链霉菌菌株及其防治黄瓜枯萎病联合应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了链霉菌菌株及其防治黄瓜枯萎病联合应用，涉及微生物【技术领域】，本发明所述的放线菌是从浙江西溪湿地植物根际采集的土样中采用放线菌分离技术分离获得的，经微生物分类学鉴定，命名为白色链霉菌（ Streptomyces albus ）2013和暗黑链霉菌（ Streptomyces tenebrarius ）M929， S.albus 2013已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013269； S.tenebrarius M929已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2013710。两菌株均能发酵产生对黄瓜枯萎病菌（ Fusarium oxysporum f.sp. cucumebrium ）具有较强拮抗作用的活性物质，可用于防治黄瓜枯萎病害。两菌株的发酵产物按重量百分比为3:2—1:1混合制成混合制剂时，防治黄瓜枯萎病病原菌的效果较两者分别作为单一制剂使用时更为显著。CCTCC NO: M 20132692013.06.19CCTCC NO: M 20137102013.12.25
【专利说明】链霉菌菌株及其防治黄瓜枯萎病联合应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物【技术领域】，涉及两株生防放线菌一白色链霉菌2013和暗黑链 霉菌M929代谢产物在防治黄瓜枯萎病中的应用。 技术背景
[0002] 黄瓜枯萎病，又名萎蔫病、死秧病，是黄瓜病害中最为严重、造成经济损失最大的 病害之一。近年来黄瓜枯萎病的发生逐年加重，一般可导致黄瓜产量减少10%~20%，病情严 重时损失达70%以上，给生产造成巨大损失。
[0003] 黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型〇以5/7〇/--f.sp. 该病菌在土壤、病株残体及未腐熟的农家肥中或附着在种子上越冬，成为翌 年初侵染源。病原菌从根部伤口和根毛生长点侵入植株，进而破坏其根、茎和叶的维管束， 使黄瓜植株吸收和运输水分功能丧失，最终造成黄瓜植株枯萎死亡。针对黄瓜枯萎病害目 前主要采用化学农药杀灭病原菌，但化学防治导致农药残留、环境污染及抗药性等一系列 问题。因此，生物防治引起人们的重视。目前有研究表明植物提取物中的活性成分对有一定 的抑制作用，但植物有效成分提取操作步骤多，效率低(贾俊英，中国农学通报，2014 ;郑成 锐，中国园艺文摘，2011 ;李杰，科技导报，2014);已报道采用芽孢杆菌作为生防菌防治黄瓜 枯萎病病害的发生，由于该菌株对病原菌的抑制作用不强，故生防效果并不理想(韦巧婕， 南京农业大学学报，2013;卜春亚，中国农学通报，2013)。放线菌因其易产生抗病原菌成分 等活性物质，已成为生物防治植物病虫害的主要资源和生物农药开发的主要来源。土壤是 放线菌栖居的重要场所，从土壤中获得具有高效抗菌活性的放线菌是目前世界范围内研制 开发新医药和新农药必不可少的基础工作。从土壤中筛选拮抗放线菌对黄瓜枯萎病原菌的 生物防治已有不少报道，但大多集中在用单一拮抗放线菌的发酵产物防治黄瓜枯萎病，治 疗和预防效果并不显著。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过筛选提供对黄瓜枯萎病 原菌具有较强拮抗作用的两株生防菌一白色链霉菌2013和暗黑链霉菌M929。
[0005] 本发明的第二个目的是通过不同的比例混合两株生防链霉菌的发酵产物，提供上 述白色链霉菌和暗黑链霉菌在黄瓜枯萎病防治中的联合应用。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术手段得以实现： 本发明首先以在浙江西溪湿地植物根际采集的土样为研究对象，经分离、发酵培养、 发酵液提取以及对植物病原真菌抑制活性检测等步骤获得两株对黄瓜枯萎病原菌具有较 强抑菌活性的链霉菌；其中一株经微生物分类学鉴定并命名为白色链霉菌 <3^^5)2013。该菌已于2013年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为： CCTCCNO:M2013269;另一株经微生物分类学鉴定并命名为暗黑链霉菌(泣 该菌已于2013年12月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏 编号为CCTCCNO:M2013710。中国典型培养物保藏中心地址：武汉市武昌珞珈山，邮编： 430072。
[0007] 本发明所述的白色链霉菌(泣a/tos) 2013在PDA固体培养基上培养 时气丝白色，基丝地衣状，乳脂色。显微观察发现a从ys2013孢子丝螺旋形， 孢子球形至卵圆形，表面光滑。本发明所述的aWws2013,发酵液经提取浓 缩后可对黄瓜枯萎病病原真菌具有较强的抑制作用。
[0008] 本发明所述的暗黑链霉菌M929在PDA固体培养 基上培养时气丝暗鼠灰色，基丝地衣状，黑色。显微观察发现 M929孢子丝敞圈，孢子球形至卵圆形，表面光滑。本发明所述的teflefo-ariysM929,发酵液经提取浓缩后可对黄瓜枯萎病病原真菌具有较强的抑制作用。 [0009] 所述的黄瓜枯萎病原菌拮抗放线菌的筛选和抑菌活性检测过程如下所述： (1) 从野外(浙江省西溪湿地植物根际）采集土样，并进行晾干处理； (2) 从土样中分离放线菌，并利用黄瓜枯萎病原菌作为指示菌筛选具有拮抗作用的放 线菌； (3) 将长出的放线菌分别点种于混有黄瓜枯萎病原菌孢子悬液（1X106 的 PDA平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进入复筛； (4) 将选取的菌株进行发酵培养，发酵结束后离心收集发酵液，用乙酸乙酯萃取，真空 减压浓缩后制备浸膏，用于黄瓜枯萎病的防效检测，由此筛选出防治效果较好的两株拮抗 微生物一白色链霉菌2013和暗黑链霉菌M929。
[0010] 本发明的有益效果： 本发明从土壤中分离筛选出对黄瓜枯萎病原菌具有较强抑制作用的两株拮抗链霉菌a/tos2013和M929,两株菌株的发酵产物按重 量百分比为3:2 -1:1制成的混合制剂可用于黄瓜枯萎病病害的防治，为生物农药的开发 提供了新的途径。
[0011]
【具体实施方式】
[0012]实施例 1 : (5'tr<9/7^9?_7c<9>s 2013 和 M929 的分 离与筛选） 按以下步骤进行： (1) 材料及培养基：用于分离白色链霉菌2013和暗黑链霉菌M929的材料为采自浙江 西溪湿地植物根际的土样，用于放线菌分离所用的培养基为含重铬酸钾的PDA培养基(配 方为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加蒸馏水1L煮沸半小时，纱布过滤，再加20g葡 糖糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121°C，高压灭菌 20min;使用时添加重铬酸钾20iig?ml/1;以下试验中放线菌常规培养所用培养基均以蒸 馏水配置）； (2) 分离纯化：将上述新鲜采集的土样装于采样袋中，带回实验室后分装晾干一周左 右；瞭干后的土样每份称取5g，分别加入含有45ml无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入3-5 粒无菌的玻璃珠，28°C摇床培养2h，使土样中的微生物充分进入水中；吸取培养后的样品 以10倍梯度稀释，分别取1(T2、10' 1(T4浓度稀释液200i!L，涂布于含20i!g?ml/1重铬酸 钾的PDA固体平板上，28°C培养72h;将平板上长出的放线菌分别挑取单菌落，接种于含重 铬酸钾的新鲜PDA平板上，28°C± 1°C条件下纯化培养72h，获得纯化后的放线菌； (3)初筛和复筛：将分离得到的放线菌分别点种于混有黄瓜枯萎病原菌孢子悬液 (1X106cfu^!/1)的PDA固体平板上，通过观察抑菌圈大小，挑选抑菌圈较明显的菌株进行 复筛； 复筛采用平板对峙法对初筛的放线菌进行抑菌活性测定，具体方法为：在PDA固体平 板上分别对称放置一个直径4_的放线菌菌饼和一个黄瓜枯萎病原菌菌饼，置培养箱中 28°C ±1°C条件下培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直 径。抑菌率通过以下公式计算： 抑菌率（%) = (1-处理菌落生长半径/对照菌落生长半径）X100 根据结果获得抑菌活性较好的两株放线菌，对黄瓜枯萎病原菌的抑菌率均在70%以 上。综合16SrDNA序列的比对结果、形态特征、培养特征和生理生化特性，其中一株菌株鉴 定为白色链霉菌，命名为白色链霉菌2013 2013);另一株菌株鉴定 为暗黑链霉菌，命名为暗黑链霉菌M929 M929);保存。
[0013] (4)Streptomyces albus2013 和 M929 抑菌 活性测定：将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的Streptomyces albus M929 按 5% (v/v)分别接入发酵培养基中，28°C±1°C条件 下，180r/min，摇床培养120h后，7800r/min离心7min,用滤纸过滤得发酵滤液。取经 0. 22ym膜过滤的发酵上清液lmL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅 速混勻，冷却后在每个培养基平面中央分别放1个直径为4mm的黄瓜枯萎病菌 f. sp. 菌饼，置培养箱中28°C培养72h，以无菌水处理作为对照， 重复3次；待对照菌落直径长至平板直径的2/3左右时统计结果，采用十字交叉法测定菌落 直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)] X 100 测定结果表明Jtr印a/tos2013 和 M929 代谢 产物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长抑制率分别为73. 4%和71.7%。
[0014]实施例2 : 2013和 M929发酵 代谢产物的制备方法） 按以下步骤进行： (1)菌种的活化培养：将保存的a/tos 2013和 teflefo-ariys M929孢子悬液（1 X 108 cfu?ml/1)接入马铃薯葡萄糖液体培养基，在 28°C ±1°C条件下培养48h供发酵使用； (2) 发酵培养：发酵培养基每1L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g， 葡萄糖5g，蛋白胨5g，CoCl2 0. 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装 发酵培养液50mL ;配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的 5^/'<9/7(〇?/^<951<3从^5 2013和5^/'(9/7(〇?/^(9>5((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929 分别按5%(>八）接入发酵 培养基中，在28°c±1°C条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3) 发酵物提取：发酵完毕，离心，弃菌体，收集发酵液于分液漏斗中，将加入等体积的 乙酸乙酯萃取，充分混匀，待分层后，取上层液相至圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪浓缩后获得 萃取物浸膏，用于测定抑菌活性。
[0015] 以下实施例3和试验例中所述的Stre/?(officesa/tos2013和Stre/?(offices tefldrariMM929代谢产物均为实施例2所制产品；所述产品的百分含量均为质量/体积 百分比。
[0016] 实施例 3 : 2013 和 M929 代谢 产物对黄瓜枯萎病菌的抑制作用） (1) 分别准确称取Str印a/tos2013 和 M929 代 谢产物0.lg，并加入10mL体积的无菌水，超声波震荡充分溶解，分别配置终浓度为10g/L 的母液； (2) 抑菌活性测定：取上述母液分别稀释成浓度为lg/L和0. 5g/L的溶液，取各浓度溶 液lmL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50°C的PDA培养基迅速混勻a/Zws2013 和 M929 代谢产物终浓度分别均为 0.lg/L和 0. 05g/L), 冷却后在每个培养基平面分别放1个直径为4mm的黄瓜枯萎病菌菌饼，菌饼接于培养皿中 央（培养皿直径为9cm)，置培养箱中28°C培养36h，以常规化学药剂和无菌水处理作为对 照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，以下列公式计算抑制率： 菌丝生长抑制率（％)=[(对照菌落直径-处理菌落直径）/(对照菌落直径-4)]X100 试验例：(本发明产品与常规农药防治效果对比试验） 试验结果见表1。从表1看出，Str印(officesa/tos2013和 M929代谢产物抑制黄瓜枯萎病菌效果较常规化学药剂相当，当两菌株的发酵 产物按重量百分比为3:2-1:1混合时，防治黄瓜枯萎病原菌的效果较两者分别作为单一 制剂使用时更为显著。
[0017] 表 1 2013 和 M929 代谢产物对 供试的黄瓜枯萎病原菌的抑制效果及比较
【权利要求】
1. 一种链霉菌菌株，其特征在于：菌株2013分类命名为白色链霉菌 W/ws) 2013,保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日：2013年6月19日，保藏登记号 为CCTCC NO: M 2013269;另一种链霉菌菌株M929,其特征在于：菌株M929分类命名为暗黑 链霉菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日： 2013年12月25日，保藏登记号为CCTCC NO: M 2013710。
2. -种如权利要求1所述的链霉菌菌株的应用，其特征在于：所述的白色链霉菌 2013和暗黑链霉菌M929均能发酵产生对黄瓜枯萎病菌f. sp. cwc應具有较强拮抗作用的活性物质，可防治黄瓜枯萎病病害，龟裂链霉菌2013和 M929两者的代谢产物重量百分比为3:2 -1:1时，效果显著。
3. 权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的白色链霉菌2013和M929两者的代谢 产物的制备方法如下： (1) 将分离得到的白色链霉菌2013和暗黑链霉菌M929涂布于甘露醇黄豆饼粉制成的 MS平板上，收集孢子接种于发酵培养基； (2) 发酵培养基为每1 L中含有黄豆饼粉10g，玉米粉4g，可溶性淀粉20g，葡萄糖5g，蛋 白胨5g，C〇Cl2 0? 02g，牛肉膏5g，CaC03 5g，酵母膏5g，每300mL三角瓶装发酵培养液50mL ; 配制后121°C灭菌20min，将利用马铃薯葡萄糖液体培养基培养好的a/Zws 2013和5^/'<9/7(〇?/^<951((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929分别按5%(>八)接入发酵培养基中，在28°〇±1°〇 条件下，摇床转速180 r/min，发酵培养84 h; (3) 发酵结束后离心收集发酵液，加入等体积的乙酸乙酯，充分震荡混匀，取上层，在真 空条件下浓缩至浸膏； (4) 混合制剂配制：将5^/'<9/7(〇?/^<951<3从^5 2013和5^/'(9/7(〇?/^(9>5((9/7(9^/'<3/'/^5]\1929 代谢产物用水溶解，混合，配成终浓度为〇. 〇6g/L泣聊CM W/ws 2013代谢产物和 0. 04g/L (<9/?<9^rari05^929 代谢产物混合配方制剂。
【文档编号】C12R1/465GK104342389SQ201410509460
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】马正, 俞晓平, 路丹丹, 罗帅, 边亚琳, 许益鹏, 王正亮, 申屠旭萍 申请人:中国计量学院