 等 六个基因，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型（toxin genotyping)的依据。基因扩增的反 应条件为：（1)DNA变性步骤（denaturation) :94°C，5分钟；（2)接合步骤（annealing):以 94°C，1分钟，接着55°C，1分钟，再72°C，1分钟为一循环，共35个循环；以及（3)延展步 骤（extension或elongation) :72°C，5分钟，并将产物保存在4°C环境。接着，利用2%琼 脂凝胶（agarose gel)进行电泳反应（100伏特，40分钟）后，再以溴化乙菲陡（ethidium bromide, EtBr)染色以进行产物分析。
[0043] 表一
[0044]
【权利要求】
1. 一种经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其脱氧 核糖核酸序列具有与SEQ ID NO :1至少85%的序列同一性。
2. 根据权利要求1所述的经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的 目标序列，其中脱氧核糖核酸序列具有与SEQ ID NO :1至少90%的序列同一性。
3. 根据权利要求2所述的经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的 目标序列，其中脱氧核糖核酸序列具有与SEQ ID NO :1至少95%的序列同一性。
4. 一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其包括： (1) 对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性、用以进行聚合酶链式反应的引物对， 其包含#1引物及#2引物；以及 (2) 多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
5. 根据权利要求4所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其中#1 引物包含SEQ ID NO :2以及#2引物包含SEQ ID NO :3。
6. 根据权利要求4所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其中#1 引物以及#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的SEQ ID NO :1序列区域所设计。
7. -种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其包括下列步骤： 步骤一：取得检体DNA ;以及 步骤二：于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的引物组进行 多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，并检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO: 1的特 征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027。
8. 根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中步骤一 的检体为艰难梭状杆菌或其毒素或两者的组合已被确认的检体。
9. 根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中检体选 自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
10. 根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中目标序 列SEQ ID NO :1的特征包括序列或序列的长度。
【文档编号】C12N15/11GK104450879SQ201410494105
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】蔡佩珍, 蔡博仰, 洪元斌, 柯文谦 申请人:蔡佩珍