一种鱼类肌肉组织总rna的提取方法
【专利摘要】本发明提供了一种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法,将鱼类肌肉组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，再经异丙醇-醋酸钠和氯化锂沉淀，DNA酶处理后，经洗涤获得鱼类肌肉组织总RNA。本发明所述提取方法，可避免鱼肌肉组织中的内源性RNA酶、多糖(主要是肌糖原)和蛋白等对RNA提取的影响，获得一种低降解、多糖蛋白去除彻底的RNA分离纯化方法，提取的RNA纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染，满足后续实验要求。
【专利说明】—种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类总RNA的提取，具体地说，涉及一种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法。
【背景技术】
[0002]总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，从组织中提取纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的总RNA的分离纯化方法，是决定后续实验结果质量的关键，一些特定的部位使用通用的RNA分离纯化方法，往往不能满足要求，需要相应的处理与提取制备方法。
[0003]鱼类肌肉组织按其构造、功能可分为骨骼肌、平滑肌、心肌，不同肌肉成分含量上略有差异，但大体上相近，含有大量的多糖(主要是肌糖原)和蛋白(肌原纤维，包括肌球蛋白和肌动蛋白)，采用传统的RNA分离纯化方法，在抽提的过程中容易产生多糖和蛋白污染,而且鱼肌肉组织内源性RNA酶含量高，单位细胞RNA含量相对较少，采样和操作过程中样本不易研磨、裂解不充分，极易造成RNA降解而使提取失败。上述这些问题，使鱼类肌肉组织总RNA难以稳定的分离和纯化。
[0004]目前，有针对性的分离纯化鱼肌肉组织总RNA的方法较少，用传统方法操作过程中，鱼肌肉组织研磨和裂解不充分，提取的总RNA得率低、稳定性差、容易污染，无法满足后续实验的要求。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于鱼类肌肉组织总RNA的提取方法。
[0006]为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]一种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法，具体为:将鱼类肌肉组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，再经异丙醇-醋酸钠和氯化锂沉淀，DNA酶处理后，经洗涤而获得鱼类肌肉组织总RNA。
[0008]进一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β -巯基乙醇和/或8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5%和0.10-0.15%。由于Trizol裂解液本身含有0.10%的8-羟基喹啉，因此也可不再加入8-羟基喹啉。但为了更好的抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰，在Trizol裂解液使用前加入0.05% 8-羟基喹啉，使其在Trizol裂解液中的体积浓度达到0.15%。
[0009]进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为l/4Trizol体积。
[0010]进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。
[0011]进一步地,在使用异丙醇-醋酸钠沉淀RNA前，加入RNase-free的脂质体。脂质体的常规用量为5-10 μ g,可结合RNA并共同析出，脂质体浓度大于4 μ g/μ 1会影响PCR反应，RNA最终溶液体积为20-30 μ 1，脂质体的浓度为0.17-0.25 μ g/μ 1，不会影响技术方案的效果和后续实验。
[0012]作为优选，所述硫酸铵的使用浓度为4mol/L。
[0013]作为优选，所述氯化锂的使用浓度为3.5mol/L。
[0014]进一步地，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。
[0015]进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤:
[0016]1)取鱼肌肉组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；
[0017]2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，17000-19000g4°C离心，取上清；
[0018]3)加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000_7000g4°C离心，取上清；
[0019]4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g4°C离心，取上清；
[0020]5)加入RNase-free的脂质体，用针头抽吸2-3次；
[0021]6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀，_20°C放置，12000g4°C离心，弃上清液，管底部会出现少量沉淀；
[0022]7)用预冷的乙醇悬浮沉淀，12000g4°C离心，弃去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；
[0023]8)加入氯化锂溶液，-20°C放置60-80min，12000g4°C离心，RNA沉淀于管底，弃上清；
[0024]9)用预冷的乙醇悬浮沉淀，12000g4°C离心，弃去乙醇，晾干，加入RNase-free水充分溶解；
[0025]10)力卩入 RNase-free DNase 缓冲液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制剂和RNase-free 水，37°C处理 40_50min，得到 DNA 酶处理液；
[0026]11)加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后_80°C放置15-25min，12000g4°C离心，弃上清；
[0027]12)用预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g4°C离心，弃上清，室温封闭静置5_10min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液充分溶解，_80°C保存。
[0028]更进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤:
[0029]1)用手术工具取80_90mg鱼肌肉组织，无菌RNase-free (无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，_80°C超低温冻存；
[0030]2)将冻存样本迅速转入含有1ml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8_10s，间隔15_20s，超声破碎8-10s，17000-19000g4°C离心 lOmin，取上清；
[0031]3)加入500μ 14mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g4°C离心3-5min，吸上清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH = 5.5 ;
[0032]4)加入氯仿和正丁醇混合液350_400μ 1，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g4°C离心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1 ；
[0033]5)加入5 μ g RNase-free的脂质体，用针头抽吸上清2_3次；优选4.5号针头，搭配1ml注射器使用；
[0034]6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20°C放置60min, 12000g4°C离心15min,弃上清液,管底部会出现少量沉淀；所述异丙醇_醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH = 5.2 ;
[0035]7)用75%已预冷的乙醇800-1000 μ 1均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min,晾干，加入RNase-free水50 μ 1充分溶解；
[0036]8)加入 50 μ 17mol/L 的氯化锂，_20°C放置 60_80min，12000g4°C离心 15min，RNA沉淀于管底，弃上清；
[0037]9)用75%已预冷的乙醇800-1000 μ 1均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解；
[0038]10)加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液(10 X DNase I Buffer,宝生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I，宝生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制剂(20U/μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和 20.5 μ 1RNase-free 水，37°C处理 40_50min，得到 DNA 酶处理液；
[0039]11)加入2.5 μ 1浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78_82°C加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1浓度为3.5mol/L醋酸钠和250 μ 1已预冷的无水乙醇，混匀后_80°C放置15-25min，12000g4°C离心lOmin，弃上清；
[0040]12)用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min,晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0041]其中，所述Trizol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)使用前加入2.5%体积分数的β -巯基乙醇和0.05%体积分数的8-羟基喹啉。
[0042]本发明的有益效果在于:
[0043]本发明提供一种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法，可避免鱼肌肉组织中的内源性RNA酶、多糖(主要是肌糖原)和蛋白等对RNA提取的影响，获得一种低降解、多糖蛋白去除彻底的RNA分离纯化方法，提取的RNA纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染，满足后续实验要求。
[0044]本发明通过在Trizol中加入2.5%的β -巯基乙醇和0.05%的8_羟基喹啉，可在裂解过程中有效抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰。Trizol中加入β-巯基乙醇和8-羟基喹啉，用来抑制RNA酶活性，本申请根据实验发现，在处理富含RNA酶的组织时，Trizol加入2.5%的β -巯基乙醇和0.05%的8-羟基喹啉协同作用效果最好，可有效的抑制内源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等的干扰。
[0045]本发明将冷冻样本在Trizol中匀浆后，使用超声破碎进行处理，能够更好的裂解细胞，使RNA充分游离到液相中。液氮研磨法破碎样本，由于液氮极易挥发，研磨过程中要不断的向研钵中加入液氮，耗费时间长，操作不方便，有安全隐患，而对冻存样本进行电动匀浆，匀浆后再使用超声破碎，细胞破碎速度快，匀浆彻底，操作简单安全，缩短了处理时间，有效减少RNA的降解。
[0046]本发明在Trizol裂解液处理后，将离心力增加至17000_19000g，可有效沉降破碎细胞壁、杂质等。
[0047]本发明在Trizol处理液中加入4mol/L硫酸铵,可使蛋白脱水沉淀,有效去除提取过程中的蛋白污染。针对组织中蛋白含量较高，加入硫酸铵沉淀蛋白一次，硫酸铵沉淀蛋白的效率一般大于85%，降低蛋白对后续实验的影响，再进行氯仿正丁醇抽提，可以充分去除蛋白。
[0048]本发明使用氯仿与正丁醇混合液(24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分离效果，保证RNA的纯度和完整性。常规提取过程中，抽提时使用氯仿或氯仿异戊醇混合物，使用量约为l/5Trizol体积，改用氯仿与正丁醇混合物，比例为24:1，使用量增加至1/4体积可以有效提高处理效率，利于水相、蛋白相和有机相的分离，且异戊醇的毒性较大，改用正丁醇可降低毒性，保护操作人员。
[0049]本发明在沉淀RNA之前，加入RNase-free的脂质体，可有效析出RNA，提高RNA得率。
[0050]本发明将常规方法中的异丙醇沉淀步骤改为使用异丙醇-醋酸钠混合液(异丙醇:醋酸钠=4:1)沉淀，处理条件为-20°C放置60min，，沉淀RNA。在加入异丙醇同时加入醋酸钠，沉淀RNA的同时溶解多糖类物质，使它们有效分离。醋酸钠等高盐溶液可在提取过程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的体积为10%，浓度一般为3mol/L(终浓度0.3mol/L)，处理条件一般为-20°C放置3小时，本申请根据实验发现在加入异丙醇阶段，醋酸钠加入量增加至20%且浓度降低至2mol/L(终浓度0.4mol/L)，处理条件为_20°C放置60min，可提高沉淀并溶解多糖类物质的效率，而DNA酶处理阶段醋酸钠浓度也增加至3.5mol/L，可有效析出RNA。
[0051]本发明在醋酸钠沉淀后再使用氯化锂进行处理，氯化锂处理的最佳使用条件为3.5mol/L, _20°C放置70_80min，可有效的去除多糖类物质。醋酸钠和氯化锂处理配合使用，对样品中的多糖去除彻底，氯化锂沉淀的条件一般为_4°C、-20°C、-80°C进行处理，通过实验发现-20°C放置90min效率最高，条件更加容易控制，使用浓度3.5mol/L，去除多糖效果最好。
[0052]本发明将一般乙醇处理过程中7000_8000g的离心力增加至12000g，能够更好地沉淀RNA，较大的离心力使RNA粘附于管底，去除上清的时候利于操作。
[0053]本发明引入DNA酶处理步骤，在DNA处理前，已经通过氯仿正丁醇和注射器抽提，可去掉部分DNA片段，但并不彻底，加入DNA酶处理步骤，将消化时间延长至40-50min，可提高DNA酶处理效率，更彻底的去除基因组DNA污染。DNA酶的失活使用78_82°C热处理3min，使DNA酶失活更加彻底，利于后续的分离与纯化，相对于氯仿抽提法，缩短了处理时间，有效减少RNA在纯化中的降解。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]图1为本发明所述方法提取的鱼类肌肉组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0055]图2为本发明所述方法提取的鱼类肌肉组织总RNA经反转录后，对β -actin基因进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0056]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0057]实施例1
[0058]本实施例所述鱼类肌肉组织总RNA的提取方法具体步骤如下:
[0059]1.用手术工具取80mg鱼肌肉组织，无菌RNase-free (无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(_80°C )冻存。
[0060]2.将冻存样本迅速转入含有lml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8s，间隔15s，超声破碎8s，17000g4°C离心lOmin，吸上清至离心管A中。
[0061]注:TriZ0l裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巯基乙醇和0.5 μ 1的8-羟基喹啉。
[0062]3.向离心管Α中加入500μ 14mol/L硫酸铵(PH5.5)，振荡摇匀，5000g4°C离心3min,吸上清液至离心管B中。
[0063]4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=24:1) 350 μ 1 (混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g4°C离心lOmin，吸取上清液至离心管C中。
[0064]5.向上清中加入5yg RNase-free的脂质体，用4.5号针头(搭配lml注射器)抽吸上清2-3次。
[0065]6.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇:醋酸钠=4:1,醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20°C放置60min，12000g4°C离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀。
[0066]7.用75%已预冷的乙醇800μ 1均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5min,晾干,加入RNase-free水50 μ 1充分溶解。
[0067]8.向离心管 C 中加入 50 μ 17mol/L 的 LiCL，_20°C放置 60_80min，12000g4°C离心15min, RNA沉淀于管底，弃上清。
[0068]9.用75%已预冷的乙醇800 μ 1均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5min,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0069]10.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液(10 X DNase I Buffer,宝生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I,宝生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制剂(20U/ μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和20.5 μ 1 RNase-free水，37°C处理40min，得到DNA酶处理液。
[0070]11.向DNA酶处理液中加入2.5μ 1浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78°C加热处理3min,随后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1浓度为3.5mol/L醋酸钠和250 μ 1已预冷的无水乙醇，混匀后_80°C放置15min，12000g4°C离心lOmin，弃上清。
[0071]12.用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置5min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0072]实施例2
[0073]1.用手术工具取90mg鱼肌肉组织，无菌RNase-free (无RNA酶)水清洗后迅速放入液氮中速冻，超低温(_80°C )冻存。
[0074]2.将冻存样本迅速转入含有lml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎10s，间隔20s，超声破碎10s，19000g4°C离心lOmin，吸上清至离心管A中。
[0075]注:TriZol裂解液(TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司)，Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巯基乙醇和0.5 μ 1的8-羟基喹啉。
[0076]3.向离心管Α中加入500μ 14mol/L硫酸铵(PH5.5)，振荡摇匀，7000g4°C离心5min,吸上清液至离心管B中。
[0077]4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液(氯仿:正丁醇=24:1)400 μ 1 (混合液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g4°C离心lOmin，吸取上清液至离心管C中。
[0078]5.向上清中加入5yg RNase-free的脂质体，用4.5号针头(搭配lml注射器)抽吸上清3次。
[0079]6.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液(异丙醇:醋酸钠=4:1,醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20°C放置60min，12000g4°C离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀。
[0080]7.用75%已预冷的乙醇1000 μ 1均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置lOmin,晾干，加入RNase-free水50 μ 1充分溶解。
[0081]8.向离心管 C 中加入 50μ 17mol/L 的 LiCL，-20 °C 放置 80min，12000g4 °C 离心15min, RNA沉淀于管底，弃上清。
[0082]9.用75%已预冷的乙醇100(^1均匀悬浮漂洗沉淀，1200(^41:离心51^11，弃去乙醇，室温封闭静置lOmin,晾干，加入RNase-free水20 μ 1充分溶解。
[0083]10.向 RNA 溶液中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液(10 X DNase I Buffer,宝生物公司)、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶(5U/ μ 1 RNase-free Recombinant DNase I,宝生物公司)、2.5 μ 1 的 RNA 酶抑制剂(20U/ μ 1 RNase Inhibitor, Life technologies 公司)和20.5 μ 1 RNase-free水，37°C处理50min，得到DNA酶处理液。
[0084]11.向DNA酶处理液中加入2.5μ 1浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀82°C加热处理3min,随后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ 1浓度为3.5mol/L醋酸钠和250 μ 1已预冷的无水乙醇，混匀后_80°C放置25min，12000g4°C离心lOmin，弃上清。
[0085]12.用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置lOmin，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液30 μ 1充分溶解，_80°C保存。
[0086]本发明提取并纯化获得的鱼类肌肉组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼类肌肉总RNA浓度为200-250ng/l.! 1，吸光度0D260/0D280的比值稳定在1.8-2.0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无DNA和蛋白污染。
[0087]本发明提取后的鱼类肌肉组织总RNA经反转录后，对β -actin基因进行了 PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2:电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。
[0088]本发明提取并纯化获得的鱼类肌肉组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼类肌肉总RNA浓度为200-250ng/l.! 1，吸光度0D260/0D280的比值稳定在1.8-2.0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无DNA和蛋白污染。
[0089]本发明提取后的鱼类肌肉组织总RNA经反转录后，对β -actin基因进行了 PCR扩增，琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2:电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。
[0090]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种鱼类肌肉组织总RNA的提取方法，其特征在于，将鱼类肌肉组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，再经异丙醇-醋酸钠和氯化锂沉淀，DNA酶处理后，经洗涤而获得鱼类肌肉组织总RNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入β -巯基乙醇和8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1.0-2.5%和0.10-0.15%。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为l/4Trizol 体积。
4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。
5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，在使用异丙醇-醋酸钠沉淀RNA前,加入RNase-free的脂质体。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸铵的使用浓度为4mol/L。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述氯化锂的使用浓度为3.5mol/L。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。
9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)取鱼肌肉组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存； 2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-freeEP管中，匀浆后置于冰中，超声破碎，离心，取上清； 3)加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，离心，取上清； 4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上清； 5)加入RNase-free的脂质体，用针头抽吸2-3次； 6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀，离心，弃上清液； 7)用预冷的乙醇悬浮沉淀,离心,弃去乙醇，晾干,加入RNase-free水充分溶解； 8)加入氯化锂溶液，放置60-80min，离心，RNA沉淀于管底，弃上清； 9)用预冷的乙醇悬浮沉淀,离心,弃去乙醇，晾干,加入RNase-free水充分溶解； 10)加入RNase-free DNase 缓冲液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制剂和 RNase-free水，处理40-50min，得到DNA酶处理液； 11)加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清； 12)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液充分溶解，_80°C保存。
10.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用手术工具取80-90mg鱼肌肉组织,无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速冻，-80°C超低温冻存； 2)将冻存样本迅速转入含有ImlTrizol裂解液的RNase-free EP管中，使用RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8_10s，间隔15_20s，超声破碎8-10s，17000-19000g4°C离心 lOmin，取上清； 3)加入500μ 14mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g4°C离心3_5min，吸上清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH = 5.5 ; 4)加入氯仿和正丁醇混合液350-400μ1，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min, 12000g4°C离心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为 24:1 ; 5)加入5μ g RNase-free的脂质体，用针头抽吸上清2_3次； 6)加入与步骤5)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀_20°C放置60min，12000g4°C离心15min，弃上清液，管底部会出现少量沉淀；所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋酸钠溶液的pH = 5.2 ; 7)用75%已预冷的乙醇800-1000μ I均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min,晾干,加入RNase-free水50 μ I充分溶解； 8)加入50 μ 17mol/L 的氯化锂，_20°C放置 60_80min，12000g4°C离心 15min，RNA 沉淀于管底，弃上清； 9)用75%已预冷的乙醇800-1000μ I均匀悬浮漂洗沉淀，12000g4°C离心5min，弃去乙醇，室温封闭静置5-10min,晾干,加入RNase-free水20 μ I充分溶解；
10)加入5 μ I 的 RNase-free DNase 缓冲液、2 μ I 的 RNase-free DNA 酶、2.5 μ I 的 RNA酶抑制剂和20.5 μ I RNase-free水，37°C处理40_50min，得到DNA酶处理液； 11)加入2.5μ I浓度为0.5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78_82°C加热处理3min，随后依次加入RNase-free水47.5 μ 1、10 μ I浓度为3.5mol/L醋酸钠和250 μ I已预冷的无水乙醇，混匀后_80°C放置15-25min，12000g4°C离心lOmin，弃上清； 12)用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置5-10min,晾干，加入RNase-free水或0.5%的SDS溶液20-30 μ I充分溶解，_80°C保存。
【文档编号】C12N15/10GK104313013SQ201410505253
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】杨晓飞, 徐绍刚, 李文通, 袁丁, 杨贵强, 马峻峰 申请人:北京市水产科学研究所