一种检测山羊dqa1基因外显子4的单核苷酸多态性的引物及方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测山羊免疫相关基因DQA1基因的单核苷酸多态性的引物及方法，引物由上游引物和下游引物组成，检测时以山羊基因组DNA为模板，利用上、下游引物进行PCR反应扩增目的片段，用变性剂处理PCR产物，对变性后的扩增片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，应用银染法染胶，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果即可判定山羊DQA1基因外显子4的等位基因。通过本发明设计的核苷酸引物以及建立的检测体系，可较为准确、快捷的扩增群体中不同等位基因型，可以准确的分析得到山羊DQA1基因外显子4的不同单核苷酸突变位点。
【专利说明】—种检测山羊DQA1基因外显子4的单核苷酸多态性的弓I物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子遗传学领域，涉及山羊分子标记辅助育种技术，具体涉及一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的引物及方法。
【背景技术】
[0002]山羊DQAl基因位于MHC II类基因的DQ亚区，具有丰富的多态性。MHC (主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex),是脊椎动物中一个与免疫相关的多基因家族，具有共显性、连锁不平衡等遗传特性，其主要功能是编码细胞表面的转膜蛋白，通过传递抗原给T淋巴细胞参与调节免疫反应。MHC基因由1、II和III类基因组成。山羊的MHC基因称之为GOLA (Goat lymphocyte antigen),即山羊白细胞抗原。MHC基因多态性赋予动物极大的应变能力，长期自然选择使动物具有应变多变的环境条件及各种病原体的侵袭的能力，若动物具有高的MHC多态性，则能够识别更多的抗原，从而抵抗更多种类的病原体。因此，MHC可以作为抗病育种的遗传标记辅助选择的重要位点，以培育出高产、抗病力强的家畜品种。
[0003]单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。位于编码区的SNPs的错义突变可能对基因的功能有重要的影响，不仅如此，这些SNPs位点多为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。单核苷酸多态性具有数量多，分布广和稳定遗传等特点，是一种进行分子遗传育种的优良手段。现在人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，SSCP它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。该方法具有简单、快速、灵敏，操作简单等优点。但对于像DQAl基因外显子2这种呈高度多态性的基因，基因型的判定成为难点。
[0004]贵州白山羊是贵州省的优良地方山羊品种，具有适应性强、耐粗饲、繁殖力高、育肥性能好、肉质好、板皮质优等特点，宜于在山地丘陵等地势放牧饲养。但国内对于贵州白山羊免疫性状的研究还鲜见报道，所以如何利用分子生物学的技术快速高效的筛选培育出具有较高抗病能力的贵州白山羊成为改良我国优良地方山羊品种的重中之重。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的引物及方法，为不同品种山羊DQAl基因外显子4多态性的PCR-SSCP筛选及判型提供一种方便、快捷、准确的方法，以克服现有技术的不足。
[0006]本发明采用的技术方案:
本发明检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的检测引物，由上游引物和下游引物组成，所述上游引物和下游引物的DNA序列为:
上游引物:5’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’ 下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。
[0007]本发明检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤:以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的上、下游引物进行PCR反应扩增目的片段，用变性剂处理PCR产物，对变性后的扩增片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，应用银染法染胶，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果即可判定山羊DQAl基因外显子4的等位基因。
[0008]更进一步，PCR反应条件为:在15μ L总体系中，2XEs Taq MasterMix为7.5 μ L，上下游引物各为0.75 μ L，DQA模板为2 μ L，余量为ddH20，PCR反应程序为:95°C预变性3min ;95°C变性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 个循环；72°C终延伸 5min，4°C保存。
[0009]上述的变性剂由98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，100 μ L5mol/L EDTA 组成。
[0010]具体的电泳检测步骤为:采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶在250V电压下预电泳30min ;点样后，常温下，250V电泳1min, IlOv电泳16h。
[0011]上述非变性聚丙烯酰胺凝胶由26.6 mL29%的丙烯酰胺_1%N，N-双丙烯酰胺、20mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的过硫酸铵、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 组成。
[0012]本发明有益效果:本发明引物能够特异性的结合到山羊基因组DNA目的片段的模板链上，可以扩增得到含有等位基因突变的目的基因。通过设计的核苷酸引物以及建立的检测体系，可较为准确、快捷的扩增群体中不同等位基因型，可以准确的分析得到山羊DQAl基因外显子4的不同单核苷酸突变位点。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是贵州白山羊DQAl基因第4外显子G+87T位点的PCR-SSCP检测凝胶图；
图2是贵州白山羊DQAl基因第4外显子G+149A位点的PCR-SSCP检测凝胶图；
图3是贵州白山羊DQAl Exon 4- G+87T位点的测序图；
图4是贵州白山羊DQAl Exon 4- G+149A位点的测序图；
其中，附图中标记
1DQAl Exon 4- G+87T
2DQAl Exon 4- G+87G
3DQAl Exon 4- Τ+87Τ
4DQAl Exon 4- G+149G
5DQAl Exon 4- Α+149Α
6DQAl Exon 4- G+149A。
【具体实施方式】
[0014]实施例:
下面结合具体实施方案对本发明的原理和特征进行描述，所举实施方案只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下面以贵州白山羊免疫性状相关基因DQAl基因外显子4的多态性分析为例，对本发明的内容进行详细说明。
[0015]一种贵州白山羊DQAl Exon4等位基因PCR-SSCP检测方法，其主要特点在于，具体的检测步骤如下:
1、样品的采集:采集健康状况好的成年贵州白山羊，抗凝管进行颈静脉采血8mL，冰盒带回实验室后_20°C保存；
2、基因组DNA的提取:应用血液基因组提取试剂盒(上海生工生物)提取基因组DNA；
3、引物设计与PCR反应:总体系为15yL，其中2XEsTaq MasterMix为7.5 μ L，上下游引物各0.75 μ L，DQA模板2 μ L，ddH20补充体积至15 μ L ；PCR反应程序:95°C预变性3min ;95°C变性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 个循环；72°C终延伸 5min，4°C保存。I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
[0016]引物序列为:
上游引物:5 ’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3，
下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’
4PCR产物的SSCP检测:
取8 μ LPCR产物加入10 μ L的上样变性缓冲液，包括98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA (PH=8.0)。98°C变性 15min，立即冰浴 15min ；8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，250V电压下预电泳30min ;点样后，常温下，250V电泳lOmin，IlOv电泳16h，银染法显色并拍照。
[0017](I)电泳使用凝胶配制:8%非变性聚丙烯酰胺凝胶
29%丙烯酰胺-1%N，N-双丙烯酰胺26.6 mL
5X TBE20 mL 10%过硫酸铵 720 μ L ddH20 52.8 mL TEMED 44 μ L
(2)银染方法及步骤
固定液:无水乙醇25 mL
冰乙酸12.5 mL
ddH20200 mL
银染液:硝酸银0.3g
ddH20200 mL
显色液:氢氧化钠3g
甲醛2.2 mL
ddH20200 mL
电泳结束后取下凝胶。用蒸馏水清洗凝胶，倒入固定液，固定10-12min ;用蒸馏水清洗凝胶一次，倒入银染液，避光银染10-12min ;蒸馏水清一次，倒入显色液(现用现配)，摇床显色，待条带清晰后用蒸馏水清洗，拍照保存。
[0018](3)测序分析
这一过程是为了检测获得的结果的可靠性，在实际操作中可凭借带型来区分基因型，无需此过程。
[0019]在非变性聚丙烯酰胺凝胶带型显示如附图所示，将不同基因型的PCR产物送测序公司进行测序。测序结果显示与预期的结果相同。
[0020]以上所述的仅为本发明的较佳实施方案，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的检测引物，由上游引物和下游引物组成，其特征在于:所述上游引物和下游引物的DNA序列为: 上游引物:5’ -AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’ 下游引物:5’ -TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。
2.一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于:包括以下步骤:以山羊基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的上、下游引物进行PCR反应扩增目的片段，用变性剂处理PCR产物，对变性后的扩增片段进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，应用银染法染胶，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果即可判定山羊DQAl基因外显子4的等位基因。
3.如权利要求2所述的一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于:PCR反应条件为:在15 μ L总体系中，2 XEs Taq MasterMix为7.5 μ L，上下游引物各为0.75 μ L，DQA模板为2 μ L，余量为ddH20，PCR反应程序为:95°C预变性3min ；95°C变性 30s,58.5°C退火 30s、72°C延伸 lmin,30 个循环；72°C终延伸 5min，4°C保存。
4.如权利要求2所述的一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于:所述的变性剂由98%去离子甲酰胺，0.025%溴酚蓝，0.025% 二甲苯青，100 μ L 5mol/L EDTA 组成。
5.如权利要求2所述的一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于:电泳检测步骤为:采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶在250V电压下预电泳30min ;点样后，常温下，250V电泳1min, IlOv电泳16h。
6.如权利要求2或5所述的一种检测山羊免疫相关基因DQAl基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于:非变性聚丙烯酰胺凝胶由26.6 mL29%的丙烯酰胺_1%N，N-双丙烯酰胺、20 mL 的 5ΧΤΒΕ、720 μ L10% 的过硫酸铵、52.8 mL 的 ddH20、44 μ L 的 TEMED 组成。
【文档编号】C12N15/11GK104450880SQ201410526748
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】罗卫星, 刘彬, 蔡慧芬, 康建兵, 孙岩岩, 钱成 申请人:贵州大学