一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，涉及一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途。所述启动子能在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因，其在一系列肿瘤细胞中的表达活性高于现有的CAG启动子，且序列稳定（不会在原核细胞及真核细胞转移过程中发生序列丢失）。该启动子可适用于在肿瘤基因治疗过程中，驱动外源基因在肿瘤细胞内的高效表达。
【专利说明】一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途。所 述启动子为人工合成的嵌合启动子，该启动子在肿瘤细胞中具有广谱的高活性。本发明还 涉及含有该启动子的重组载体、重组病毒、以及所述启动子控制治疗基因用于基因治疗的 用途。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5'端上游，是RNA聚合酶识别、 结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶（holoenzyme)同模板正确结合，活 化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动 子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的 关键。
[0003] 根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育 阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。
[0004] 哺乳动物中常用的组成型启动子包括病毒来源：鼠或人巨细胞病毒（CMV)启动子 (分别简称mCMV与hCMV)、猴空泡病毒SV40启动子；人基因组天然来源：EFla启动子、泛素 启动子（Ubiquitin，简称Ubi)、β -actin启动子、PGK-I启动子、Rosa26启动子、HSP70启动 子、GAPDH启动子、eIF4Al启动子、Egrl启动子、FerH启动子、SM22 α启动子、Endothelin-I 启动子等。
[0005] 哺乳动物常用组织特异性启动子有：Β29启动子（Β细胞特异性）、CD14启动子（单 个核细胞特异性）、CD43启动子（淋巴细胞及血小板特异性）、CD45及INF- β启动子（造 血细胞特异性）、⑶68启动子（巨噬细胞特异性）、Desmin及Myoglobin启动子（肌肉细 胞特异性）、CD105及CD102启动子（内皮细胞特异性）、GFAP启动子（星形胶质细胞特异 性）、GPIIb启动子（巨核细胞特异性）、Surfactant Protein B启动子（肺特异性）、NSE 启动子（成熟神经元细胞特异性）、Alb启动子（肝特异性）等。
[0006] 常用肿瘤特异性启动子有：AFP启动子（肝癌特异性）、CCKAR启动子（胰腺癌特异 性）、PSA启动子（前列腺癌特异性）、Tyr启动子（黑色素瘤特异性）、hTERT启动子/CEA 启动子 /Survivin 启动子 /CXCR4 启动子 /COX-2/L-plastin 启动子 /epididymis protein 4启动子/E2F1启动子（肿瘤广谱特异性）等。
[0007] 常用诱导型启动子有：基于四环素（Tet)系统的诱导型启动子（包括Tet-On或 Tet-off)、脱皮激素类诱导系统的诱导型启动子、FK506调控系统的诱导型启动子、纳巴霉 素诱导系统的诱导型启动子、RU486诱导系统的诱导型启动子等。
[0008] 在肿瘤基因治疗中，维持外源基因的高效稳定表达非常重要。然而，一些病毒来源 的组成型启动子尽管瞬时表达活性较高（如CMV启动子），但容易因表观遗传修饰而被关 闭表达；而一些人源天然组成型启动子或肿瘤特异性启动子虽然表达稳定，但表达活性相 对较弱，难以满足基因治疗需求。因而，研究人员又设计构建了一系列人工嵌合启动子，它 们包含了一些顺式调控元件，主要包括能发挥稳定表达作用的启动子核心序列，以及能增 强表达效率的上游增强子或下游内含子，代表者是嵌合启动子CAG (包含人CMV增强子-鸡 β -actin启动子-兔β -globin内含子），广泛应用于外源基因的表达。
[0009] 尚需要开发适合在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因的启动子，其在一系列肿瘤 细胞中的表达活性高于CAG启动子，且序列稳定（不会在原核细胞及真核细胞转移过程中 发生序列丢失），并能够适用于驱动外源基因在肿瘤细胞内的高效表达。
【发明内容】
[0010] 本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，设计构建了一系列新型嵌合启动子， 并从中筛选获得一个能在肿瘤细胞内广谱高效表达外源基因的启动子。本发明人惊奇地发 现，该启动子序列稳定，不会随着其在原核细胞或真核细胞内的转移而发生序列丢失现象， 并且能够稳定地表达驱动外源基因的表达。由此提供了下述发明：
[0011] 本发明的一个方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含如下元件：
[0012] hCMV增强子、β -Actin启动子和mCMV增强子；
[0013] 具体地，其还包含Ubi增强子；更具体地，Ubi增强子位于上述3种元件的下游；
[0014] 具体地，上述4种元件各自独立地为1个、2个、3个或3个以上；
[0015] 具体地，所述多核苷酸具有启动子功能。
[0016] 根据本发明任一项所述的多核苷酸，其依次包含：
[0017] hCMV增强子+ β -Actin启动子+mCMV增强子，或者
[0018] mCMV增强子+hCMV增强子+ β -Actin启动子；
[0019] 优选地，其依次包含：
[0020] hCMV增强子+ β -Actin启动子+mCMV增强子+Ubi增强子，或者
[0021] mCMV增强子+hCMV增强子+ β -Actin启动子+Ubi增强子。
[0022] 根据本发明任一项所述的多核苷酸，其中：
[0023] hCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 17所示；
[0024] β -Actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO :18所示；
[0025] mCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 19或SEQ ID NO :20所示；优选为SEQ ID NO ：20 ；
[0026] Ubi增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO :21所示。
[0027] 根据本发明任一项任一项所述的多核苷酸，其各个元件之间有或没有连接序列或 者剪接位点；具体地，在mCMV增强子和/或hCMV增强子和/或Ubi增强子的上游和下游分 别有剪接供体和剪接受体；更具体地，所述剪接供体的核苷酸序列如SEQ ID NO :22所示； 所述剪接受体的核苷酸序列如SEQ ID NO :23所示。
[0028] 剪接供体（splice donor，SD) :AAAACAGGTAAGTCC(SEQ ID NO :22)
[0029] 剪接受体（splice acc印tor，SA) :GCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTAC AGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO ：23)
[0030] 在本发明的一个实施方案中，不拘于理论的限制，启动子后面的增强子序列两端 含有剪切位点，保证在转录后，位于启动子下游的增强子序列能被准确剪切掉，不影响目的 蛋白的翻译；其余元件直接连接。
[0031] 本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含或者为选自如下的a - e中 任意一组的多核苷酸：
[0032] a. SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列所示的多核苷酸；
[0033] b.与SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列互补的多核苷酸；
[0034] c.在高等严紧条件下能够与上述a或b的多核苷酸杂交并具有启动子功能的多核 苷酸；
[0035] d.对上述a或b所示多核苷酸进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰并具有 启动子功能的多核苷酸；和
[0036] e.与上述a或b所示多核苷酸具有至少90%同一性并具有启动子功能的多核苷 酸；
[0037] 具体地，a或b中的多核苷酸具有启动子功能。
[0038] 本发明的上述多核苷酸为启动子；具体地，是嵌合启动子。
[0039] SEQ ID NO : I-SEQ ID NO :4 的具体序列如下：
[0040] CAC启动子（含hCMV增强子+ β -Actin启动子+mCMV增强子）：
【权利要求】
1. 一种分离的多核苷酸，其包含如下元件： hCMV增强子、β -Actin启动子和mCMV增强子； 具体地，其还包含Ubi增强子；更具体地，Ubi增强子位于上述3种元件的下游； 具体地，上述4种元件各自独立地为1个、2个、3个或3个以上； 具体地，所述多核苷酸具有启动子功能。
2. 根据权利要求1所述的多核苷酸,其依次包含： hCMV增强子+ β -Actin启动子+mCMV增强子，或者 mCMV增强子+hCMV增强子+ β -Actin启动子； 优选地，其依次包含： hCMV增强子+ β -Actin启动子+mCMV增强子+Ubi增强子，或者 mCMV增强子+hCMV增强子+ β -Actin启动子+Ubi增强子。
3. 根据权利要求1所述的多核苷酸,其中： hCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 17所示； β -Actin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 18所示； mCMV增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :20所示；优选为SEQ ID NO: 20 ； Ubi增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO :21所示。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其各个元件之间有或没有连接序列 或者剪接位点；具体地，在mCMV增强子和/或hCMV增强子和/或Ubi增强子的上游和下 游分别有剪接供体和剪接受体；更具体地，所述剪接供体的核苷酸序列如SEQ ID NO :22所 示；所述剪接受体的核苷酸序列如SEQ ID NO :23所示。
5. -种分离的多核苷酸，其包含或者为选自如下的a - e中任意一组的多核苷酸： a. SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列所示的多核苷酸； b. 与SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列互补的多核苷酸； c. 在高等严紧条件下能够与上述a或b的多核苷酸杂交并具有启动子功能的多核苷 酸； d. 对上述a或b所示多核苷酸进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰并具有启动 子功能的多核苷酸；和 e. 与上述a或b所示多核苷酸具有至少90%同一性并具有启动子功能的多核苷酸； 具体地，a或b中的多核苷酸具有启动子功能。
6. -种核酸构建体，包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，以及可操作地连接 的外源基因；具体地，所述外源基因选自p53、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-24、Trail、pl6、TK、 IFN γ、TNFa、Rb、Sirpa等中的任意一种或多种；具体地，所述外源基因为SEQ ID NO :12 所示 p53 和 / 或 SEQ ID NO :4 所示 GM-CSF。
7. -种重组载体，其含有权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所 述的核酸构建体；具体地，所述重组载体为重组病毒载体；具体地，所述重组载体为权利要 求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体与pDC315质粒或 SG655经重组得到的重组载体。
8. -种药用组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6 所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体，以及可选的药学上可接受的辅料。
9. 选自如下的⑴或⑵的用途： (1) 权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者 权利要求7所述的重组载体在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗癌症或者抗肿瘤的药物 中的用途；具体地，所述癌症或者肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、 卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列 腺癌； (2) 权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者 权利要求7所述的重组载体在制备抑制肿瘤细胞的药物或者试剂中的用途；具体地，所述 肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫 颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具 体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自H印3B、Huh7、H印G2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和 H1299细胞中的任意一种。
10. -种在体内或体外抑制肿瘤细胞的方法，包括使用有效量的权利要求1至5中任一 项所述的多核苷酸或者权利要求6所述的核酸构建体或者权利要求7所述的重组载体的步 骤；具体地，所述肿瘤细胞为如下肿瘤的细胞：肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳 腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌 或前列腺癌；在具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为选自H印3B、Huh7、H印G2、PLC/PRF/5、 BEL-7404、H460和H1299细胞中的任意一种。
11. 权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸在作为启动子中的用途。
12. -种分离的多核苷酸，其包含或者为SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列或其互补序 列。
13. 权利要求12所述的多核苷酸在制备启动子中的用途；具体地，所述启动子为具有 启动子功能的权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸。
【文档编号】C12N15/113GK104212802SQ201410495099
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】钱其军, 金华君, 李振海, 吕赛群, 吴红平, 丁娜, 李林芳, 俞德超, 吴孟超 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院, 上海白泽生物科技有限公司