酶促合成咖啡酸甲酯的方法
【专利摘要】酶促合成咖啡酸甲酯的方法，制备步骤为：采用离子液体为反应介质，以脂肪酶为催化剂，由咖啡酸和甲醇在反应介质中通过升温震荡和超声辐射2种反应条件制得。所述的咖啡酸在甲醇中的浓度为0.1～80g/L，咖啡酸在离子液体中的浓度为0.05～10g/L，反应温度为30～90℃，反应时间为0.1～60h，脂肪酶的用量为10～200g/L。该方法反应条件温和，对环境友好，克服了传统的以有机溶剂为反应介质底物溶解度较低的缺点，易于生产得率较高的咖啡酸甲酯。
【专利说明】酶促合成咖啡酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种升温震荡和超声辐射条件下咖啡酸甲酯 的脂肪酶促合成方法。
【背景技术】
[0002] 现有技术：咖啡酸甲酯，英文名称：Methyl caffeate，化学名称：(E)-甲基-3-(3， 4_二轻基）丙烯酸酯，分子式：CltlH ltlO4,分子量：194. 18。
[0003] 近年来，咖啡酸及其衍生物已经被广泛运用到食品、化妆品、保健品和制药 行业中。但由于咖啡酸水溶性强，脂溶性差，无法直接应用于油脂含量较高的食品 中。而咖啡酸烧基酯具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤等药理活性（Archives of Internal Medicine, 2009, 169(7) :708-715)，而且具有较好的脂溶性。其中咖啡酸甲酯是抱茎寥和水 茄提取物中的一类咖啡酸烷基酯，它的分子极性适中，对幼虫发育以及食量具有抑制作用 (Journal of Pest Science, 2013, 86 (3) 579-589)，还具有很强的抗炎、利胆、抗癌、抗氧化、 抗病毒和凝血等功效，而且也可以用于合成天然药物和食品添加剂（如咖啡酸丙酯和咖啡 酸苯乙酯）的中间原料。目前，获得咖啡酸甲酯的方法多为提取法，然而，提取法因受其步 骤繁琐、产率低等因素的限制而无法实现大批量的制备。因此亟需寻找一种天然高效的合 成用于食品以及医药行业的咖啡酸甲酯的方法。
[0004] 已报道的咖啡酸烷基酯的制备方法大都以有机溶剂为反应介质，以传统的酸为催 化剂，在恒温震荡条件下进行酯化或转酯化，其中专利CN103086880A的发明专利公开了一 种以对甲苯磺酸为催化剂合成咖啡酸丙酯的方法。而对于咖啡酸甲酯的合成，Shin等人采 用硫酸催化法催化咖啡酸和甲醇酯化合成咖啡酸甲酯（Biochemical Pharmacology, 2004， 68 (12)，2327-2336)，反应IOh后得率达到71. 0%。专利CN101585770A的发明专利公开了一 种用浓硫酸在微波条件下催化咖啡酸和甲醇反应合成咖啡酸甲酯，反应4min，收率为94%。 也有文献报道（Journal of the Serbian Chemical Society, 2013, 78 (7) :1023-1034)用 对甲苯磺酸催化咖啡酸和甲醇合成咖啡酸甲酯，反应4h后产物得率为84. 0%。然而传统的 酸催化法具有反应时间长、副产物过多、催化剂对设备的腐蚀性强、产品分离过程复杂以及 易挥发出污染环境的气体等缺点（Journal of Molecular Catalysis A:Chemical, 2005, 2 34(1-2) :107-110)。因此，急需寻求出一种在温和条件下能够解决上述技术缺陷的新型、绿 色的反应介质和催化剂。
[0005] 目前在离子液体中酶促酯化和转酯化合成咖啡酸酯类化合物因其反应介质污染 小、反应选择性强、条件温和等优点受到越来越多的关注。本课题组专利CN103088078A的 发明公开了一种用脂肪酶进行转酯化合成咖啡酸丙酯的方法，该方法反应条件温和，对环 境友好，克服了传统的脂肪酶催化合成效率和底物溶解度低的缺点，纯度可达94. 36%，为 咖啡酸甲酯的合成提供了很好的思路。然而，由于咖啡酸甲酯的特殊的结构，利用咖啡酸甲 酯和丙醇转酯化合成咖啡酸丙酯的条件并不适用于咖啡酸甲酯的合成，而且咖啡酸在离子 液体中很难溶解，需要在离子液体中加入咖啡酸的甲醇溶液进行酶促酯化反应合成咖啡酸 甲酯，因此，简单地类推咖啡酸丙酯的合成方法并不适用于咖啡酸甲酯的合成，合成体系需 要重新建立。
[0006] 近几年来，超声辐射的方法因反应条件温和而被用于有机化学合成过程中，它可 以在酶促反应过程中提高传质速率以及底物与酶的接触机会，并且固定化酶在超声波条件 下具有更好的耐热性（Ultrasonics，1992, 30(180-185))，尽管超声辅助还未被广泛的用于 酶促合成反应过程中，但是有报道称它可以被用于植物留醇和酰基供体的酶促酯化反应过 程中（Ultrasonics sonochemistry, 2012, 19 (1015-1020))。因此，超声福射作为一种辅助 条件，有望被越来越多的应用于酶促反应过程中。
[0007] 综上，本发明的目的在于，针对有机溶剂存在污染严重等问题，提供一种绿色高效 的酶促反应体系，其中所采用的离子液体不仅能提高酶促反应的选择性，而且具有较高的 热稳定性、安全可靠 。构建升温震荡和超声辐射方式2种反应条件，这为今后快速制备药物 中间体-咖啡酸甲酯提供理论基础和技术支撑。
【发明内容】
[0008] 解决的技术问题：为解决上述缺陷，本发明旨在提供一种酶促合成咖啡酸甲酯的 方法。该方法操作简便，反应时间短，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克 服传统的脂肪酶催化合成效率和底物溶解度低的缺点，易于生产高纯度咖啡酸甲酯，为推 动其在医药、食品等工业中的广泛应用具有十分重要的意义。
[0009] 技术方案：酶促合成咖啡酸甲酯的方法，制备步骤为：以离子液体为反应介质，月旨 肪酶为催化剂，采用咖啡酸与甲醇反应合成咖啡酸甲酯，所述的咖啡酸在甲醇中的浓度为 0. 1?80g/L，咖啡酸在离子液体中的浓度为0. 05?10g/L，反应温度为30?90°C，反应时 间为0. 1?60h，脂肪酶的用量为10?200g/L，包括升温震荡和超声辐射2种辅助反应条 件。
[0010] 所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，在密封容器中加入离子液体，再加入咖啡酸、甲 醇和脂肪酶，加热振荡反应得到咖啡酸甲酯，振荡器转速为80?140rpm。
[0011] 所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，在密封容器中加入离子液体，再加入咖啡酸、 甲醇和脂肪酶，借助超声波辐射反应得到咖啡酸甲酯，超声频率为5?60kHz，超声功率为 50 ?1000W。
[0012] 所述的离子液体为[Hmim] [HSO4]、[Bmim] [Tf2N]、[Bmim] [PF6]、[Bmin] [BF4]、 [Emim] [TfOH]、[Toma] Cl、[Toma] [Tf2N]或[Omim] [BF4]。
[0013] 所述脂肪酶为 Novozym435、Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM。
[0014] 有益效果：在酶促合成咖啡酸甲酯的体系中选择合适的离子液体作为反应介质来 强化合成效率，并且借助超声辐射的方法，将反应时间由传统的36h缩短为9h，该方法反应 条件温和，反应时间短，对环境友好，克服了传统的以有机溶剂为反应介质底物溶解度较低 的缺点，易于生产高纯度的咖啡酸甲酯。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无 环境污染，具有非常良好的工业应用前景，可以满足迅速发展的食品业的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为酶促酯化合成咖啡酸甲酯的反应式。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0017] 检测咖啡酸甲酯的高效液相色谱条件为：采用250mmX4. 6mm的AlltimaTM C18柱， 流动相为甲醇：水（V :V) = 65:35,流速为lmL/min，柱温为30°C，检测波长为325nm，进样量 为 20 μ L。100%
[0018] 其中，产物咖啡酸甲酯的得率计算方法为：
[0019]
【权利要求】
1. 酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于制备步骤为：以离子液体为反应介质，月旨 肪酶为催化剂，采用咖啡酸与甲醇反应合成咖啡酸甲酯，所述的咖啡酸在甲醇中的浓度为 0. 1?80g/L，咖啡酸在离子液体中的浓度为0. 05?10g/L，反应温度为30?90°C，反应时 间为0. 1?60h，脂肪酶的用量为10?200g/L，包括升温震荡和超声辐射2种辅助反应条 件。
2. 如权利要求1所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：在密封容器中加入离 子液体，再加入咖啡酸、甲醇和脂肪酶，加热振荡反应得到咖啡酸甲酯，振荡器转速为80? 140rpm〇
3. 如权利要求1所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：在密封容器中加入离 子液体，再加入咖啡酸、甲醇和脂肪酶，超声波辐射反应得到咖啡酸甲酯，超声频率为5? 60kHz，超声功率为50?1000W。
4. 如权利要求1?3任一所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于所述的离子液 体为[Hmim][HS04]、[Bmim][Tf 2N]、[Bmim][PF6]、[Bmin][BF4]、[Emim][TfOH]、[Toma]Cl、 [Toma] [Tf2N]或[Omim] [BF4]。
5. 如权利要求1?3任一所述酶促合成咖啡酸甲酯的方法，其特征在于：脂肪酶为 Novozym435> Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM〇
【文档编号】C12P7/62GK104278060SQ201410507607
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】王俊, 王纱纱, 黎忠健, 盛晟, 吴福安 申请人:江苏科技大学