基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒。该方法包括构建pPTD-NLS-Cas9；体外表达、纯化并获得PTD-NLS-Cas9融合蛋白；将其与向导RNA共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；将PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使其进入靶细胞进行目的基因的定向敲除。该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定位机制，实现Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有技术中Cas9核酸内切酶难以导入靶细胞的技术问题。
【专利说明】基因组靶标目的基因的定向敲除的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种基因组靶标目的基因的定向敲除 的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。目前，锌核酸酶 (ZFN)技术和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN)技术被广泛应用于基因定向修饰，但 是这些技术操作过程复杂，成本高，技术难度较大，而且受到表观遗传修饰的限制，无法同 时针对同一细胞中的多个位点进行靶向敲除，因此，亟待开发更加高效、廉价并且简单的基 因打靶技术。
[0003] CRISPR(成簇规律性间隔短回文重复序列）是一类特殊的DNA重复序列家族。 CRISPR是细菌和古生菌为应对病毒和核酸不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制，广泛 存在于众多原核生物基因中。其中，第二类CRISPR/Cas系统依赖Cas9核酸内切酶靶向和 剪切外源DNA。因此，CRISPR/Cas系统逐渐成为另一个基因组改造的方法。
[0004] 在这一系统中，crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与 tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成向导RNA，向导RNA指导Cas9 蛋白在crRNA引 导序列靶定位点剪切双链DNA，通过诱导细胞自身DNA修复机制，在细胞基因组中进行基因 敲除。
[0005] 另外，研究表明，多个向导RNA可指导Cas9蛋白实现同时对哺乳动物细胞、人干细 胞、酵母等基因组中多位点的瞬时剪切。但是，相关及时中，该系统涉及到多个质粒或分子 量很大的质粒的转染，转染效率低，特别是针对难转染的细胞系、干细胞、处于静息期的细 胞等，转染效率及基因敲除效率更低。可见，如何将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效 的导入靶细胞中成为影响基因组靶向修饰效率的重要因素；因此，提供一种能够快速、高效 将Cas9核酸内切酶和向导RNA导入靶细胞中并进行细胞基因组靶标目的基因的定向敲除 的方法是人们亟待解决的一个技术问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，以解决上述的技 术问题。
[0007] 在本发明的实施例中提供了一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以 下步骤：
[0008] 1)、构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体pPTD-NLS ; 并利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接，得到连接产 物pPTD-NLS-Cas9 ;
[0009] 2)、将所述连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、 NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将所述包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组 质粒阳性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白；
[0010]3)、将所述PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的 向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；
[0011]4)、将所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得所述PTD-NLS-Cas9/ RNA复合物进入所述靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除；
[0012] 本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，实现了PTD-NLS_Cas9 融合蛋白的获取，其中，PTD为蛋白转导结构域：是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方 式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，也称为细胞穿膜肽；可以有效地将多种物质，包括亲水 性蛋白、多肽、DNA、RNA甚至颗粒性物质等在短时间内输送到细胞内，且不受细胞类型的限 制。而NLS为细胞核定位结构域可以实现所携带的大分子物质定位在细胞核的效果。
[0013] 进一步的，再将PTD-NLS_Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互 补结合的向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物同时包含了 PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA;在PTD-NLS(蛋白转导结构域和细胞核定位结构域）的 作用下，可以实现将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞细胞核的效果；另 夕卜，向导RNA能够与目的基因互补结合，进而指导该复合物定向结合，并且通过Cas9实现定 向剪切目的基因上的双链靶标片段的效果，最后通过靶细胞的自身DNA修复功能中的非同 源末端连接功能，实现靶细胞基因组的高效定点靶向敲除的效果。
[0014] 本发明实施例提供的这种方法，通过体外表达并纯化得到PTD-NLS_Cas9融合蛋 白，再将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物； 该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定位机制，以实现Cas9核酸内 切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有技术中Cas9核酸内切酶难 以导入靶细胞的技术问题。可以很好的应用到针对肿瘤相关致癌基因、整合在细胞染色体 上的病毒基因组等进行特异性的靶向敲除的实际操作中，为肿瘤、病毒治疗等方面提供更 为便捷高效的实践指导方法。
[0015] 可选的，在步骤1)中，具体包括：
[0016] 将编码PTD和NLS的引物进行退火，得到双链DNA，并将所述双链DNA插入到出发 载体中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS;
[0017] 在全长Cas9DNA片段的5'和3'端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性内 切酶消化所述Cas9DNA片段和所述重组载体pPTD-NLS后，用T4DNA连接酶进行连接，得到 体外表达重组质粒pPID-NLS-Cas9。
[0018] 或，在全长Cas9DNA片段两端加入体外重组酶识别位点，利用体外重组系统将全 长Cas9DNA片段插入重组载体pPTD-NLS，得到体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9。
[0019] 可选的，在步骤1)中，编码PTD和NLS的所述引物的序列如SEQIDNo. 1和SEQ IDNo. 2所示。
[0020] 可选的，所述蛋白转导结构域PTD为能够携带大分子物质进行细胞的多肽；所述 细胞核定位结构域NLS为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。
[0021] 可选的，在步骤2)中，所述体外诱导表达采用原核体外表达菌株或真核体外表达 细胞。
[0022] 可选的，在步骤3)中，所述向导RNA的制备方法包括：将向导RNA的表达序列克隆 到克隆载体中，得到重组克隆载体；以所述重组克隆载体为模板，进行体外转录，得到向导RNA。
[0023] 可选的，在步骤4)中，所述靶细胞来源为真核细胞。
[0024] 可选的，在步骤4)中，所述目的基因的靶标片段的一条链具有如下结构： 5' -Nx-NGG-3'，其中，N为A、T、G和C中的任一种，19彡X彡30。
[0025] 实现上述方法的基因组靶标目的基因的定向敲除的试剂盒。
[0026] 可选的，该试剂盒包括：
[0027]Cas9核酸内切酶的编码基因；带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9 核酸内切酶的编码基因；
[0028] 含有Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；含有带有蛋白转导结构域和 细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；
[0029] 经体外表达并纯化后的具有蛋白转导功能及细胞核定位功能的Cas9核酸内切 酶；
[0030] 含有依次由启动子、两种或多种限制性内切酶特异性识别位点和向导RNA片段的 编码DNA依次连接而成的DNA片段的重组克隆载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0032] 图1为本发明实施例一提供的基因组靶标目的基因的定向敲除的方法流程示意 图；
[0033] 图2为本发明实施例二提供的PTD-NLS_Cas9融合蛋白的体外表达纯化结果和 western-blot结果图；
[0034] 图3为本发明实施例二提供的PTD-NLS_Cas9/RNA复合物的体外酶切活性验证结 果图；
[0035] 图4为本发明实施例二提供的TATPTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物进入293T细胞 免疫荧光结果图；
[0036] 图5为本发明实施例二提供的TATPTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物对于293T细胞 染色体上hEmxl基因的敲除结果图。
【具体实施方式】
[0037] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行 清楚、完整的描述，基于本发明中的【具体实施方式】，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0038] 实施例一
[0039] 请参考图1，本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以下 步骤：
[0040] 步骤101 :构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体 pPTD-NLS;并利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接， 得到连接产物pPID-NLS-Cas9 ;
[0041] 在步骤101中，通过定制合成的根据大肠杆菌密码子优化后的编码蛋白转导结构 域和细胞核定位结构域的DNA引物，退火形成DNA双链并将其插入到出发体外表达载体中， 进而构建出重组表达载体PPID-NLS。
[0042] 重组表达载体pPTD-NLS在T4DNA连接酶的作用下能够与Cas9DNA片段连接，进而 获得连接产物；以备后续的转化以及体外表达所用。
[0043] 步骤102:将连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、 NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒 阳性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白；
[0044] 具体的，在步骤102中，将连接产物先转化到大肠杆菌中实现重组质粒的扩增，通 过将转化后的大肠杆菌进行质粒抽提、酶切鉴定后，获得所需的PPTD-NLS-Cas9阳性克隆。
[0045] 获得的pPTD-NLS_Cas9阳性克隆再转入原核体外表达菌株或真核体外表达细胞 进行体外表达和纯化进而可获得能够与向导RNA结合的PTD-NLS-Cas9融合蛋白，表达和纯 化的步骤按照常规操作进行即可。
[0046] 步骤103:将PTD-NLS_Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的 向导RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；
[0047] 在步骤103中，纯化后的PTD-NLS_Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因 互补结合的向导RNA进行共孵育，进而获得PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物具备快速、 高效进入靶细胞的细胞核效果，而且所含的Cas9核酸内切酶具备定向剪切的效果。
[0048] 步骤104 :将PTD-NLS_Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得PTD-NLS_Cas9/RNA 复合物进入靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除。
[0049]PTD-NLS_Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育（孵育时间和其他工艺条件根据实际 孵育效果设定）后，即可实现基因组靶标目的基因定向敲除的效果。
[0050] 本发明提供的这种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，实现了PTD-NLS_Cas9 融合蛋白的获取，其中，PTD为蛋白转导结构域；可以有效地将多种物质，包括亲水性蛋白、 多肽、DNA、RNA甚至颗粒性物质等在短时间内输送到细胞内，且不受细胞类型的限制；而 NLS为细胞核定位结构域可以实现所携带的大分子物质定位在细胞核的效果。
[0051]PID-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导RNA进 行共孵育后，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；由于该复合物同时包含了PTD-NLS-Cas9融合 蛋白和向导RNA;在PTD-NLS(蛋白转导结构域和细胞核定位结构域）的作用下，可以实现 将Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞细胞核的效果。向导RNA能够与目 的基因互补结合，进而指导该复合物定定向结合，并且通过Cas9实现定向剪切目的基因上 的双链靶标片段的效果，最后通过靶细胞的自身DNA修复功能中的非同源末端连接功能， 实现靶细胞基因组的高效定点靶向敲除的效果。
[0052] 简而言之，本发明实施例提供的这种方法，通过体外表达并纯化得到 PTD-NLS-Cas9融合蛋白，再将PTD-NLS-Cas9融合蛋白和向导RNA进行共孵育，得到 PTD-NLS-Cas9/RNA复合物；该复合物利用蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的穿膜定 位机制，以实现Cas9核酸内切酶和向导RNA快速、高效的导入靶细胞中的效果；克服了现有 技术中Cas9核酸内切酶难以导入靶细胞的技术问题。可以很好的应用到针对肿瘤相关致 癌基因、整合在细胞染色体上的病毒基因组等进行特异性的靶向敲除的实际操作中，为肿 瘤、病毒治疗等方面提供更为便捷高效的实践指导方法。
[0053] 为了使得本发明上述实施例的基因组靶标目的基因的定向敲除的方法得到更好 的应用，更加有效地应用到目的基因的修饰领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提 供了实施例二，实施例二给是上述实施例的方法的进一步限定和增加，现做详细的阐述和 解释：
[0054] 实施例二
[0055] 在本实施例中，基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，包括以下步骤：
[0056]S1:将编码蛋白转导结构域（PTD)和细胞核定位结构域（NLS)的引物进行退火，得 到双链DNA，并将双链DNA插入到出发载体中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS;[0057] 优选的，编码蛋白转导结构域PTD和细胞核定位结构域NLS的引物的序列如SEQ IDNo. 1 和SEQIDNo. 2所示。
[0058] 另外，蛋白转导结构域为能够携带大分子物质进行细胞的多肽；细胞核定位结构 域为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。在本实施例中，优选的蛋白转导结构域 为TAT蛋白转导结构域，优选的细胞核定位结构域为SV40细胞核定位结构域。
[0059]需要指出的是，在进一步的技术方案中，除了上述所举的蛋白转导结构域和细胞 核定位结构域外，蛋白转导结构域还可以包括：天然存在的PTD和人工合成的PTD;具体的， 天然PTD含有大量的精氨酸、赖氨酸残基，且含有一个高度正电荷区和一个螺旋结构，典型 的有HIV-1病毒的TAT结构域、Antp、B型肝炎病毒蛋白PreS2和纯疱疹病毒转录调节蛋 白（VP22)等；人工合成的PTD包括Transportan、MPG、细胞质转导肽CTP，RGD、iRGD、MPP、 ACPP、NGR、AMP、CREKA肽、CLT1 肽、CLT2 肽等。
[0060] 细胞核定位结构域还可以包括：病毒SV40的大T抗原、H2B、v-Jun、NIN2、RB、SWI5、 Pho4、rpL25、rpL23a、HnRNP和PTHrP等蛋白中的细胞核定位结构域。
[0061] 并且，在本发明中，对于蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的种类，并不限于以 上所举出的实例，只要满足能够携带大分子物质进入细胞的任一短肽均可作为蛋白转导结 构域；而能携带大分子物质实现细胞核定位功能的任一肽段均可作为细胞核定位结构域。
[0062]S2 :在全长Cas9DNA片段的5'和3'端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性 内切酶消化Cas9DNA片段和重组载体pET-TATPTD-SV40NLS后，用T4DNA连接酶进行连接， 得到连接产物（体外表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9)。
[0063] 其中，全长Cas9DNA片段按照Cas9基因全序列，经原核密码子优化后，以分段合 成、退火、连接的方式获得。
[0064]S3 :将连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、酶切鉴定后获得pET-TAT PTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆；将pET-TATPTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆转入原核体外表达 菌株中，体外表达后纯化，得到TATPTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白；
[0065] 其中，pET-TATPTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆的获取与步骤102 -致，在此不作赘 述，只是将PTD-NLS具体限定为TAT-SV40。而获得的pET-TATPTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆 除含有载体PET和全长Cas9所有序列外，还有一个带有6个组蛋白标签的序列、一个编码 蛋白转导结构域TAT和一个细胞核定位结构域SV40NLS。
[0066] TATPTD-SV40NLS_Cas9融合蛋白体外表达和纯化的具体操作优选按照以下操作 进行：
[0067]a)将获得的阳性克隆pET-TATPTD-SV40NLS_Cas9转化到大肠杆菌表达菌株中， 37 °C培养过夜后形成单菌落；
[0068]b)挑取一个单菌落于少量液体培养基中，37°C，200rpm震荡过夜培养后，再移入 大体积液体培养基中，大规模培养，37°C，200rpm震荡培养至0D_到达0. 6左右；
[0069]c)将温度调至10-25°C培养并加入一定量的IPTG，200rpm震荡诱导过夜；
[0070]d)离心收集菌体后加入一定量冷的裂解液，并加入一定量的蛋白酶抑制剂混合 液；
[0071]e)用细胞超声破碎法破碎菌体细胞；
[0072] f)用高速冷冻离心机，4°C，48000Xg条件下离心30min后收集上清于；
[0073]g)加入 5〇% 的Ni-NTAagarosebeads(qiagen公司），4°C条件下震荡孵育2_3h;
[0074]h)上分离柱收集Ni-NTAagarosebeads,并用5-10倍柱体积的裂解液清洗； [0075]i)使用含有不同咪唑浓度的洗脱液洗脱，收集洗脱液并用SDS-PAGE检测含有蛋 白转导和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶蛋白的表达状况及其纯度；
[0076] 另外，将纯化得到的蛋白进一步使用His_Tag(2A8)MousemAb进行western-blot 验证其是否为带有his融合标签的Cas9核酸内切酶蛋白；结果如图2所示；
[0077] 在图2中，a结果表明所构建的pET-TATPTD-SV40NLS-Cas9阳性克隆可在大肠杆 菌表达菌中大量表达获得150kD左右的蛋白。b是表达得到的TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合 蛋白的western-blot结果，证实该蛋白带有his融合标签，故为TAT-PTD-SV40NLS-Cas9核 酸内切酶融合蛋白。
[0078]SEQIDNo. 3示出了含有蛋白转导和细胞核定位结构域的Cas9核酸内切酶蛋白 (TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白）的氨基酸序列。
[0079]S4:将向导RNA的表达序列克隆到克隆载体中；得到重组克隆载体；以重组克隆载 体为模板，进行体外转录，得到向导RNA;
[0080] 具体的，在该步骤中，举出了靶向人源Emx1基因的向导RNA具体设计、构建以及体 外转录的操作，包括以下两个方面：
[0081]A、含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体的构建步骤：
[0082] 1、按5'-Nx-NGG_3'的原则设计带有hEmxl靶标片段及骨架RNA编码基因，并按照 分段合成、退火、连接的方式获得带有限制性酶切位点粘性末端的hEmxlgRNA全长序列；其 中，SEQIDNo. 4中第53 - 160位核苷酸序列所示是编码hEmxlgRNA的全长序列；
[0083] 2、将获得的带有粘性末端的hEmxl靶标片段和骨架RNA的编码基因序列插 入到带有17启动子的出发克隆载体中，构建含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体 pET-gRNA-hEmxl；
[0084]B、含有向导RNA的表达盒的重组克隆载体pET-gRNA-hEmxl的体外转录具体步 骤：
[0085]1、将重组克隆载体pET-gRNA-hEmxl使用合适的限制性内切酶酶切形成线性化质 粒；
[0086] 2、以形成的线性化质粒pET-gRNA-hEmxl作为体外转录模板，利用Riboprobe? System一I7Kit体外转录试剂盒体外转录出向导RNA，命名为hEmxl_gRNA(即向导RNA)。
[0087]S5:将TAT-PTD-SV40NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结 合的向导RNA进行共孵育，得到TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物。
[0088] 该步骤实现了TAT-PTD-SV40NLS-Cas9/RNA复合物的制备过程，具体的，为了 检测其是否具有高效迅速仅进入靶细胞，且是否具有体外酶切活性的效果，本实施例将 PTD-NLS-Cas9融合蛋白（TATPTD-SV40NLS-Cas9核酸内切酶融合蛋白）与向导RNA形成的 复合物的体外酶切酶活验证实验具体步骤如下：
[0089](1)、将体外转录得到的hEmxl-gRNA(向导RNA)重新变性退火；
[0090](2)、在hEmxl祀标片段的上下游设计和合成一对引物hEmxl-F和hEmxl-R(弓丨物 序列SEQIDNo. 5和SEQIDNo. 6)，以293T细胞genomicDNA为模板，PCR并柱回收获得 一段包含靶标片段的hEmxl基因片段；
[0091] (3)、取5个1.51111￡?管，分别标记为4、8、(：、03;各管按照表1分别加入一定量 相应溶液；
[0092] 表1不同组成的混合物
[0093]
【权利要求】
1. 一种基因组靶标目的基因的定向敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、构建包含蛋白转导结构域PTD、细胞核定位结构域NLS的重组载体pPTD-NLS ;并 利用限制性酶切连接或体外重组方法将重组载体与Cas9DNA片段进行连接，得到连接产物 pPTD-NLS-Cas9 ； 2) 、将所述连接产物转化到大肠杆菌中，并进行质粒抽提、鉴定后获得包含PTD、NLS和 Cas9的体外表达重组质粒阳性克隆；将所述包含PTD、NLS和Cas9的体外表达重组质粒阳 性克隆在体外诱导表达，表达的蛋白经纯化后，得到PTD-NLS-Cas9融合蛋白； 3) 、将所述PTD-NLS-Cas9融合蛋白和能够与待敲除的靶标目的基因互补结合的向导 RNA进行共孵育，得到PTD-NLS-Cas9/RNA复合物； 4) 、将所述PTD-NLS-Cas9/RNA复合物与靶细胞共孵育，使得所述PTD-NLS-Cas9/RNA复 合物进入所述靶细胞，与细胞核定位，并进行目的基因的定向敲除。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，具体包括： 将编码PTD和NLS的引物进行退火，得到双链DNA，并将所述双链DNA插入到出发载体 中，得到包含PTD、NLS的重组载体pPTD-NLS ; 在全长Cas9DNA片段的5'和3'端加入2个限制性内切酶位点，并利用限制性内切酶 消化所述Cas9DNA片段和所述重组载体pPTD-NLS后，用T4DNA连接酶进行连接，得到体外 表达重组质粒pPTD-NLS-Cas9。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，编码PTD和NLS的所述引物 的序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白转导结构域PTD为能够携带大分 子物质进行细胞的多肽； 所述细胞核定位结构域NLS为能够携带大分子物质实现细胞核定位的肽段。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述体外诱导表达采用原核 表达菌株或真核表达细胞。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述向导RNA的制备方法包 括： 将向导RNA的表达序列克隆到克隆载体中，得到重组克隆载体；以所述重组克隆载体 为模板，进行体外转录，得到向导RNA。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述靶细胞来源为真核细 胞。
8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，所述目的基因的靶 标片段的一条链具有如下结构： 5' -Nx-NGG-3'，其中，N为A、T、G和C中的任一种，19彡X彡30。
9. 一种实现根据权利要求1所述的方法的基因组靶标目的基因的定向敲除的试剂盒。
10. 根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括： Cas9核酸内切酶的编码基因；带有蛋白转导结构域和细胞核定位结构域的Cas9核酸 内切酶的编码基因； 含有Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体；含有带有蛋白转导结构域和细胞 核定位结构域的Cas9核酸内切酶的编码基因的重组表达载体； 经体外表达并纯化后的具有蛋白转导功能及细胞核定位功能的Cas9核酸内切酶； 含有依次由启动子、两种或多种限制性内切酶特异性识别位点和向导RNA片段的编码 DNA依次连接而成的DNA片段的重组克隆载体。
【文档编号】C12N15/66GK104328138SQ201410520023
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】陈静 申请人:上海缔达生物科技有限公司